Summary
이 프로토콜은 수지 내장 뇌 조직은 전자 현미경을 스캐닝, 초점을 맞춘 이온 빔의 3 차원에 준비하고 몇 군데 수있는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜은 방법을 생물 학적 샘플, 뇌 조직처럼 초점을 맞춘 이온 빔 / 스캐닝 전자 현미경 (동기 / SEM)을 사용하여 3 차원에 몇 군데 수 있습니다 설명합니다. 샘플은 오스뮴의 tetroxide와 uranyl 아세트산을 사용하여 aldehydes, 중금속 묻은로 고정됩니다. 그들은 알코올로 다음 건조하고 다음 강화된있다 수지와 침입. 가벼운 현미경 유리 나이프와 ultramicrotome를 사용하여 표면에 가까운 영역이자를 포함하는 작은 블록이 이루어집니다. 블록은 다음 동기 / SEM 안에 배치하고, 이온 빔 가까운이 지역에, 블록의 한쪽을 따라 약 밀 수직 얼굴을하는 데 사용됩니다. 이미지 기본 구조를 backscattered 전자를 사용하여 작은 얼굴은 다음 미세한 이온 빔을 가공된하고 표면은 몇 군데와 가공된 수 얼굴의 정확한 지역을 파악하기 위해보다 긴밀하게 시시콜콜 따지는 것입니다. 현미경의 매개 변수는 다음 시리얼 이미지 블록의 볼륨을 통해 수집되도록 얼굴이 반복적으로 가공된하고 몇 군데되도록 설정되어 있습니다. 이미지 스택은 일반적으로 각 방향으로 작은 4 NM 같은 크기로 등방성 voxels이 포함됩니다. 모든 이미지 비행기에서 본 이미지 품질은 사용자가 이미지 스택 내의 모든 시야각에서 셀 ultrastructure을 분석 수 있습니다.
Protocol
1. 샘플 고정 및 수지 삽입
- 신선한 조직과 세포의 샘플은 2 % paraformaldehyde에 적어도 2 시간 동안 고정하고, 7.4의 산도에 0.1 M 인산 완충액에서 2.5 %의 글루 타 알데히드입니다. 샘플 크기가 충분히 침투 또는 정착액을 허용 두께 0.150 mm를 넘지 않아야합니다, 12 시간 이상에 대한 수정에 남아있을 수 없습니다.
- 20ml 유리 섬광 튜브 안에 샘플을 놓고 그들에게 0.1M cacodylate 버퍼에 세 번 5 분 각각, 린스.
- 1.5 % (W / V) 30 분 0.1 M cacodylate 버퍼 (0.1 M, pH를 7.4)에 칼륨 ferrocyanide 1 % (W / V) 오스뮴의 tetroxide로 얼룩.
- 30 분 0.1M cacodylate 버퍼에서 1.0 % (W / V) 오스뮴의 tetroxide로 얼룩.
- 3 분 두 번 증류수로 한번 헹구어.
- 1퍼센트 (W / V) 30 분 더블 증류수에 uranyl 아세테이트와 청바지.
- 등급 알코올 시리즈 2 분 각 변경 (1 X 50 %, 1 X 70 %, 1 X 90 %, 1 X 95%, 2 X 100 %)에서 탈수 후 두 번 증류수로 5 분 섹션을 씻어합니다.
- 70 %, 90 %, 95% 후 100 % : 에탄올의 50 % Durcupan에서 시작 에탄올과 혼합 Durcupan 수지, 각각의 변화 30 분, 증가 농도에 임베드 다음 다음.
- 신선한 Durcupan로 교체하고 4 시간 동안 천천히 선동.
- 플레이스 섹션, 금형 분리 요원과 함께 코팅하고, 65 곳에 유리 현미경에 나무 칵테일 스틱을 사용하여 슬라이드 24 시간 동안 ° C 오븐.
2. 동기 / SEM에 대한 샘플을 준비
- 두 유리 현미경 슬라이드 사이에서 샘플을 포함, 수지 층을 분리하고 에이전트를 분리하는 곰팡이를 제거하는 완전히 씻으십시오.
- 낮은 전력 목표와 전송 가벼운 현미경을 사용하거나, 수지의 단면 내에서 관심 영역을 식별하는, 전송 조명과 현미경을 해부.
