Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Harz eingebettet Hirngewebe vorbereitet und in den drei Dimensionen in den fokussierten Ionenstrahl abgebildet werden, Rasterelektronenmikroskop.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt, wie biologische Proben, wie Hirngewebe kann in drei Dimensionen mit dem fokussierten Ionenstrahl / Rasterelektronenmikroskop (FIB / SEM) abgebildet werden. Die Proben werden mit Aldehyden, Heavy-Metal-gebeizt mit Osmiumtetroxid und Uranylacetat fixiert. Sie werden dann entwässert mit Alkohol und infiltriert mit Harz, die anschließend gehärtet wird. Mit einem Lichtmikroskop und Ultramikrotom mit Glas Messer, ist ein kleiner Block mit der Region Interesse in der Nähe der Oberfläche. Der Block wird dann in dem FIB / SEM gelegt, und der Ionenstrahl auf rund Mühle eine vertikale Fläche entlang einer Seite des Blocks verwendet, in der Nähe dieser Region. Mit rückgestreuten Elektronen zur Abbildung der zugrunde liegenden Strukturen, ist eine kleinere Fläche dann mit einem feineren Ionenstrahl gefräst und die Oberfläche geprüft stärker an den genauen Bereich des Gesichts, die abgebildet und gefräst werden zu bestimmen. Die Parameter des Mikroskops werden dann so eingestellt, dass das Gesicht immer wieder wird gemahlen und abgebildet, so dass seriellen Bilder über ein Volumen des Blocks gesammelt werden. Das Bild Stack enthält typischerweise isotrope Voxel mit den Abmessungen so klein ein 4 nm in jede Richtung. Diese Bildqualität in jeder Bildebene ermöglicht dem Anwender, Ultrastruktur der Zelle bei jedem Betrachtungswinkel innerhalb der Bildstapel zu analysieren.
Protocol
1. Beispiel Fixierung und Einbettung Harz
- Proben von frischem Gewebe und Zellen für mindestens 2 Stunden in 2% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphat-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4. Die Größe der Stichprobe sollte nicht mehr als 0,150 mm in der Dicke eine ausreichende Penetration oder Fixativ zu ermöglichen, und sollte nicht in das Update für länger als 12 Stunden verlassen werden.
- Legen Sie die Proben in 20ml Glasszintillationsröhrchen und spülen sie dreimal, jeweils 5 Minuten, in 0,1 M Cacodylatpuffer.
- Stain mit 1,5% (w / v) Kaliumhexacyanoferrat und 1% (w / v) Osmiumtetroxid in 0,1 M Cacodylatpuffer (0,1 M, pH 7,4) für 30 Minuten.
- Stain mit 1,0% (w / v) Osmiumtetroxid in 0,1 M Cacodylatpuffer für 30 Minuten.
- Spülen Sie einmal mit doppelt destilliertem Wasser für 3 Minuten.
- Stain mit 1% (w / v) Uranylacetat in doppelt destilliertem Wasser für 30 Minuten.
- Spülen Sie Abschnitte für 5 Minuten in doppelt destilliertem Wasser, und dann entwässern in abgestuften Alkoholreihe, 2 Minuten jeder Änderung (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%).
- 70%, 90%, 95% und dann 100%: Embed in steigenden Konzentrationen von Durcupan Harz mit Ethanol vermischt, jeweils 30 Minuten ändern, beginnend bei 50% Durcupan in Ethanol, dann gefolgt.
- Ersetzen Sie mit frischen Durcupan und agitieren 4 Stunden langsam.
- Legen Abschnitte, mit hölzernen Zahnstochern, auf Glas Mikroskope Dias beschichtet mit Schimmel Trennmittel, und in 65 ° C im Ofen für 24 Stunden.
2. Vorbereitung der Probe für die FIB / SEM
- Trennen Sie die Harzschicht, mit den Proben aus zwischen den beiden Glas-Objektträger und gründlich waschen, um jede Form Trennmittel zu entfernen.
- Mit Hilfe eines Durchlicht-Mikroskop mit Low-Power-Ziele oder Binokular mit Durchlicht, um die Region von Interesse innerhalb der Schicht von Harz zu identifizieren.
- Schneiden Sie ein kleines (3 mm x 3 mm) Platz rund um die Region von Interesse mit einer Rasierklinge und kleben diese an die Spitze der leeren Harzblock mit Acryl-Klebstoff (Abbildung 1). 5 Minuten warten, bis der Kleber aushärten, und fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt.
- Klemmen Sie den Block in die Halterung des ulramicrotome und anhand der beigefügten Stereomikroskop, um die Region von Interesse mit einer Rasierklinge schneiden, bis nur noch eine kleine Pyramide des Materials bleibt.
- Weitere trim den Block, mit einem Glas Messer in den Ultramikrotom fixiert, so dass die Region von Interesse präzise in Bezug werden die Abmessungen des Blocks der Oberfläche (Abb. 1). Cut eine Kante des Blocks, in die Region von Interesse in der Nähe, so dass ein senkrecht Schritt durch die Probe geschnitten wird (Abb. 1 und 2). Dieser Schritt bildet die Bildgebung Gesicht (Abbildung 2).
- Entfernen Sie den Block aus dem Ultramikrotom und fotografieren die Region von Interesse innerhalb des Blocks mit einem Durchlicht-Mikroskop.
- Schneiden Sie die getrimmt Block entfernt von der restlichen Harz Stummel. Dies wird durch einen Juwelier sah getan und sichergestellt, dass nur ein kleiner Block im Inneren des FIB / SEM platziert wird. Die Gesamthöhe dieses Blocks sollte nicht mehr als 5 mm.
- Kleben Sie den Baustein, um ein Aluminium-Stub mit Kohlepaste sicherzustellen, dass die Seite abgebildet werden auf der äußersten Kante (Abbildung 1) ist.
- Nachdem der Leim getrocknet ist, Fell der Block mit einer dünnen Schicht aus Gold (> 20 nm; Cressington Vakuumverdampfung System).
3. Imaging in der FIB / SEM
- Bei einer niedrigen Vergrößerung, und mit Sekundär-Elektronen-Bildgebung (5 kV, 0,5 NAMP), orientieren den Block, so dass der gewählten Region von Interesse und die Seite des Blocks zu werden abgebildet wird mit Blick auf den Operator (Abbildung 2 c, d).
- Richten Sie den Block, so dass das Gesicht abgebildet zu sein liegt parallel zum Fräsen Strahl. Dies bedeutet, dass Elektronenstrahl wird auf 54 ° zu diesem Gesicht (Abbildung 2 b) orientiert.
- Mit Hilfe eines Ionenstrahls Strom von 13 bis 27 NAMPS bei 30 kV entfernen ein schmales Band von Harz von der Vorderseite der Region, die abgebildet werden.
- Wechseln Sie zu rückgestreuten Imaging-Modus, um die gefrästen Gesicht, das die Region von Interesse überlagert zu sehen.
- Mit der Lichtmikroskopie Referenzbild (aufgenommen am Schritt 16) und das Bild der gefrästen Fläche finden die genaue Region auf dem Block gefräst und abgebildet werden (Abbildung 2).
- Kaution eine Schutzschicht (etwa 1 Mikrometer dick) von Kohlenstoff (oder Metall), mit der Gas-Einspritzsystem des Mikroskops auf die Oberfläche des Blocks, oberhalb der region of interest (Abbildung 2).
- Mit einem Strom von 700 picoAmps, fein Mühle der Region des Blocks, in dem die endgültige aufgenommen werden sollen.
- Lassen Sie das Fräsen Strahl vollständig Mühle das Bild ins Gesicht, bis kein Fräsen Artefakte auf dem Gesicht zu sehen ist. Eine komplette Mühle des Gesichts wird durch Beobachtung von Veränderungen in jedem folgenden Bild über das gesamte Sichtfeld geprüft. Unzureichende Fräsen können auch als weiße Streifen oder "Vorhänge" erscheinen Vertica gesehenlly in das Bild.
- Lassen Sie das Mikroskop für mindestens 2 Stunden für eine thermische Veränderungen zu zerstreuen. Dies reduziert das Risiko, dass der Block Gesicht wird während der Bildgebung Drift, was falsch ausgerichtete Bilder.
- Wählen Sie das Mikroskop-Parameter für die Abbildung des Gesichts seriell. Stellen Sie sicher, dass der Elektronenstrahl eine Spannung, die niedrig genug, um nur Bild einer sehr flachen Tiefe des Materials in den Block Gesicht hat. Dies sollte auch viel flacher als die Dicke des Gesichts entfernt werden. Typische Parameter für die Bildgebung sind Spannungen zwischen 1,2 bis 2,0 kV mit Pixel-Größen zwischen 4 bis 20 nm auf. Die Pixelverweilzeit muss rund 10 μsecs, so dass die Gesamtzeit für die Mühle im Gesicht und am Erwerb eines Bildes unter 2 Minuten eingehalten wird (Abbildung 3) gehalten werden.
