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Medicine

Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto

Published: June 7, 2011 doi: 10.3791/2581
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology, Brody School of Medicine, East Carolina University

Summary

Numerosas manipulações genéticas e / ou injeções intramiocárdica de genes, proteínas, células e / ou biomateriais são sobrepostos sobre a dimensão do tempo em estudos de lesão de isquemia / reperfusão aguda e crônica em camundongos remodelação. Este vídeo ilustra os procedimentos de microcirurgia para isquemia / reperfusão, ligadura da artéria coronária permanente, e estudos de injeção intramiocárdica.

Protocol

  1. Instrumentos cirúrgicos estéreis (Tabela 1) e 3 aplicadores "ponta de algodão são colocados em uma underpad estéril. O esterilizador talão (Germinator 500) está ligado.
  2. Camundongos (idade:> 6 semanas; peso:> 18g) são anestesiados com uma injeção ip de 20μl / g de BW tribromoetanol (250mg/kg; duração - cerca de 40 minutos).
  3. Quando os ratos não respondem aos pés pitada, um lubrificante estéril (Lágrimas renovada) é aplicada para os olhos para protegê-los da dessecação e do lado esquerdo do peito é revestido com creme depilatório (por exemplo, Nair) para remover pêlos da pele.
  4. O creme depilatório é lavado com água corrente quente e betadine / álcool swabbing é usado para desinfectar a área cirúrgica.
  5. O mouse é colocado sobre uma almofada deltaphase quente isotérmica que é fixado a uma tabela de plexiglass. Cada membro é imobilizado com fita e uma linha grossa é colocada horizontalmente sob os dentes de cima para segurar a mandíbula superior no lugar.
  6. A tabela é posicionada na vertical e uma luz de fibra ótica é brilhava diretamente sobre a região do pescoço para iluminação transesofágico. Isto exige a colocação precisa de tal forma que a abertura da garganta é visto como um orifício bem iluminado, permitindo assim que a traquéia para ser visualizado para facilitar a inserção do tubo de PE.
  7. O tubo é então conectado ao ventilador (ligado a um 95% O 2 / 5% CO 2) para administrar ventilação com pressão positiva constante (TOPO ventilador; taxa de 125 respirações / min; pressão de pico inspiratório 10-12 cmH 2 O; nota * : As configurações variam de acordo com a tensão e gênero 1-3). Uma vez que a ventilação é confirmado pelos movimentos do tórax síncrona, a conexão é fixada ao bloco com fita para evitar a extubação durante a cirurgia.
  8. Utilizando uma pinça dentada para puxar a pele para cima e longe do peito, uma lâmina de bisturi n º 10 estéril unida a um punho # 3 bisturi é usado para fazer uma incisão 1,5 centímetros na pele paralelamente ao esterno.
  9. Microtesoura Vanna curvas são utilizadas para cortar os músculos peitorais e faça um pequeno furo no músculo intercostal.
  10. Reta, microtesoura blunt são usados ​​para cortar três costelas.
  11. Um espéculo oftalmológico pediátrico 9 milímetros é usada para retrair a caixa torácica.
  12. Usando a pinça curva, puxar o pericárdio longe do coração e usar a pinça dentada gentilmente rasgá-lo aberto.
  13. Usando o porta-agulha Castroviejo, um ponto seis milímetros cônico tópicos 08/03 a agulha de sutura 8-0 polietileno debaixo da descendente anterior esquerda da artéria coronária (ao longo do eixo do coração) perpendicular a ele.
    1. Para uma ligadura temporária que pode ser removido para a reperfusão cronometrados, um pedaço de 0,5 estéril de um centímetro PE90 é colocado sobre o coração em paralelo à artéria coronária. A sutura, que tem sido previamente enrolado sob a artéria coronária, é então ligado à tubulação. No momento em que está para ser lançado, a ligadura está solto. Isto pode ser repetido conforme desejado eo tempo de oclusão / reoclusão podem ser modificados 4. Dependendo da duração do protocolo e do tipo de anestesia utilizada, a suplementação pode ser necessária.
    2. Para uma oclusão permanente, a ligadura atado sob a artéria coronária é simplesmente amarrado. Branqueamento e discinesia são aparentes e no final longo da sutura é cortado 10/05.
    3. Para injeção intramiocárdica (s), uma seringa Hamilton estéril com uma agulha estéril calibre 30 chanfrada é introduzido na base do coração acima da área de lesão no lado direito da ligadura. A agulha é então avançado para a área de lesão e retiradas ligeiramente de modo que o bisel pode ser visto aproximadamente na zona de fronteira. Um pouco da solução na seringa (2-3μl) é injetado no coração e na agulha é mantida no lugar. A seringa é retirado outro 1-3mm eo restante da solução é injetada. A seringa é mantido no lugar até que a bolha que é formado pela solução se dissipa. A agulha é então removido. Se houver algum sangramento, um aplicador com ponta de algodão é suavemente pressionado no local de inserção da agulha até que o sangramento pare 5-7.
  14. Uma vez que as manipulações do miocárdio são completos, os afastadores de costela são removidos ea cavidade torácica é fechada com suturas de colchão usando 2-3 6-0 surgipro.
  15. Dois-três suturas de colchão são feitas então para fechar os músculos peitorais, 1-3 gotas de 0,25% 01:10 marcaína em salina estéril (mouse 0.1ml/25g) é aplicada ao músculo e depois 2-3 suturas de colchão são feitas para fechar a pele.
  16. O mouse é removido do ventilador. Uma vez que a respiração rítmica, rápida e superficial é verificada, o mouse pode ser extubado.
  17. 0,5 ml solução salina estéril morna é injetado no espaço subcutâneo dorsal eo mouse é colocado sobre uma almofada de aquecimento em uma gaiola até que ele recupere a mobilidade (mínimo de 1 hora).
  18. Para experimentos de sobrevivência, os ratos são colocados de volta em suas gaiolas e voltou para o viveiro até o momento do sacrifício. Durante os primeiros dois dias, o alimento é umedecidocolocado no chão da gaiola para facilitar a alimentação (para que eles não têm que chegar até o que pode causar dor) e buprenorfina deve ser administrada a cada 6-12h. Cuidados pós-operatórios também inclui monitoramento diário para a primeira semana para verificar a mobilidade adequada, higiene e hábitos alimentares.
  19. Os instrumentos cirúrgicos são limpos com etanol e inserido no talão de esterilização antes da próxima cirurgia.
  20. No momento do sacrifício, os ratos são anestesiados com pentobarbital sódico (65mg/ml; 55-65 mg / kg). Quando um plano adequado de anestesia é alcançado, a cavidade torácica é aberta.
  21. Enquanto o coração ainda está batendo, uma seringa com uma agulha de calibre 23, contendo cloreto de potássio a frio (KCl, 30 mm) ou 2,3-butanedione monoxime (BDM; 10mM) é usado para perfurar a região posterior basal do ventrículo ea solução é lentamente injetado na câmara até que o coração está preso em diástole.
  22. Uma vez que o coração é removido, uma seringa contendo PBS é usado para lavar retrogradamente perfundir o coração para remover todo o sangue que resta. Aguda para estudos, no final do período de reperfusão, o LAD é re-ligado no ponto original de oclusão. Uma solução contendo 1% de azul de Evan é injetado na aorta. Uma vez que o coração é extraído, é cortado transversalmente em 3 secções de igual espessura, incubados em 1% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio e fotografada para análise morfométrica 11. Para estudos crônica, o coração é então imerso em fixador, então processadas e incluídas de acordo com procedimentos de rotina. Lâminas podem ser coradas histologicamente e fotografada para análise morfométrica (usando Scion, NIH Image J, ou Image Pro Plus) 9,10,12.