- 면도날을 사용하여 관심 지역의 주위에 사각형 소형 (3mm X 3mm)을 잘라 아크릴 접착제로 빈 수지 블록 (그림 1)의 상단에 넣어 둬요. 다음 단계로 진행 후 강화하는 접착제에 대한 5 분 기다려합니다.
- ulramicrotome의 소유자로 블록을 고정하고, 첨부된 stereomicroscope를 사용하여 재료 남아의 단지 작은 피라미드까지 면도날과 관심의 주변 지역 장식.
- 또한 관심의 영역이 정확하게와 관련하여 블록의 표면 (그림 1)의 크기를 찾을 수 있도록 ultramicrotome에 고정 유리 칼을 사용하여 블록을 잘라. 블록 중 하나 가장자리를 잘라 수직 단계는 (그림 1 및 2) 샘플을 통해 절단 있도록 관심있는 지역에 인접해 있습니다. 이 단계는 이미징 얼굴 (그림 2)을 형성한다.
- 전송 가벼운 현미경을 사용하여 ultramicrotome 및 사진 블록 내에서 관심있는 지역에서 블록을 제거합니다.
- 나머지 수지 스텁 멀리 손질 블록을 잘라 버릴거야. 이것은 보석의보고를 사용하여 수행되며 작은 블록이 동기 / SEM 안에는 것을 보장합니다. 이 블록의 총 높이가 5mm 이상해서는 안됩니다.
- 몇 군데되는 측면이 바깥쪽 가장자리 (그림 1)에 있도록 탄소 붙여넣기와 알루미늄 스텁에 접착제가 블록.
- 접착제가 마른 후, 황금의 얇은 층 (> 20 NM, 크레싱턴 진공 증발 시스템)과 함께 코트 블록을.
3. 동기 / SEM의 영상
- 낮은 배율에서, 그리고 관심과 블록의 측면의 선택 영역이 몇 군데 수 있도록 보조 전자 이미징 (5 KV, 0.5 nAmp), 동양 블록을 사용하여 (그림 2 C, D) 연산자에 직면하고 있습니다.
- 동양 얼굴이 몇 군데 수 있도록 블록 밀링 빔에 평행하게 놓여 있습니다. 이것은 전자빔이 얼굴에 54 ° (그림 2 B)에서 지향을 의미합니다.
- 13 현재 이온 빔 사용 - 30 KV에서 27 nAmps 것은 몇 군데로 지역의 정면에서 수지의 좁은 밴드를 제거합니다.
- 관심 지역을 overlies 가공된 얼굴을 볼 수 backscattered 이미징 모드로 전환합니다.
- (그림 2) 가공된하고 몇 군데로 구역에서 정확한 지역을 찾아 빛을 현미경 참고 이미지 (단계 16 촬영)와 가공된 얼굴의 이미지를 사용합니다.
- 관심 지역 (그림 2) 위의 블록의 표면에, 현미경의 가스 주입 시스템을 사용하여 탄소 (또는 금속)의 보호 계층 (약 1 미크론 두께)를 입금.
- 700 picoAmps, 잘게 밀 최종 이미지가 촬영되는 시간 블록의 영역의 전류를 사용합니다.
- 완전히 밀이 이미지의 얼굴을 더 밀링 유물이 얼굴에 볼 수 없습니다까지로 밀링 광선을 둡니다. 얼굴의 전체 공장은보기의 전체 분야에 걸쳐 각 후속 이미지의 변화를 관찰하여 검사합니다. 부적 절한 밀링도 vertica을 나타나는 흰색 줄무늬 또는 '커튼'로 볼 수 있습니다베드로 이미지 인치
- 분산 어떤 온도 변화에 대한 최소 2 시간 현미경을 둡니다. 이것은 블록 얼굴 고르지 이미지 결과 이미징 동안 드리프트 것이라는 위험을 줄여줍니다.
- 얼굴을 순차적으로 영상에 대한 현미경 매개 변수를 선택합니다. 전자빔은 블록 얼굴 소재의 매우 얕은 깊이에만 이미지를 충분히 낮은 전압을 가지고 있는지 확인합니다. 이것은 제거할 수있는 얼굴의 두께보다 훨씬 얕은해야합니다. 이미지에 대한 일반적인 매개 변수는 1.2 사이의 전압 있습니다 - 사이의 픽셀 크기 2.0 KV 4-20 NM. 픽셀 밀 얼굴을하고 하나의 이미지를 얻기위한 총 시간 (그림 3) 이분 아래에 유지되도록 10 μsecs 주위 보관 시간 요구를 머물러.
