Summary
आकलन करने के लिए
Abstract
मांसपेशियों 1,2,3 रोग के इलाज के लिए उपचारात्मक उपायों के vivo प्रभाव में आकलन करने के लिए, मात्रात्मक पद्धतियों की जरूरत है कि उपाय बल और इलाज की मांसपेशी में पीढ़ी fatigability. हम हौसले explanted माउस से hindlimb मांसपेशियों में myo यांत्रिक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत दृष्टिकोण का वर्णन. हम माउस extensor digitorum longus मांसपेशियों के atraumatic फसल का वर्णन, एक मांसपेशी पट्टी (820MS मॉडल, डैनिश myo प्रौद्योगिकी) myograph में पेशी बढ़ते, और अधिक से अधिक चिकोटी और धनुस्तंभीय तनाव, संकुचन समय, और आधे विश्राम का समय की माप, एक का उपयोग वर्ग पल्स उत्तेजक औधधि (S48 मॉडल, घास टेक्नोलॉजीज). इन माप का उपयोग करना, हम विशिष्ट चिकोटी और धनुस्तंभीय तनाव मांसपेशी पार के अनुभागीय, चिकोटी धनुस्तंभीय तनाव अनुपात, रिश्ते बल आवृत्ति वक्र और कम आवृत्ति थकान वक्र 4 क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत की गणना प्रदर्शित करता है. इस विश्लेषण मांसपेशियों 1,2,3,5 रोग के माउस मॉडल में उपचारात्मक उपायों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मांसपेशी समारोह 6,7,8,9 पर आनुवंशिक संशोधन के प्रभाव की तुलना के बीच मात्रात्मक तुलना के लिए एक तरीका प्रदान करता है .
Protocol
प्रोटोकॉल UCSF संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया है.
1. माउस extensor Digitorum (EDL) Longus स्नायु के विच्छेदन
- संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार सभी जानवर प्रक्रियाओं का प्रदर्शन.
- 200 मिलीग्राम / किग्रा intraperitoneal / pentobarbital ग्रीवा अव्यवस्था सिर्फ मांसपेशियों फसल 10 के लिए पूर्व के साथ पशु euthanize . विच्छेदन को अच्छी तरह से हो तो अभ्यास किया जाना चाहिए कि मांसपेशियों और काटा जा सकता है इच्छामृत्यु के 15 मिनट के भीतर तनाव transducer में घुड़सवार.
- विच्छेदन ट्रे और पिन ट्रे के लिए पैर पर लोथ लापरवाह व्यवस्थित.
- टखने से विच्छेदन माइक्रोस्कोप, खुला त्वचा, ध्यान से खुला प्रावरणी (Fig.1A), और छील tibialis तहत EDL (Fig.1B) बेनकाब ऊपर है . Lactated है घंटी समाधान की बूंदों का उपयोग करने के लिए मांसपेशियों नम और फसल के दौरान बफर रखने.
- EDL निकालें, प्रत्येक के अंत पर संभव के रूप में ज्यादा कण्डरा के रूप में संरक्षण, और lactated है घंटी समाधान युक्त एक पेट्री डिश में डाल दिया. मांसपेशियों, tendons (Fig.1C) में से प्रत्येक के लिए सिवनी बाँधो . यह आवश्यक है कि मांसपेशी फाइबर को छुआ हो या नहीं विच्छेदन के दौरान परेशान.
2. बलवान पट्टी Myograph में माउस EDL के बढ़ते
- इन अध्ययनों के लिए, एक ऊतक स्नान की जरूरत है कि मांसपेशियों secures जबकि यह शारीरिक समाधान में लगातार तापमान पर निरंतर oxygenation के साथ स्नान करने के लिए अनुमति है. स्नान मांसपेशियों में तनाव की माप के लिए एक बल transducer के साथ मिलकर है. हम इस उद्देश्य के लिए एक एकीकृत मांसपेशियों पट्टी डैनिश myo प्रौद्योगिकी (DMT 820MS मॉडल) से myograph स्नान रोजगार. इसके अलावा, एक वर्ग पल्स बिजली (घास S48 मॉडल) उत्तेजक औधधि और डाटा अधिग्रहण मंच (ADInstruments PowerLab डाटा अधिग्रहण प्रणाली और LabChart सॉफ्टवेयर) के लिए बटोर, रिकॉर्ड और myo यांत्रिक प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण, क्रमशः की जरूरत है. DMT 820MS प्लैटिनम इलेक्ट्रोड है कि मांसपेशियों के दोनों तरफ मांसपेशी पट्टी के मध्य भाग में तैनात हैं, चैम्बर कवर में एकीकृत है. अन्य myographs इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट के लिए विशेष ध्यान देने की आवश्यकता हो सकती है.