Resultados representativos:

Quando feito corretamente, a taxa de sobrevivência em camundongos (masculino: idade 8-10 semanas, 22-28g; feminino: idade 10-12 semanas, 20-26g) são: mais de 90% no infarto agudo de isquemia / reperfusão isquêmica e experimentos pré-condicionamento, sobre 85% em estudos de ligação permanente da artéria, e aproximadamente 80% para injectáveis ​​intramiocárdico. Como a lesão precoce é mais facilmente visível por alterações metabólicas e não estruturais, a determinação do tamanho do infarto em isquemia / reperfusão e isquemia experimentos pré-condicionamento é realizado através da infusão de 1% de corante Evan é azul para a aorta que perfundir o coração que não é fornecido pela LAD ( Figura 1A). Uma vez que o coração é removido e cortados transversalmente ao meio, o tecido é incubado em solução a 1% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio para medir o tamanho do infarto (Figura 1B). As áreas são medidos usando Scion ou NIH software de imagem que pode ser calibrado com um micrômetro fotografada com a mesma ampliação. Esses números são usados ​​para calcular a área em risco / ventrículo esquerdo e infarto do tamanho / área de risco 11. Diferenças tensão pode resultar em variações no peso corporal eo tamanho do coração e por isso deve ser tomado cuidado para normalizar essas medidas ao peso do coração, peso corporal, ou comprimento da tíbia para fins comparativos.

