Summary
В этом протоколе, экспрессия генов у дрожжей (
Abstract
В этом протоколе, экспрессия генов у дрожжей (Saccharomyces CEREVISIAE) изменяется после воздействия на окислительный стресс, вызванный добавлением перекиси водорода (H 2 O 2), окислитель. В эксперименте, дрожжи выращивают в течение 48 часов в 1/2X бульон YPD содержащие 3X глюкозы. Культура делится на контроль и рассматривать группу. Эксперимент культуры обрабатывают 0,5 мМ H 2 O 2 в буферном солевом растворе Хэнкса (HBSS) в течение 1 часа. Управление культуры обрабатывают HBSS только. Всего РНК извлекается из обеих культур и преобразуется в биотин-меченых продуктов кРНК через многоступенчатый процесс. Конечный продукт синтеза вернули в основной фонд УВМ Microarray и гибридизации с GeneChips Affymetrix дрожжей. Полученные данные экспрессии генов, загруженные в области биоинформатики программного обеспечения для анализа данных.
Protocol
Discussion
Disclosures
Производство видео-статья была организована EMD-Millipore.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spetrophotometer | |||
| Thermocyler | |||
| Microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Stir Plates (2) | |||
| P-10s pipettors | |||
| P-20's pipettors: | |||
| P-200's pipettors: | |||
| P-1000's pipettors: | |||
| Camera and transilluminator | |||
| E-Gel Apparatus | Invitrogen | G6000-08 | |
| E-Gels | Invitrogen | G6018-02 | |
| Axygen 1.7 ml. Clear | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT175C | |
| Axygen 0.5 ml clear tubes | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT060C | |
| Axygen 2ml capture tubes | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT200NC | |
| boxes of P-10 ART tips: | CLP | BT10XL | |
| Boxes of P-100 ART tips: | CLP | BT200 | |
| Boxes of P-20 ART Tips: | CLP | BT20 | |
| Boxes of P-1000 ART Tips: | CLP | BT1000 | |
| Yeast Chips | |||
| 25 ml sterile disposable pipets- | |||
| 5ml sterile disposable pipets- | |||
| Microfuge tube racks | |||
| KimWipes: | |||
| Lab Coats | |||
| Stir Bars | |||
| Culture flasks | |||
| Innoculating loops | |||
| Sharpies | |||
| Gloves | |||
| Autoclave tape | |||
| Stirrer bars | |||
| 30% Hydrogen Peroxide |  EMD Millipore |
386790 | |
| HBSS without Ca, Mg, or dye | Sigma-Aldrich | H6648-100ml | |
| Qiagen Rneasy Mini Kit: | Qiagen | 74104 | |
| Qiagen DNase Kit: | Qiagen | 79254 | |
| Rnase Remover | Denville Scientific | D1180 | |
| Harleco Alcohol 100% | EMD Millipore |
65347 | |
| ENZO IVT Kit | Enzo Life Sciences | ENZ-42655-10 | |
| Lyticase: one bottle | VWR international | IC19012310 | |
| Water, Cell Culture grade | EMD Millipore |
4.86505 | |
| Yeast culture: | ATCC | 18824 | |
| YPD broth powder | EMD Millipore |
4.8504 | |
| D(+) Glucose, Anhydrous | EMD Millipore |
346351 | |
| Sorbitol | EMD Millipore |
56755 | |
| EDTA | EMD Millipore |
4005 | |
| SDS solution, 20% | EMD Millipore |
7990-OP | |
| Pellet Paint | EMD Millipore |
69049 | |
| PCI RNase DNase free (7 aliquots): | Fisher Scientific | AC32711-500 | |
| 7.5M NH4OAc | Fisher Scientific | ICN1987 5980 | |
| Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA) | |||
| Trizma Base | Fiaher | 50-899-90034 | |
| KOAc | Fisher Scientific | NC9757725 | |
| MgOA | Fisher Scientific | NC9681042 | |
| Loading Dye | Invitrogen | 10482055 | |
| PCR Markers | EMD Millipore |
69278-3 | |
| Phase Lock Gels | Fisher Scientific | FP2302820 | |
| One-Cycle cDNA Kit | Invitrogen | A10752-030 | |
| Includes; | |||
| E. coli DNA Pol | |||
| dNTP's | |||
| T4 DNA Pol. | |||
| T-7 oligod(T) | |||
| 0.5ml EDTA pH 8.0 | |||
| First Strand Buffer | |||
| E. Coli RNaseH | |||
| Second Strand Buffer | |||
| E. Coli DNA ligase | |||
| SuperScript II | |||
| DTT |
References
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).
- D'Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
- Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis. J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).
- Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).
- Vermont Genetics Network. Microarray Outreach. , (2008).
- Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual. , Affymetrix. Santa Clara, CA. (2004).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Dennis, G. Jr, Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery. Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).
