Summary
Per valutare l'
Abstract
Per valutare gli effetti in vivo degli interventi terapeutici per il trattamento della malattia muscolare 1,2,3, sono necessari metodi quantitativi che misurano costituzione della forza e affaticamento nei muscoli trattati. Descriviamo un approccio dettagliato per valutare myo-meccaniche in appena espiantato muscolare degli arti posteriori dal mouse. Descriviamo la raccolta atraumatica di longus topo muscolo estensore comune delle dita, il montaggio del muscolo in un muscolo striscia miografo (Modello 820MS; danese Tecnologia Myo), e la misurazione della contrazione massima e tensione tetanica, tempo di contrazione e rilassamento a metà tempo, utilizzando un piazza impulso stimolatore (modello S48; Technologies Grass). Utilizzando queste misure, dimostriamo il calcolo di specifici contrazione e la tensione muscolare tetanica normalizzata a sezione trasversale, il tic-to-tetanica rapporto di tensione, la forza-frequenza curva di relazione e la bassa curva di fatica frequenza 4. Questa analisi fornisce un metodo per il confronto quantitativo tra interventi terapeutici in modelli murini di malattia muscolare 1,2,3,5, così come il confronto degli effetti delle modificazioni genetiche sulla funzione muscolare 6,7,8,9.
Protocol
Il protocollo è eseguita con l'approvazione del Institutional Animal Care UCSF e Comitato uso (IACUC).
1. Dissezione del mouse Longus estensore delle dita (EDL) muscolare
- Eseguire tutte le procedure animali in conformità con le linee guida istituzionali.
- Eutanasia animale con 200 mg / kg intraperitoneale pentobarbital / cervicale dislocazione appena prima del raccolto del muscolo 10. La dissezione deve essere ben praticata in modo che il muscolo può essere raccolto e montato nel trasduttore di tensione entro 15 minuti di eutanasia.
- Disporre in posizione supina carcassa sul vassoio dissezione e la gamba pin vassoio.
- Sotto tibiale microscopio dissezione, la pelle aperto, fascia aprire con cautela (Fig.1a), e la buccia dalla caviglia verso l'alto per esporre EDL (Fig.1B). Utilizzare gocce di soluzione di Ringer lattato per mantenere il muscolo umido e tamponata durante la vendemmia.
- Rimuovere EDL, conservando il tendine il più possibile su ogni estremità, e messo in una capsula di Petri contenente soluzione di Ringer lattato. Tie sutura a ciascuno dei tendini dei muscoli (Fig.1C). E 'essenziale che le fibre muscolari non essere toccato o disturbato durante la dissezione.
2. Montaggio del EDL Mouse nel miografo Striscia muscolare
- Per questi studi, un bagno di tessuto è necessario che mantiene i muscoli consentendone al contempo fare il bagno in soluzione fisiologica a temperatura costante con l'ossigenazione continuo. Il bagno è accoppiato con un trasduttore di forza per la misura della tensione muscolare. Ci avvaliamo di un sistema integrato di fascia muscolare bagno miografo dal danese Myo Technology (DMT modello 820MS) per questo scopo. Inoltre, uno stimolatore elettrico impulso quadrato (Grass modello S48) e la piattaforma di acquisizione dati (ADInstruments PowerLab sistema di acquisizione dati e software LabChart) sono necessari per sollecitare, registrare e analizzare mio-meccanico risposte, rispettivamente. Il 820MS DMT ha elettrodi di platino integrato nel coperchio della camera che sono posizionati su entrambi i lati del muscolo, a metà porzione della striscia muscolare. Myographs altri possono richiedere una specifica attenzione al posizionamento degli elettrodi.
- Riempi bagno miografo con 5 mL di soluzione Krebs Henseleit 11. Calda a 25 ° C. Bubble O 2 / CO 2 (95% / 5%) attraverso il bagno per 15 minuti prima dell'uso.
- Utilizzare punti di sutura per estendere EDL tra i morsetti di miografo e sicuro i tendini del muscolo EDL (Fig.1D, E) tra i morsetti. Fare attenzione a non bloccare il muscolo stesso.
- Mantenere miografo bagno a 25 ° C.
3. Myo-meccanico Analisi
A. Twitch tensione
- Imposta lunghezza iniziale nel bagno in modo che non ci sia lassismo muscolare.
- Determinare stimolo massima (durata 0,5 ms) regolando tensione al fine di ottenere la tensione massima contrazione, quindi impostare stimolo al 20% al di sopra massima (per raggiungere stimolo sovramassimale). Nei nostri studi, lo stimolo sovramassimale di solito è raggiunta a una potenza di 40 volt.