Resultados da artéria permanente ligadura em bruto mudanças estruturais, tais como necrose, parede desbaste, e dilatação das câmaras. Comparação dos efeitos do tratamento e / ou tempo do tamanho do infarto e necrose em relação ao ventrículo esquerdo, área da câmara, parede septal do ventrículo esquerdo e espessura da parede livre no modelo de oclusão definitiva (Figura 2A) também pode ser medida usando Scion ou NIH imagem software. Colágeno com coloração picrosirius red / fast verde (Figura 2B) pode ser usado para medir a fibrose difusas que se correlaciona com os índices funcionais de 8-10 enrijecimento da parede. A imagem na Figura 3 representa a distribuição da solução 6ul (azul de Evan) injetado na zona de fronteira do coração após ligadura da artéria permanente. Note que ele prossegue na direção da lesão, bem como para a base e também transmuralmente.

Figura 1
Figura 1. Evan A. 's Azul injetado na aorta antes da excisão. Esta imagem mostra as regiões perfundidas do coração (manchado) e da área obstruída (sem manchas). Evan B.' s azul e coloração TTC após lesão de isquemia / reperfusão aguda. Esta é uma imagem representativa (20x) mostrando a distribuição de corante azul, que manchou o unoccluded regiões, bem como TTC coloração de tecido metabolicamente viáveis ​​(vermelho). Áreas de necrose não mancham e assim eles permanecem pálidos (esboçado).

Figura 2
Figura 2. A. hematoxilina e eosina. Esta é uma imagem representativa (20x) de coloração H & E de um coração de rato cortados transversalmente através da região do infarto de 4 dias pós-infarto do miocárdio (20x). A * denota necrose tecidual, setas apontam para tecido de granulação, RV = ventrículo direito e LV = ventrículo esquerdo. B. Picrosirius vermelho e verde rápido mancha. Esta é umaimagem representativa (20x) de picrosirius red / coloração verde rápida de uma secção transversal de coração de rato com 4 semanas pós-infarto do miocárdio. O citoplasma verde manchas e fibras de colágeno são vermelhos.

Figura 3
Figura 3. Evan de distribuição de corante azul mancha após injeção intramiocárdica 6ul. Esta é uma imagem representativa mostra a distribuição global e transmural de corante azul de Evan todo o coração após a injeção intramiocárdica 6ul na zona fronteiriça imediatamente após a ligadura da artéria coronária (12x).

Discussion

Doença cardíaca coronária continua a ser um epidemiologicamente e fiscalmente problema de saúde pública. Pesquisa básica considerável ainda é necessária para compreender os mecanismos pelos quais lesão e remodelação proceder e como terapêutica em potencial podem modular estes processos se eles estão a ser desenvolvida para uso clínico. Roedores são mais comumente usados ​​e da ampla gama de camundongos geneticamente modificados disponíveis torna essa espécie um modelo mais atraente.

Embora existam diferenças entre ratos e outras espécies, há muitas vantagens em um modelo murino. Uso de um escopo simples dissecação ou lupa e condições bem iluminado permitir a vasculatura para ser facilmente visto (para anatomia detalhada da vasculatura, ver Salto-Tellez et al., 2004 13). Para reduzir o risco de mortalidade pós-operatória, é muito importante para evitar a ruptura navios de grande porte desde que o volume total de sangue de um rato 25g é inferior a 2 ml 14. No caso de sangramento excessivo ocorre, a aplicação de pressão suave ou cauterização identificar pode ser usado para parar o sangramento.