- 5 एमएल क्रेब्स Henseleit 11 समाधान के साथ myograph स्नान भरें . 25 डिग्री सेल्सियस तक गर्म बुलबुला 2 हे / सीओ 2 (95% / 5%) 15 उपयोग करने के लिए पहले मिनट के लिए स्नान के माध्यम से.
- Sutures के उपयोग myograph के clamps के बीच EDL विस्तार और clamps के बीच EDL मांसपेशियों, tendons (Fig.1D ई) सुरक्षित. मांसपेशियों में ही नहीं दबाना करने के लिए सावधान रहें.
- पर 25 myograph स्नान बनाए रखें ° सी.
3. Myo-यांत्रिक विश्लेषण
ए चिकोटी तनाव
- स्नान में प्रारंभिक लंबाई सेट इतना है कि वहाँ कोई मांसपेशियों की ढिलाई है.
- क्रम में चिकोटी तनाव प्राप्त करने के लिए अधिक से अधिक वोल्टेज समायोजन करके अधिक से अधिक प्रोत्साहन (अवधि 0.5 एमएस) निर्धारित करते हैं, तो अधिक से अधिक ऊपर 20% (supramaximal उत्तेजना को प्राप्त करने के) में उत्तेजना सेट. हमारे अध्ययन में, supramaximal उत्तेजना आमतौर पर 40 वोल्ट की एक उत्पादन में हासिल की है.
- उत्तेजक औधधि से एक आस्टसीलस्कप का उपयोग उत्पादन में सत्यापित करें.
- धीरे - धीरे मांसपेशी खींच जब तक वहाँ चिकोटी तनाव में आगे कोई वृद्धि हुई है इष्टतम लंबाई निर्धारित.
- मांसपेशी 3 मिनट के लिए संतुलित करने की अनुमति दें.
- Supramaximal इष्टतम घास S44 इलेक्ट्रॉनिक उत्तेजक औधधि का उपयोग लंबाई में वर्ग (0.5 एमएस) उत्तेजना, और रिकॉर्ड उत्पादन उद्धार.
- रिकॉर्ड: चिकोटी तनाव वक्र (पी टी बनाम समय; Fig.2A).
बी तनाव टेटनस
- मांसपेशी 3 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दें.
- 300msec के लिए supramaximal उत्तेजनाओं के एक इष्टतम घास S44 इलेक्ट्रॉनिक उत्तेजक औधधि का उपयोग लंबाई में 150 हर्ट्ज पर, ट्रेन और रिकॉर्ड उत्पादन लागू करें.
- रिकॉर्ड: टिटनेस तनाव वक्र (पी ओ बनाम समय; Fig.2B).
सी. सेना - आवृत्ति
- मांसपेशी 3 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दें.
- सेना आवृत्ति: 3 मिनट प्रत्येक प्रोत्साहन (Fig.3) के बीच आराम के साथ 30, 60, 100, 140, और 160 हर्ट्ज पर supramaximal उत्तेजनाओं की गाड़ियों लागू. वैकल्पिक रूप से, गाड़ियों 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140, और बेहतर समाधान के लिए कम आवृत्तियों पर 160 हर्ट्ज, जहां बल परिवर्तन काफी हद तक लागू किया जा सकता है.
- प्लॉट: रिश्ते बल आवृत्ति (% अधिक से अधिक बल बनाम उत्तेजना आवृत्ति).
डी. थकान
- 300 एमएस (या आवृत्ति शिखर बल के 50% का उत्पादन करने के लिए समायोजित), 10 मिनट के लिए हर 3 सेकंड के लिए 60 हर्ट्ज: कम tetani की ट्रेन लागू करें. 10 मिनट तक, धनुस्तंभीय बल ~ प्रारंभिक मूल्य (Fig.4) के 15% के एक पठार के स्तर में गिरावट चाहिए .
- प्लॉट: कम आवृत्ति थकान (% अधिक से अधिक बल बनाम समय).
