Summary
Detta protokoll beskriver hur harts inbäddade hjärnvävnad kan förberedas och avbildas i de tre dimensioner i fokuserad jonstråle, svepelektronmikroskop.
Abstract
Detta protokoll beskriver hur biologiska prover, som hjärnvävnad, kan avbildas i tre dimensioner med hjälp av fokuserad jonstråle / svepelektronmikroskop (FIB / SEM). Proverna är fasta med aldehyder, tungmetaller färgas med osmium Tetroxide och AUC acetat. De är sedan torkade alkohol och infiltrerade med harts, som sedan härdas. Använda ett ljusmikroskop och ultramicrotome med glas knivar, är ett litet block som innehåller regionen intresse nära ytan gjorts. Blocket placeras sedan in i FIB / SEM, och jonstråle används för att grovt kvarn en vertikal ansikte längs ena sidan av blocket, nära denna region. Använda backscattered elektroner till bilden de underliggande strukturerna, är en mindre ansikte sedan mals med ett finare jonstrålar och ytan granskas närmare att fastställa den exakta område i ansiktet som ska avbildas och mals. Parametrarna av mikroskopet då in så att ansiktet upprepade gånger mals och avbildas så att seriella bilder samlats in genom en volym av blocket. Bilden stacken innehåller vanligtvis isotrop voxlar med mått som små en 4 nm i varje riktning. Detta bildkvalitet i alla bildhantering plan som möjliggör för användaren att analysera cellen ultrastruktur vid någon vinkel i bilden stacken.
Protocol
1. Exempel fixering och harts inbäddning
- Prover av nya vävnader och celler är fasta i minst 2 timmar i 2% paraformaldehyd, och 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert vid pH 7,4. Urvalsstorleken bör inte överstiga 0,150 mm i tjocklek för att möjliggöra tillräcklig penetration eller fixativ, och bör inte lämnas kvar i fix för längre tid än 12 timmar.
- Placera proverna i 20 ml glasflaskor scintillation och skölj dem tre gånger, 5 minuter vardera i 0,1 miljoner cacodylate buffert.
- Fläcken med 1,5% (w / v) kaliumferrocyanid och 1% (w / v) osmium Tetroxide i 0,1 M cacodylate buffert (0,1 M, pH 7,4) i 30 minuter.
- Fläcken med 1,0% (w / v) osmium Tetroxide på 0,1 miljoner cacodylate buffert i 30 minuter.
- Skölj en gång med dubbla destillerat vatten i 3 minuter.
- Fläcken med 1% (w / v) AUC acetat i dubbeldestillerat vatten i 30 minuter.
- Skölj delarna i 5 minuter i dubbeldestillerat vatten och sedan torka i graderade alkohol serien, 2 minuter varje förändring (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%).
- Bädda in för att öka halterna av Durcupan harts blandad med etanol, 30 minuter varje förändring, med början vid 50% Durcupan i etanol, sedan följt av: 70%, 90%, 95% och sedan 100%.
- Ersätt med färska Durcupan och skaka sakta i 4 timmar.
- Placera sektioner, med hjälp av trä cocktail pinnar, diabilder på glas mikroskop täckt med mögel separera agent, och placera i 65 ° C ugn i 24 timmar.
2. Preparering av provet för FIB / SEM
- