Summary
För att bedöma
Abstract
För att bedöma in vivo effekter av terapeutiska ingrepp för behandling av muskelsjukdom 1,2,3, är kvantitativa metoder behövs som mäter krafter generation och fatigability hos behandlade muskeln. Vi beskriver en detaljerad strategi för att bedöma myo-mekaniska egenskaperna i färsk explanterade bakdelen muskel från musen. Vi beskriver atraumatisk skörden av musen extensor digitorum longus muskler, montering muskeln i en muskel band myograph (Modell 820MS, danska Myo Technology), och mätning av maximal rycka och tetanic spänning, kontraktion tid och halv-relaxationstiden, med hjälp av en fyrkantig puls stimulator (Modell S48, Gräs Technologies). Med hjälp av dessa mätningar, visar vi beräkning av specifika rycka och tetanic spänningar normaliseras till muskel tvärsnittsarea, den rycka till tetanic spänning förhållande, kraft-frekvens relation kurvan och låg frekvens trötthet kurva 4. Denna analys ger en metod för kvantitativa jämförelser mellan terapeutiska ingrepp i musmodeller av muskelsjukdom 1,2,3,5, samt jämförelse av effekterna av genetisk modifiering på muskelfunktionen 6,7,8,9.
Protocol
Protokollet sker med godkännande av UCSF institutionella Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Dissekering av Mouse extensor digitorum longus (EDL) Muscle
- Utför alla animaliska förfaranden i enlighet med de institutionella riktlinjer.
- Euthanize djuret med 200 mg / kg ip pentobarbital / halsdislokation strax före muskel skörd 10. Den dissektion bör vara väl praktiseras så att muskeln kan skördas och monteras i spänningen givaren inom 15 minuter dödshjälp.
- Ordna kadaver liggande på dissekering bricka och PIN-ben till facket.
- Enligt dissektion mikroskop, öppen hud, öppna försiktigt fascian (Fig.1A), och skal tibialis från vristen och uppåt för att exponera EDL (Fig.1B). Användning droppar Ringerlaktat lösning för att hålla muskler fuktig och buffrade under skörden.
- Ta bort EDL, bevara så mycket senor som möjligt på varje ände, och sattes i en petriskål med Ringerlaktatlösning lösning. Knyt sutur vardera till muskeln senor (Fig.1C). Det är viktigt att muskelfibrerna inte vidröras eller störd under dissekering.
2. Montering av Mouse EDL i muskeln Strip Myograph
- För dessa studier är en vävnad bad behövs som håller muskeln samtidigt gör det möjligt att bada i fysiologisk lösning vid konstant temperatur med kontinuerlig syresättning. Badet är tillsammans med en kraftgivare för mätning av muskelspänningar. Vi använder en integrerad muskel bad band myograph från danska Myo Technology (DMT modell 820MS) för detta ändamål. Dessutom är en fyrkantig puls elektrisk stimulator (Grass modell S48) och datainsamling plattform (ADInstruments PowerLab datainsamlingssystem och LabChart mjukvara) som behövs för att framkalla, registrera och analysera myo-mekaniska lösningar, respektive. DMT 820MS har platina elektroder integrerade i locket som är placerade på vardera sidan av muskeln, i mitten delen av muskeln remsan. Andra myographs kan kräva särskild uppmärksamhet elektrodplacering.
- Fyll myograph bad med 5 ml Krebs Henseleit lösning 11. Varm till 25 ° C. Bubble O 2 / CO 2 (95% / 5%) genom bad i 15 minuter före användning.
- Använd suturer att utöka EDL mellan klämmor myograph och säkra senor av EDL muskeln (Fig.1D, E) mellan klämmorna. Var noga med att inte klämma muskeln själv.
- Behåll myograph bad vid 25 ° C.
3. Myo-mekanisk analys
A. Twitch spänning
- Ställ in ursprungliga längden i badet så att det inte finns någon muskel slapphet.
- Bestäm maximal stimulans (duration 0,5 ms) genom att justera spänningen för att få maximal rycka spänning, som sedan stimulansen till 20% över maximal (för att uppnå supramaximal stimulus). I våra studier är supramaximal stimulans brukar uppnås vid en effekt på 40 volt.
- Kontrollera utsignalen från stimulatorn med ett oscilloskop.
- Bestäm optimal längd genom att gradvis sträcka muskeln tills ingen ytterligare ökning rycka spänningen.
- Låt muskeln att jämvikta i 3 min.
- Leverera supramaximal torget stimulus (0,5 ms) vid optimal längd med Grass S44 elektronisk stimulator, och spela ut.
- Rekord: rycka spänning kurvan (P t vs tid, Fig.2A).
B. Stelkramp spänning
- Låt musklerna vila i 3 minuter.
- Applicera ett tåg av supramaximal stimuli för 300msec vid 150 Hz vid optimal längd med Grass S44 elektronisk stimulator, och spela ut.
- Rekord: stelkramp spänning kurvan (P o vs tid, Fig.2B).
C. Force-frekvens
- Låt musklerna vila i 3 minuter.
- Force-frekvens: gäller tåg av supramaximal stimuli vid 30, 60, 100, 140 och 160 Hz med 3 minuters vila mellan varje stimulus (Fig. 3). Alternativt kan tågen tillämpas 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 och 160 Hz för bättre upplösning vid låga frekvenser, där kraft ändras avsevärt.
- Plot: Force-frekvens relation (% maximal kraft vs stimulans frekvens).
D. Trötthet
- Applicera tåg av korta tetani: 60 Hz för 300 ms (eller frekvens justeras för att producera 50% av topp kraft), var 3 sekunder i 10 minuter. Med 10 minuter bör tetanic tvinga minska till en platå nivå på ~ 15% av det ursprungliga värdet (Fig. 4).
- Plot: lågfrekventa trötthet (% maximal kraft vs tid).
E. Ytterligare insamling av data i slutet av protokollet
- Innan lossa muskeln från myograph, ställ muscle vid optimal längd som bestäms i steg III.A.4 och mäta dess diameter med hjälp av antingen en okulär på mikroskop eller med bromsok. Beräkna tvärsnittsarean (ìm 2).
- Mät muskelmassa (mg) genom att ta bort suturer och väger muskler.
- Väg musen för att bedöma kroppsmassa (GM).
4. Beräkningar
- Muscle: kroppsmassa ratio =
muskelmassa / kroppsvikt - Twitch spänning, P t (MN) =
maximal spänning som genereras under rycka - Särskilda rycka spänning (N / cm 2) =
rycka spänning (MN) / tvärsnittsyta (ìm 2) x 10 5 N / MN • ìm 2 / cm 2 - Tiden till maximal spänning (ms) =
Tiden från debut av kontraktion till maximal spänning - Half-avslappning (ms) =
tid från topp spänningen till 50% av maximal spänning - Tetanic spänning, P O (mn) =
maximal spänning som genereras under stelkramp - Särskilda tetanic spänning (N / cm 2) =
tetanic spänning (MN) / tvärsnittsyta (ìm 2) x 10 5 N / MN • ìm 2 / cm 2 - Maximal höjning av stelkramp (N / S) =
maximal procentuell ökning i spänning under spänningen ökade stelkramp, dvs högsta lutning tetanic spänning kurvan (eller, dP O / DT) - Half-avslappning tetanic spänning (ms) =
tid från upphörande av stimulans till 50% av spänningen vid uppsägning av stimulering - Twitch spänning till tetanic spänning förhållandet, P T / P O =
maximal rycka spänning / max tetanic spänning - Trötthet index =
förhållandet mellan spänning efter två minuters låg frekvens trötthet till maximal isometrisk spänning
5. Representativa resultat
Figur 1. Dissekering av EDL muskler. A Exponering i bakdelen muscles.TA, tibialis anterior. B, exponering av EDL (extensor digitorum longus) muskler. C Montering av suturer till EDL senor. D, Tension givare bad (vy från sidan). E, monterat EDL i badet (vy från ovan). Muskeln i nedsänkt ofullständigt i bufferten illustrativ, i praktiken bör muskeln vara helt nedsänkta för att hindra från att torka ut.
Figur 2. Exempel på spänning kurvor. A Exempel på rycka spänning kurva som illustrerar maximal rycka spänning (P t), kontraktion tid (CT) och halv-relaxationstiden (HRT). Bar, 1s. B, Exempel på tetanic spänning kurva som visar maximal tetanic spänning (P o) och halv-avslappning tetanic spänning (HRTT). Bar, 1s.
Figur 3. Exempel på kraft-frekvens relation analys. A, Spänningar skapas av inkrementell stimulering frekvenser. B, Exempel på pulståget vid 30 MHz. Bar, 80 ms. C, Exempel på pulståget på 140MHz. Bar, 80 ms. D Exempel på kraft-frekvenskurva från data som visas i en. Formen på kraft-frekvenskurva är kännetecknande för muskelstyrka, och kan jämföras mellan muskler från olika djur.
Figur 4. Exempel på låg frekvens trötthet analys. En, neråt spänningar som genererats under perioden av låg frekvens stimulation.Examples av pulståg vid olika tidpunkter (B, C, D) visas nedan. E, Exempel på låg frekvens trötthet kurvan härleds från data visas i ett. Formen på låg frekvens trötthet kurvan är kännetecknande för muskelstyrka, och kan jämföras mellan muskler från olika djur.
Discussion
Vi beskriver en detaljerad strategi för att bedöma myo-mekaniska egenskaper i explanterade bakdelen muskel från musen. EDL, medan svårare att dissekera på grund av dess bakre position bakom tibialis anterior muskeln är lättare att utvärdera än tibialis anterior på grund av dess framträdande tendinous bilagor till ankeln och knäledsartros. Dessa senor underlätta montering i muskeln band myograph. Däremot har de mer lättillgängliga tibialis anterior en bred, nästan atendinous anknytning vid knäleden, vilket gör det oerhört svårt att både dissekera utan att kompromissa med muskler, och montera säkert i myograph. Vi påpekar också att snabbt montage muskeln i en syresatt bad i fysiologisk buffert och temperatur är avgörande för att bevara muskelns mekaniska egenskaper. Vi har funnit att vi kan upprepa den här analysen i upp till 30 minuter utan signifikanta förändringar i muskler svar under dessa förhållanden. Slutligen är det viktigt att muskelfibrerna inte vidröras under dissekering och montage, eftersom detta kan få negativa effekter på muskelfunktion, och resultera i underskattning av myo-mekanisk kraft. Genom att följa dessa procedurer ger denna analys en robust kvantitativ metod för att utvärdera effekterna av genetisk modifiering på muskelfunktion 6,7,8,9, liksom jämförelse mellan terapeutiska ingrepp i musmodeller av muskelsjukdom 1,2,3,5 .
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett Public Health Service Grant (HL086513) från NHLBI till PEO, och ett omfattande forskningsanslag från California Institute för regenerativ medicin (RC1-00104), en Public Health Service Grant (HL085377) från NHLBI, och en gåva från Pollin Foundation för HSB
SC fick stöd av en California Institute för regenerativ medicin Bridges to Stem Award Cell Research (TB1-01.194) till San Francisco State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 silk sutures | Oasis | MV682 | General surgery |
| Dupont #5 forceps | WPI | 500233 | General surgery |
| Hemostat, straight | WPI | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | WPI | 15914 | General surgery |
| Lab Chart software | ADInstruments | Version 7 | Data analysis |
| Muscle Strip Myograph | DMT | 820MS | Tension transduction |
| Operating scissors | WPI | 501754 | General surgery |
| Oscilloscope | EZ | OS-5020 | Tension stimulation |
| Pentobarbital, sodium salt | Sigma | P3761 | Euthanasia |
| PowerLab | ADInstruments | 8/30 | Data acquisition |
| Square Pulse Stimulator | Grass Tech. | S48 | Tension stimulation |
| Vannas spring scissors | WPI | 14003 | General surgery |
Solutions and Media |
|||
Lactated Ringer's solution |
|||
|
|||
Krebs Henseleit solution |
|||
|
|||
Pentobarbital |
|||
|
|||
References
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).
- Messina, S. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).
- Danieli-Betto, D. Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue. Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).
- MacIntosh, B. R., Willis, J. C. Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).
- Hayes, A., Williams, D. A. Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming. J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).
- Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).
- Danieli-Betto, D. Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).
- Chan, S. A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).
- Personius, K. E. Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice. J Appl. , Forthcoming (2010).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).
- Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II. Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).