4. Schlüssel zum Erfolg
Schritt 1) Sicherstellen, dass die Proben nicht dicker als 150 Mikrometer. Dies ermöglicht es ausreichende Durchdringung der verschiedenen Flecken und Harz in das Material. Dies kann durch Schneiden der Proben mit einem Vibratom unmittelbar nach der Fixierung erreicht werden. Diese Dicke ist geeignet für Hirngewebe. Andere Gewebe müssen getestet werden, um ausreichende Fixierung und Färbung zu gewährleisten.
Schritt 3) Die Proben müssen frei in der Lösung verteilt werden, und nicht verklumpt in einem Teil der Flasche, während dieser sekundären Fixativ wird eingeführt. Dies gewährleistet maximale Durchdringung der Probe und zur Verringerung der Stichprobe ist verzerrt während dieser Fixierung Prozess. Dies wird durch vorsichtiges Schwenken der Proben innerhalb der Ampulle unmittelbar nach der Lösung gegeben, erreicht ist.
Step 15) sicher, dass die Region von Interesse befindet sich unmittelbar unterhalb befindet (<30 Mikrometer) der Oberfläche des Blocks. Dadurch wird die Menge an Fräsen durch den Ionenstrahl zu reduzieren während der Bildaufnahme Phase.
Step 22) Die Scan-Zeit des Ionenstrahls muss adequte um sicherzustellen, dass die gesamte Imaging-Gesicht komplett gefräst. Unzureichende Fräsen wird als weiße Streifen oder "Vorhänge" erscheinen vertikal in der Bildgebung Gesicht gezeigt.
Schritt 26) Der letzte gefräst Gesicht muss größer sein als das Gesicht, das abgebildet wird. Dies liegt daran, das gemahlene Harz aus dem Block und redeposits auf den Block Fläche in unmittelbarer Nähe ausgeworfen wird. Diese Wiederablagerung kann auf die bildgebende Sichtfeld eingreifen, und wird durch Fräsen einer viel größeren Fläche als abgebildet wird vermieden. Für ein bildgebendes Fenster, 20 Mikrometer breit ist, wird das gemahlene Block Gesicht größer als 30 Mikrometer breit.
Step 29) Es ist wichtig, dass der Elektronenstrahl-Parameter, so dass das Bild durch Elektronen, die nur aus den ersten wenigen Nanometern des Blocks der Oberfläche entstehen generiert wird. Dies ist ein acheved durch die Minimierung der Spannung auf unter 2 kV und sicherzustellen, dass keine Elektronen zu weit eindringen. Dies wird auch durch Verwendung einer Netzspannung auf den Detektor, so dass nur die Elektronen mit den höchsten Energien, um das endgültige Bild beitragen geholfen. Typischerweise wird ein Raster Spannung von 1,3 kV für ein Imaging-Spannung von 1,5 kV verwendet.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Vorbereitung des Harzes zu blockieren. A) Resin Frontalschnitt (80 Mikrometer dick) durch einen Erwachsenen Rattenhirn in einer steromicroscope angesehen eingebettet. Das Bild zeigt deutlich die verschiedenen Hirnregionen, die aus dem Abschnitt (b) mit einem Skalpell geschnitten werden können. Hier wird eine 1 mm ² aus der Rinde entfernt und (c) auf eine leere Harzblock stecken. D) Das Harz Block wird dann mit einem Glas Messer in einem Ultramikrotom montiert getrimmt, und sobald der Block wurde reduziert, um nur verlassen Region of Interest (e), ist ein Schritt senkrecht zur Vorderseite des eingebetteten Materials geschnitten. f) Das gesamte getrimmt Region wird dann aus dem Rest der Harz geschnitten und montiert auf einem Aluminium-Stub bereit für Metallbeschichtung und Bildgebung in der Rasterelektronenmikroskop.
Abbildung 2. Vorbereiten der Block Gesicht für FIB / SEM Bildgebung. A) und b) zeigen Darstellungen des Blocks und die Kante, gemahlen, um die Imaging-Gesicht (angegeben mit dem schwarzen Doppelpfeil) zu erstellen. Die Position des Ionenstrahls (weiß) ist parallel zur Bildgebung Gesicht gezeigt, und der Elektronenstrahl (grau) wird gezeigt, trifft das Gesicht bei 54 °, um den Ionenstrahl. C) zeigt eine Ansicht des Blocks mit dem Elektronenstrahl getroffen und mit der sekundären Elektronen abgebildet. Entlang dieser Seite des Blocks eine dunklere Region (angedeutet durch gestrichelte weiße Box) zeigt einen Teil des Gesichts, die etwa hat gefräst (dargestellt mit Doppel-Kopfed schwarzer Pfeil), um die zugrunde liegende Stichprobe. d) Wenn dieser Region abgebildet wird nur mit der rückgestreuten Elektronen die eingebetteten Gewebe zu sehen ist. Hier ist die volle Breite des eingebetteten Gewebeschnitte mit einem Doppelpfeil weißen Pfeil gekennzeichnet. Maßstabsbalken in c) ist 100 Mikron.