ई. प्रोटोकॉल के अंत में अतिरिक्त डेटा संग्रह
- Myograph से मांसपेशियों unmounting पहले, MUSC सेटइष्टतम लंबाई पर ले III.A.4 कदम के रूप में निर्धारित है और इसके व्यास को मापने माइक्रोस्कोप या नली का व्यास के साथ या तो एक आंख का उपयोग कर. पार के अनुभागीय क्षेत्र (2 सुक्ष्ममापी) की गणना.
- उपाय sutures हटाने और मांसपेशियों वजन द्वारा मांसपेशियों (एमजी).
- माउस का वजन शरीर द्रव्यमान (ग्राम) का आकलन है.
4. गणना
- बलवान: शरीर द्रव्यमान अनुपात =
मांसपेशियों / शरीर द्रव्यमान - चिकोटी तनाव, पी टी (MN) =
अधिकतम चिकोटी के दौरान उत्पन्न तनाव - विशिष्ट चिकोटी टेंशन (एन / 2 सेमी) =
चिकोटी टेंशन (MN) / पार के अनुभागीय क्षेत्र (2 सुक्ष्ममापी) x 10 5 N / MN • सुक्ष्ममापी 2 / 2 सेमी - पीक तनाव के समय (ms) =
संकुचन की शुरुआत से अधिक से अधिक तनाव करने के लिए समय - आधा विश्राम का समय (ms) =
चोटी के तनाव से चोटी तनाव का 50% करने के लिए समय - धनुस्तंभीय तनाव, पी एंड ओ (MN) =
अधिकतम टिटनेस के दौरान उत्पन्न तनाव - विशिष्ट धनुस्तंभीय टेंशन (एन / 2 सेमी) =
धनुस्तंभीय टेंशन (MN) / पार के अनुभागीय क्षेत्र (2 सुक्ष्ममापी) x 10 5 N / MN • सुक्ष्ममापी 2 / 2 सेमी - टिटनेस के उदय के अधिकतमबिटरेट दर (एन / एस) =
टिटनेस, यानी, धनुस्तंभीय तनाव वक्र (या, डी पी ओ / dt) की अधिकतम ढलान में तनाव वृद्धि के दौरान तनाव में वृद्धि की अधिकतम दर - आधा विश्राम धनुस्तंभीय टेंशन (ms) =
उत्तेजना की समाप्ति से उत्तेजना की समाप्ति पर तनाव का 50% करने के लिए समय - चिकोटी तनाव धनुस्तंभीय तनाव अनुपात, पी / टी पी ओ =
अधिकतम चिकोटी धनुस्तंभीय / तनाव अधिकतम तनाव - थकान सूचकांक =
isometric तनाव के लिए अधिक से अधिक दो मिनट कम आवृत्ति थकान के बाद तनाव के अनुपात
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. EDL मांसपेशियों के विच्छेदन. Hindlimb muscles.TA, tibialis पूर्वकाल बी. EDL मांसपेशियों (extensor digitorum longus) के एक्सपोजर की एक एक्सपोजर, सी, sutures के EDL, tendons करने के लिए अनुलग्नक. डी, तनाव transducer स्नान की ओर से (देखें). ई, EDL स्नान में मुहिम शुरू की (ऊपर से देखने). में पेशी अधूरे निदर्शी प्रयोजनों के लिए बफर में डूबे, व्यवहार में, मांसपेशियों को पूरी तरह से बाहर सुखाने से रोकने के डूब चाहिए.
चित्रा 2. तनाव घटता का उदाहरण. चिकोटी तनाव अधिक से अधिक चिकोटी तनाव (पी टी), संकुचन समय (सीटी) और आधे विश्राम का समय (एचआरटी) illustrating वक्र के एक उदाहरण के लिए, बार, 1s बी. धनुस्तंभीय तनाव अधिक से अधिक धनुस्तंभीय तनाव दिखा वक्र (पी ओ) का उदाहरण और आधा विश्राम धनुस्तंभीय टेंशन (HRTT). बार, 1s.
चित्रा 3. बल आवृत्ति संबंध विश्लेषण के उदाहरण. ए, वृद्धिशील उत्तेजना आवृत्तियों द्वारा उत्पन्न तनाव बी, 30MHz में पल्स ट्रेन का उदाहरण. शराबख़ाना, 80ms सी, 140MHz पर पल्स ट्रेन का उदाहरण है . बार, 80ms डी, एक में दिखाए गए डेटा से प्राप्त बल आवृत्ति वक्र का उदाहरण है. बल आवृत्ति वक्र के आकार मांसपेशियों की शक्ति की विशेषता है, और विभिन्न जानवरों से मांसपेशियों के बीच तुलना की जा सकती है.