- Verificare uscita dallo stimolatore con un oscilloscopio.
- Stabilire la lunghezza ottimale gradualmente il muscolo che si estende fino a quando non vi è ulteriore aumento della tensione contrazione.
- Lasciare muscolo equilibrare per 3 min.
- Fornire sovramassimale stimolo quadrati (0,5 ms) a lunghezza ottimale utilizzando Erba S44 stimolatore elettronico, e l'uscita record.
- Record: la tensione della curva contrazione (P vs tempo t; Fig.2a).
Tetano B. tensione
- Lasciare muscolare a riposo per 3 minuti.
- Applicare un treno di stimoli sovramassimale per 300msec a 150 Hz a lunghezza ottimale utilizzando Erba S44 stimolatore elettronico, e l'uscita record.
- Record: la tensione della curva tetano (P o vs tempo; Fig.2b).
C. Forza frequenza
- Lasciare muscolare a riposo per 3 minuti.
- Forza-frequenza: applicare i treni di stimoli sovramassimale a 30, 60, 100, 140 e 160 Hz con 3 minuti di riposo tra ogni stimolo (Fig.3). In alternativa, i treni possono essere applicati 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 e 160 Hz per una migliore risoluzione a frequenze più basse, dove i cambiamenti forza in modo sostanziale.
- Trama: forza-frequenza di rapporti (% vs frequenza massima forza di stimolazione).
D. fatica
- Applicare treno di brevi tetani: 60 Hz per 300 ms (o la frequenza regolare di produrre il 50% della forza di picco), ogni 3 secondi per 10 minuti. Da 10 minuti, la forza tetanica dovrebbe ridursi ad un livello di plateau di circa il 15% del valore iniziale (Fig. 4).
- Trama: fatica a bassa frequenza (% massima rispetto al tempo vigenti).
E. la raccolta di dati aggiuntivi alla fine del protocollo
- Prima di smontare il muscolo dal miografo, impostare il muscle in lunghezza ottimale, come determinato al punto III.A.4 e misurare il suo diametro utilizzando un oculare del microscopio o con le pinze. Calcolare sezione trasversale (micron 2).
- Misurare la massa muscolare (mg) togliendo punti di sutura e un peso muscolare.
- Pesare mouse per valutare la massa corporea (gm).
4. Calcoli
- Muscolare: massa rapporto corpo =
massa muscolare / massa corporea - Twitch tensione, P t (mN) =
massima tensione generati durante la contrazione - Contrazione tensione specifica (N / cm 2) =
contrazione tensione (mN) / sezione trasversale (micron 2) x 10 5 N / mN • micron 2 / cm 2 - Tempo per la tensione di picco (ms) =
tempo dalla comparsa della contrazione di massima tensione - A metà tempo di rilassamento (ms) =
tempo dalla tensione di picco al 50% della tensione di picco - Tetanica tensione, P O (mn) =
massima tensione generati durante il tetano - Specifica tensione tetanica (N / cm 2) =
tetanica tensione (mN) / sezione trasversale (micron 2) x 10 5 N / mN • micron 2 / cm 2 - Tasso massimo di aumento del tetano (N / s) =
tasso massimo di aumento della tensione durante l'ascesa tensione nel tetano, vale a dire la massima pendenza della curva di tensione tetanica (o, O dP / dt) - Mezza rilassamento della tensione tetanica (ms) =
tempo dalla cessazione della stimolazione al 50% della tensione al termine della stimolazione - Twitch tensione-to-tetanica rapporto di tensione, P t / P O =
contrazione massima tensione / massima tensione tetanica - Indice di stanchezza =
rapporto di tensione dopo due minuti di fatica a bassa frequenza per raggiungere la massima tensione isometrica
5. Rappresentante Risultati
Figura 1. Dissezione del muscolo EDL. A, esposizione di arti posteriori muscles.TA, tibiale anteriore. B, esposizione di EDL (dell'estensore lungo delle dita) del muscolo. C, allegato di suture di tendini EDL. D, trasduttore bagno Tensione (vista dal lato). E, EDL montato in bagno (vista dall'alto). Il muscolo in modo incompleto immerso nel buffer a scopo illustrativo, in pratica, il muscolo deve essere completamente immerso per evitare che si secchi.