Abbildung 3. Imaging die ein Volumen von Hirngewebe mit isotropen Voxeln. A) Reversed Gegensatz rückgestreuten Bild des Blocks Gesicht zeigt die Ultrastruktur in einem Bereich von Gehirn der Ratte. Alle Membranen sind ebenso wie große makromolekularen Strukturen. B) Insgesamt 1600 Bilder auf 5 nm Abstand, was zu einer Bildstapel mit isotropen Voxeln. C) Dieser Stapel in einer Ebene mit der gleichen Auflösung abgebildet werden kann, wurden gesammelt. Dieses Bild zeigt einzelne synaptische Verbindung, die in der xy-Ebene und der yz-Ebene abgebildet wird.
Discussion
Die Technik der FIB / SEM arbeitet optimal, wenn die Region von Interesse ist nicht allzu groß. Die Obergrenze für eine bebilderte Band richtet sich nach dem Ionenstrahl und der Bereich, dass es konsequent Mühle immer wieder über viele Stunden. So weit dies mit Flächen von rund 60 x 60 Mikrometer getan worden, aber Bildgebung dieser gesamte Bereich ist nicht mit einem geeigneten Bildauflösung möglich, vor allem auf den Faktor Zeit in das Sammeln solcher ein großes Bild. Als ein Beispiel, wohnen ein 4 kx 4 k Bild mit einem Pixel auf 10 Mikrosekunden wäre 2 Minuten und 40 Sekunden zu erwerben nehmen, und für ein Sehfeld von 60 Mikron diese würde nur eine Pixelgröße von 15 nm auf. Zur Darstellung der Ultrastruktur von Zellen und Geweben, ist eine kleinere Pixelgröße besser geeignet, in der Regel zwischen 4 und 10 nm / Pixel. Für eine Fläche von 60 x 60 Mikrometer würde das Bild in 10 Stunden erworben werden, auch wenn das Mikroskop hatte diese Fähigkeit. Aus diesen Gründen ist das Mikroskop ein ideales Werkzeug für Bildvolumina in der Größenordnung von 10 x 10 x 10 Mikrometer, oder bedeutenden Regionen der ganzen Zellen. Dies kann leicht in einem Zeitraum von 48 Stunden an Proben, die mit diesem Verfahren gut kontrastiert durchgeführt werden.
Bisher ist die Protokoll wurde vor allem mit Hirngewebe, sowie verschiedene Arten von kultivierten Säugetierzellen Einhaltung Deckgläser verwendet. Allerdings kann die Fixierung und Färbung mit vielen anderen Arten von biologischem Material, einschließlich Pflanzenmaterial gleichermaßen gut kontrastiert Bildstapeln produzieren verwendet werden.
Deshalb ist die wesentliche Vorteil dieser Technik ist ihre Fähigkeit, Bild Bände mit isotropen Voxeln. Bild Stapel dieser Art erlauben Analysen der 3D-Volumen mit Bildern auf jeder Ebene in die Liste aufgenommen. Der Vorteil davon ist, den Betrachter zu Bildmerkmale in die Bildserie aus jeder Richtung und bieten eine größere Detailgenauigkeit (Abbildung 3) zu ermöglichen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanoacrylate glue | |||
| Dissecting microscope: Leica MZ8 | Leica Microsystems | ||
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | ||
| FIB/SEM microscope (Zeiss, NVision 40) | |||
| Glass histology slides | Menzel-Glaser | AA00008032E | |
| Glass knife maker: Leica EM KMR2 | Leica Microsystems | ||
| Glass scintillation vials (20ml) | EMS | 72634 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16222 | |
| Jeweler’s saw | EMS | 72010 | |
| Mould separating agent | Glorex, Switzerland | 62407445 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19110 | |
| Paraformaldehyde | EMS | RT 19208 | |
| Phosphate salts for phosphate buffer | Sigma-Aldrich | 71642 and 71496 | |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | 20840 | |
| Sputter Coater with gold target | Cressington Co. | ||
| Tris base (TBS) | Sigma-Aldrich | T1378 | |
| Ultramicrotome: Leica UCT | Leica Microsystems | ||
| Uranyl acetate | EMS | RT 22451 |
References
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).
- Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue. J Microsc. 235, 336-347 (2009).
- Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy. PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).