4. 성공의 비밀
단계 1) 샘플을 150 마이크론 이상의 두께되지 않습니다 확인하십시오. 이것은 물질에 다른 얼룩과 수지의 적절한 삽입을 가능하게합니다. 이것은 바로 고정 후 vibratome와 함께 샘플을 sectioning하여 얻을 수 있습니다. 이 두께는 뇌 조직에 적합합니다. 다른 조직은 적절한 고정과 얼룩을 보장하기 위해 테스트해야합니다.
단계 3) 샘플은 자유롭게 솔루션 전반에 걸쳐 분산,이 보조 정착액가 소개되는 동안 유리병의 한 부분에 함께 clumped 안해야합니다. 이것은 샘플의 최대 침투를 보장하고이 고정 과정에서 왜곡되는 샘플을 줄일 수 있습니다. 이것은 부드럽게 솔루션에 추가됩니다 즉시 유리병 내에 샘플을 소용돌이 치는 의해 이루어진다.
단계 15) 관심의 영역이 (<30 미크론) 이하 바로 블록의 표면에 위치하고 있는지 확인하십시오. 이것은 이미지 수집 단계 중 이온 빔에 의해 밀링의 양을 줄일 수 있습니다.
단계 22) 이온 빔의 스캔 시간은 전체 영상 얼굴이 완전히 가공된 것을 보장하기 위해 adequte해야합니다. 부적 절한 밀링은 이미징 얼굴 아래로 수직으로 나타나는 흰색 줄무늬, 또는 '커튼'으로 표시됩니다.
단계 26) 최종 가공된 얼굴이 몇 군데있는 얼굴보다 큰해야합니다. 가공된 수지가 바로 근처에있는 블록 표면에 블록과 redeposits에서 나옵니다 때문입니다. 이 redeposition은보기의 이미지 필드에 잠식 수 있고, 몇 군데보다 훨씬 넓은 지역을 밀링에 의해 피할 수있다. 20 미크론 폭 이미지 창은 가공된 블록 얼굴은 30 마이크론 넓이보다 큽니다.
단계 29) 전자빔 매개 변수는 이미지 블록의 표면의 단지 처음 몇 나노미터에서 나오는 전자에 의해 생성되는 그러한 것을 중요 좋습니다. 이 2 KV 아래에 전압을 최소화되며 전자는 너무 멀리 침투하지 않는함으로써 acheved. 이것은 또한 높은 에너지와 단지 전자 최종 이미지에 기여하는 것을 너무 탐지기에 그리드 전압을 사용하여 도왔다는. 일반적으로, 1.3 KV의 그리드 장력은 1.5 KV의 영상 전압에 사용됩니다.
5. 대표 결과 :
그림 1. 수지 블록의 준비.) 수지 steromicroscope에서 볼 성인 쥐 두뇌를 통해 코로나 섹션 (80 미크론 두꺼운)을 내장. 이미지가 명확하게 메스 블레이드를 사용하여 섹션 (B)에서 컷 수있는 서로 다른 뇌 영역을 보여줍니다. 여기 피질에서 1mm 광장이 제거되고 (C). D) 수지 블록이 다음 ultramicrotome에 탑재 유리 나이프로 손질하고, 일단 블록이 유일한을 떠날 감소되었습니다 빈 수지 블록에 붙어있다 관심 지역은 (E) 단계 F)가. 포함된 소재의 전면 표면에 수직 절단이 전체 손질 지역은 다음 수지의 나머지 부분에서 절단되며에서 알루미늄 금속 코팅 준비 스텁 및 이미징에 탑재 전자 현미경을 검사합니다.
그림 2.가.) 동기 / SEM 영상을위한 블록의 얼굴을 준비하고 B) 블록과 이미징 얼굴 (검은 머리 이중 화살표로 표시) 만들기 가공된있는 가장자리에 그림을 표시합니다. 이온 빔 (흰색)의 위치는 이미징 얼굴에 평행하게 표시됩니다, 그리고 전자빔 (회색)가 이온 빔 54 °에서 얼굴을 때리는가 표시됩니다. C)이 전자빔로 촬영한 블록의 전경을 보여줍니다 그리고 이차 전자와 함께 몇 군데. 블록의 측면을 따라 어두운 지역 (점선 흰색 상자로 표시) 약 가공된되었습니다 얼굴의 일부를 보여줍니다 (이중 머리로 표시에드 검은색 화살표)는 기본 샘플을 공개합니다. D)이 지역에만 backscattered 전자를 사용하여 몇 군데 때 내장 조직 볼 수 있습니다. 여기는 임베디드 조직 섹션의 전체 너비는 이중 달린 흰색 화살표로 표시됩니다. C 규모 표시줄) 100 미크론이다.