Figura 2. Esempio di curve di tensione. A, Esempio di curva di contrazione tensione illustrando tensione massima contrazione (P t), tempo di contrazione (CT) e metà tempo di rilassamento (HRT). Bar, 1s. B, Esempio di curva tensione tetanica mostrando massima tensione tetanica (P o) e mezzo di rilassamento della tensione tetanica (HRTT). Bar, 1s.
Figura 3. Esempio di forza-frequenza analisi della relazione. A, le tensioni generate da frequenze di stimolazione incrementale. B, Esempio di treno di impulsi a 30MHz. Bar, 80ms. C, Esempio di treno di impulsi a 140 MHz. Bar, 80ms. D, Esempio di forza-frequenza curva derivata da dati riportati in A. La forma della curva forza-frequenza è caratteristica della forza muscolare, e possono essere confrontati tra i muscoli di animali diversi.
Figura 4. Esempio di analisi a bassa frequenza fatica. A, le tensioni decrementale generato oltre stimulation.Examples periodo di bassa frequenza dei treni di impulsi a intervalli di tempo indicato (B, C, D) sono riportati di seguito. E, Esempio di curva a bassa frequenza stanchezza derivata da dati riportati in A. La forma della curva di fatica a bassa frequenza è caratteristica della forza muscolare, e possono essere confrontati tra i muscoli di animali diversi.
Discussion
Descriviamo un approccio dettagliato per valutare myo-meccaniche in espiantati muscolare degli arti posteriori dal mouse. L'EDL, mentre più difficile da analizzare a causa della sua posizione posteriore dietro il muscolo tibiale anteriore, è più facile da valutare rispetto al tibiale anteriore a causa della sua allegati importanti tendinea alla caviglia e le articolazioni del ginocchio. Questi tendini facilitare il montaggio nel miografo fascia muscolare. Al contrario, tanto più facilmente accessibili tibiale anteriore ha un ampio, l'attaccamento quasi atendinous al ginocchio, rendendo estremamente difficile sezionare entrambi senza compromettere il muscolo, e montare in modo sicuro nel miografo. Abbiamo, inoltre, che in rapida crescita il muscolo in un bagno ossigenato in un tampone fisiologico e la temperatura è essenziale per preservare le proprietà meccaniche del muscolo. Abbiamo scoperto che possiamo ripetere questa analisi per un massimo di 30 minuti senza significativi cambiamenti nella risposta muscolare in queste condizioni. Infine, è essenziale che le fibre muscolari non essere toccato durante la dissezione e le procedure di montaggio, in quanto ciò può avere effetti negativi sulla funzione muscolare e portare a una sottostima del mio-meccanico forza. Seguendo queste procedure, questa analisi fornisce un approccio robusto quantitativo di valutare gli effetti delle modificazioni genetiche sulla funzione muscolare 6,7,8,9, così come il confronto tra interventi terapeutici in modelli murini di malattia muscolare 1,2,3,5 .
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un Pubblico Servizio Sanitario Grant (HL086513) dal NHLBI a PEO, e un assegno di ricerca completa del California Institute per la medicina rigenerativa (RC1-00104), un Pubblico Servizio Sanitario Grant (HL085377) da NHLBI, e un regalo dalla Fondazione Pollin di HSB
SC è stato sostenuto da un Istituto della California per Ponti Medicina Rigenerativa di cellule staminali Research Award (TB1-01194) a San Francisco State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 silk sutures | Oasis | MV682 | General surgery |
| Dupont #5 forceps | WPI | 500233 | General surgery |
| Hemostat, straight | WPI | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | WPI | 15914 | General surgery |
| Lab Chart software | ADInstruments | Version 7 | Data analysis |
| Muscle Strip Myograph | DMT | 820MS | Tension transduction |
| Operating scissors | WPI | 501754 | General surgery |
| Oscilloscope | EZ | OS-5020 | Tension stimulation |
| Pentobarbital, sodium salt | Sigma | P3761 | Euthanasia |
| PowerLab | ADInstruments | 8/30 | Data acquisition |
| Square Pulse Stimulator | Grass Tech. | S48 | Tension stimulation |
| Vannas spring scissors | WPI | 14003 | General surgery |
Solutions and Media |
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Lactated Ringer's solution |
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Krebs Henseleit solution |
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Pentobarbital |
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References
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).
- Messina, S. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).
- Danieli-Betto, D. Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue. Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).
- MacIntosh, B. R., Willis, J. C. Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).
- Hayes, A., Williams, D. A. Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming. J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).
- Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).
- Danieli-Betto, D. Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).
- Chan, S. A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).
- Personius, K. E. Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice. J Appl. , Forthcoming (2010).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).
- Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II. Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).