चित्रा 4. कम आवृत्ति थकान विश्लेषण के उदाहरण. एक, Decremental कम आवृत्ति संकेत समय अंक (बी, सी, डी) में पल्स गाड़ियों के stimulation.Examples की अवधि में उत्पन्न तनावों के नीचे दिखाया गया हैं ई, कम आवृत्ति थकान एक में दिखाए गए डेटा से व्युत्पन्न वक्र का उदाहरण है. कम आवृत्ति थकान वक्र के आकार मांसपेशियों की शक्ति की विशेषता है, और विभिन्न जानवरों से मांसपेशियों के बीच तुलना की जा सकती है.
Discussion
हम explanted माउस से hindlimb मांसपेशी में myo यांत्रिक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत दृष्टिकोण का वर्णन. EDL, जबकि अधिक करने के लिए अपनी tibialis पूर्वकाल मांसपेशी पीछे पीछे स्थिति की वजह से काटना मुश्किल है, क्योंकि इसके प्रमुख नसदार संलग्नक tibialis टखने और घुटने के जोड़ों के लिए पूर्वकाल से मूल्यांकन करने के लिए आसान है. इन tendons मांसपेशियों पट्टी myograph में बढ़ते की सुविधा. इसके विपरीत, अधिक आसानी से पहुँचा tibialis पूर्वकाल संयुक्त घुटने पर एक व्यापक, लगभग atendinous लगाव है, यह असाधारण मुश्किल मांसपेशियों समझौता किए बिना दोनों टुकड़े करना करने के लिए, और myograph में सुरक्षित माउंट बना. हम भी बाहर बिंदु है कि तेजी से शारीरिक बफर और तापमान में एक oxygenated स्नान में पेशी बढ़ते मांसपेशियों के यांत्रिक गुणों के संरक्षण के लिए आवश्यक है. हमने पाया है कि हम 30 मिनट के लिए मांसपेशियों के जवाब में महत्वपूर्ण बदलाव के बिना इन शर्तों के तहत इस विश्लेषण को दोहरा सकते हैं. अंत में, यह आवश्यक है कि मांसपेशी फाइबर विच्छेदन और बढ़ते प्रक्रियाओं के दौरान छुआ तक नहीं हो सकता है, के रूप में इस मांसपेशी समारोह पर प्रतिकूल प्रभाव है, और myo यांत्रिक बल के मूल्यवान समझना में परिणाम कर सकते हैं. इन प्रक्रियाओं का पालन करके, इस विश्लेषण मांसपेशी समारोह 6,7,8,9 पर आनुवंशिक संशोधन के प्रभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मांसपेशियों 1,2,3,5 रोग के माउस मॉडल में उपचारात्मक उपायों के बीच तुलना का मूल्यांकन एक मजबूत मात्रात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है .
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एक सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा NHLBI से PEO (HL086513) अनुदान, और पुनर्योजी (RC1 00,104) चिकित्सा, एक सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा NHLBI से अनुदान (HL085377) के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट से एक व्यापक अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और एक उपहार Pollin फाउंडेशन से HSB
अनुसूचित जाति पुनर्योजी चिकित्सा पुल के लिए कैलिफोर्निया संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था करने के लिए स्टेम सेल अनुसंधान सैन फ्रांसिस्को स्टेट यूनिवर्सिटी के लिए पुरस्कार (TB1 01,194).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 silk sutures | Oasis | MV682 | General surgery |
| Dupont #5 forceps | WPI | 500233 | General surgery |
| Hemostat, straight | WPI | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | WPI | 15914 | General surgery |
| Lab Chart software | ADInstruments | Version 7 | Data analysis |
| Muscle Strip Myograph | DMT | 820MS | Tension transduction |
| Operating scissors | WPI | 501754 | General surgery |
| Oscilloscope | EZ | OS-5020 | Tension stimulation |
| Pentobarbital, sodium salt | Sigma | P3761 | Euthanasia |
| PowerLab | ADInstruments | 8/30 | Data acquisition |
| Square Pulse Stimulator | Grass Tech. | S48 | Tension stimulation |
| Vannas spring scissors | WPI | 14003 | General surgery |
Solutions and Media |
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Lactated Ringer's solution |
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Krebs Henseleit solution |
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Pentobarbital |
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References
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