그림 3. 등방성 voxels과 뇌 조직의 이미징은 볼륨.) 쥐 두뇌의 영역 내에서 ultrastructure를 보여주는 블록의 얼굴 대조 backscattered 이미지를 레버 스드. 모든 점막이 표시뿐만 아니라 대형 macromolecular 구조입니다. B) 1600 이미지 전체가 등방성 voxels. C)이 스택이 동일한 해상도를 가진 비행기로 몇 군데 수있는 이미지 스택의 결과 5 nm의 간격에서 수집되었다. 이 이미지는 XY 평면과 yz 평면에 몇 군데있다 단일 시냅스 연결을 보여줍니다.
Discussion
관심의 영역이 너무 크게하지 않을 때 동기 / SEM의 기술은 최적의 작동합니다. 몇 군데 볼륨에 대한 상한은 이온 빔 및 지역에 따라 그런거야 많은 시간 동안 반복적으로 일관 밀 수 있습니다. 지금까지이 60 주변 X 60 미크론의 영역 완료되었습니다 그러나, 영상이 전체 면적은 적합한 이미지 해상도와 같은 큰 이미지를 수집 시간 요소를 주로 인해 불가능합니다. 예를 들어, 픽셀과 4 kx 4 K 이미지 10 마이크로초 시간 2 분 취득 40 초가 걸릴 것입니다, 60 미크론의보기의 필드에이 단 15 NM의 픽셀 크기를 줄 것입니다 머물러. 이미징 세포와 조직의 ultrastructure 들어, 작은 픽셀 크기가 더 적합하다, 일반적으로 4 십 nm의 / 픽셀 사이. 현미경이 기능을했다하더라도 60 X 60 미크론의 영역에 대한 이미지가 10 시간 내에 취득 것입니다. 이러한 이유로, 현미경은 10 × 10 × 10 미크론, 또는 전체 세포의 중요한 영역의 순서로 이미지 볼륨에 이상적인 도구입니다. 이것은 쉽게이 절차와 잘 대비 아르 샘플에서 48 시간 기간 내에 할 수 있습니다.
지금까지 프로토콜은 뇌 조직뿐만 아니라 coverslips을 준수하는 교양 포유 동물 세포의 다양한 유형을 중심으로 사용되고 있습니다. 그러나, 고정 및 얼룩 절차는 동일하게 잘 대비 이미지 스택을 생산하는 식물을 포함한 생물 학적 물질의 많은 다른 유형과 함께 사용할 수 있습니다.
따라서이 기술의 주요 장점은 등방성 voxels와 이미지 볼륨의 용량입니다. 이런 종류의 이미지 스택은 스택에 비행기에서 촬영한 이미지를 사용하여 3D 볼륨의 분석을 위해 수 있습니다. 이 혜택은 모든 방향에서 이미지 시리즈와 큰 이미지를 세부 (그림 3)을 제공하는 이미지 기능 감시자를 허용하는 것입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanoacrylate glue | |||
| Dissecting microscope: Leica MZ8 | Leica Microsystems | ||
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | ||
| FIB/SEM microscope (Zeiss, NVision 40) | |||
| Glass histology slides | Menzel-Glaser | AA00008032E | |
| Glass knife maker: Leica EM KMR2 | Leica Microsystems | ||
| Glass scintillation vials (20ml) | EMS | 72634 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16222 | |
| Jeweler’s saw | EMS | 72010 | |
| Mould separating agent | Glorex, Switzerland | 62407445 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19110 | |
| Paraformaldehyde | EMS | RT 19208 | |
| Phosphate salts for phosphate buffer | Sigma-Aldrich | 71642 and 71496 | |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | 20840 | |
| Sputter Coater with gold target | Cressington Co. | ||
| Tris base (TBS) | Sigma-Aldrich | T1378 | |
| Ultramicrotome: Leica UCT | Leica Microsystems | ||
| Uranyl acetate | EMS | RT 22451 |
References
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).
- Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue. J Microsc. 235, 336-347 (2009).
- Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy. PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).
