Summary
Neste protocolo a expressão do gene, em leveduras (
Abstract
Neste protocolo, a expressão gênica em leveduras (Saccharomyces cerevisiae) é alterada após a exposição ao estresse oxidativo induzido pela adição de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2), um agente oxidante. No experimento, o fermento é cultivado por 48 horas em caldo YPD 1/2X contendo glicose 3X. A cultura é dividido em um controle e grupo tratado. A cultura experimento é tratada com 0,5 mM H 2 O 2 em Buffered Saline Hanks (HBSS) por 1 hora. A cultura de controle é tratado com HBSS só. Total de RNA é extraído de ambas as culturas e é convertido em um produto marcado com biotina cRNA através de um processo de várias etapas. O produto final é a síntese levado de volta para o Mecanismo de Núcleo UVM Microarray e hibridizada com o fermento GeneChips Affymetrix. Os dados expressão resultante gene são enviados para bioinformática software de análise de dados.
Protocol
Discussion
Disclosures
A produção deste vídeo-artigo foi patrocinado pela EMD-Millipore.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spetrophotometer | |||
| Thermocyler | |||
| Microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Stir Plates (2) | |||
| P-10s pipettors | |||
| P-20's pipettors: | |||
| P-200's pipettors: | |||
| P-1000's pipettors: | |||
| Camera and transilluminator | |||
| E-Gel Apparatus | Invitrogen | G6000-08 | |
| E-Gels | Invitrogen | G6018-02 | |
| Axygen 1.7 ml. Clear | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT175C | |
| Axygen 0.5 ml clear tubes | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT060C | |
| Axygen 2ml capture tubes | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT200NC | |
| boxes of P-10 ART tips: | CLP | BT10XL | |
| Boxes of P-100 ART tips: | CLP | BT200 | |
| Boxes of P-20 ART Tips: | CLP | BT20 | |
| Boxes of P-1000 ART Tips: | CLP | BT1000 | |
| Yeast Chips | |||
| 25 ml sterile disposable pipets- | |||
| 5ml sterile disposable pipets- | |||
| Microfuge tube racks | |||
| KimWipes: | |||
| Lab Coats | |||
| Stir Bars | |||
| Culture flasks | |||
| Innoculating loops | |||
| Sharpies | |||
| Gloves | |||
| Autoclave tape | |||
| Stirrer bars | |||
| 30% Hydrogen Peroxide |  EMD Millipore |
386790 | |
| HBSS without Ca, Mg, or dye | Sigma-Aldrich | H6648-100ml | |
| Qiagen Rneasy Mini Kit: | Qiagen | 74104 | |
| Qiagen DNase Kit: | Qiagen | 79254 | |
| Rnase Remover | Denville Scientific | D1180 | |
| Harleco Alcohol 100% | EMD Millipore |
65347 | |
| ENZO IVT Kit | Enzo Life Sciences | ENZ-42655-10 | |
| Lyticase: one bottle | VWR international | IC19012310 | |
| Water, Cell Culture grade | EMD Millipore |
4.86505 | |
| Yeast culture: | ATCC | 18824 | |
| YPD broth powder | EMD Millipore |
4.8504 | |
| D(+) Glucose, Anhydrous | EMD Millipore |
346351 | |
| Sorbitol | EMD Millipore |
56755 | |
| EDTA | EMD Millipore |
4005 | |
| SDS solution, 20% | EMD Millipore |
7990-OP | |
| Pellet Paint | EMD Millipore |
69049 | |
| PCI RNase DNase free (7 aliquots): | Fisher Scientific | AC32711-500 | |
| 7.5M NH4OAc | Fisher Scientific | ICN1987 5980 | |
| Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA) | |||
| Trizma Base | Fiaher | 50-899-90034 | |
| KOAc | Fisher Scientific | NC9757725 | |
| MgOA | Fisher Scientific | NC9681042 | |
| Loading Dye | Invitrogen | 10482055 | |
| PCR Markers | EMD Millipore |
69278-3 | |
| Phase Lock Gels | Fisher Scientific | FP2302820 | |
| One-Cycle cDNA Kit | Invitrogen | A10752-030 | |
| Includes; | |||
| E. coli DNA Pol | |||
| dNTP's | |||
| T4 DNA Pol. | |||
| T-7 oligod(T) | |||
| 0.5ml EDTA pH 8.0 | |||
| First Strand Buffer | |||
| E. Coli RNaseH | |||
| Second Strand Buffer | |||
| E. Coli DNA ligase | |||
| SuperScript II | |||
| DTT |
References
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