Este procedimento também pode ser modificado em uma variedade de maneiras. Por exemplo, ratos podem ser anestesiados com isoflurano, ketamina / xilazina ou sódio pentobarbital e seleção apropriada é determinada pela duração do protocolo de 15-18. O reflexo toe pitada é o índice mais utilizado da profundidade da anestesia. Além disso, para melhorar a probabilidade de sobrevivência a longo prazo, alguns investigadores usam medicamentos antiarrítmicos como a lidocaína para reduzir a incidência de arritmias letais 19,20 no entanto, deve-se levar em conta que esta foi recentemente demonstrado ter propriedades anti-apoptótica em uma aguda modelo 21. Além disso, para reduzir a dor pós-operatória, analgésicos, como a buprenorfina pode ser administrada nas primeiras 48 horas após a cirurgia 3,16,17,22,23. Para manter a temperatura corporal durante a cirurgia (especialmente para os protocolos mais), uma sonda retal em série com uma almofada de aquecimento é muitas vezes usado no lugar do pad isotérmica. Para isquemia / reperfusão e / ou isquêmicos pré ou pós-condicionamento: a duração da oclusão (s) e reperfusão (s) podem ser alterados, por oclusão permanente, o tamanho do infarto pode ser modificado por ajustar a localização da ligadura; e para injectáveis ​​intramiocárdica (células por exemplo, proteínas), pode haver locais de injeção e 03/01 o volume por injeção pode ser de até 15 24 mL. Se as células estão a ser injetado, o calibre da agulha utilizada (geralmente 26-30) 5,25,26 deve ser escolhido com base no tamanho das células de modo que o diâmetro interno da agulha é grande o suficiente para evitar sheering. Para evitar confunde devido a processos inflamatório desencadeado pela cirurgia, alguns pesquisadores têm relatado usando um laço que é manipulado ex vivo para ocluir e reperfundi os corações em um rato tórax fechado a qualquer momento após a cirurgia 27-29. Mais recentemente, Gao et al. 30 demonstraram que a oclusão temporária e permanente pode ser realizada sem a necessidade de ventilação e de alguns laboratórios começaram a usar ultra-som para realizar fechado no peito intramiocárdico injeções 25,31.

Desde o primeiro estudo a demonstrar a viabilidade da ligadura da artéria coronária em ratos foi publicado pela Johns e Olson em 1954 32, muitos outros adotaram este modelo e modificou-a para estudar vários aspectos da lesão miocárdica ea remodelação 3,33-45. A natureza de ratos em termos de tamanho, a capacidade reprodutiva, e as despesas comparativamente menos para a compra e manutenção tornam esta espécie uma ferramenta atraente para uma ampla gama de estudos fisiológicos e fisiopatológicos. Como a miniaturização da tecnologia para imagens em avanços vivo 46-49, bem como meios para executar e analisar genômica e proteômica em grande escala, a seleção da droga, a eficácia de terapias baseadas em células e / ou proteínas, bem como biomateriais 50-64, combinado com a gama crescente de manipulações genéticas oferecidas pelo onipresente ou tecidos específicos camundongos transgênicos ou mutante / knockout, o modelo murino de infarto do miocárdio, sem dúvida, continuará a ser uma ferramenta valiosa na avaliação de lesão cardíaca aguda e remodelação a longo prazo. Portanto, há um valor inquestionável em ser capaz de realizar esses experimentos de forma confiável e reprodutível.

Disclosures

Este protocolo foi aprovado por animais e está em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê Use na East Carolina University.

Acknowledgments

Gostaria de agradecer o Departamento de Pesquisa e Pós-Graduação para fornecer fundos para apoiar minha pesquisa e do Departamento de Medicina Comparativa de sua vigilância e assistência. Gostaria também de reconhecer o Departamento de Fisiologia, pelo seu apoio e orientação, bem como a estudantes e técnicos no meu laboratório por sua ajuda. Por último, gostaria de agradecer a meu mentor pós-doutoramento, Dr. Charles E. Murry, pela oportunidade de treinamento durante os quais eu aprendi a microcirurgia mouse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Long Vanna Scissors George Tiemann & Co. 160-159
Micro Dissecting Scissors George Tiemann & Co. 160-161
Forceps – straight, 1x2 teeth George Tiemann & Co. 105-205
Scalpel handle #3 George Tiemann & Co. 105-64 #10 sterile blade
Forceps – half curved serrated George Tiemann & Co. 160-19
Tissue Scissors George Tiemann & Co. 105-410
Castroviejo Needle Holder Miltex Inc. 18-1828
Cook Eye Speculum Miltex Inc. 18-63
Surgipro II 8-0 Suture Express VP-900-X
Prolene 6-0 Suture Express 8776
Germinator 500 Bead Sterilizer Cellpoint Scientific 65369-1
Deltaphase isothermal pad Braintree Scientific, Inc. 39DP
Hamilton syringe - 25μl Hamilton Co 80430
30 gauge beveled needle Hamilton Co 7803-07
Ventilator Kent Scientific TOPO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto
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Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary… More

Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction. J. Vis. Exp. (52), e2581, doi:10.3791/2581 (2011).

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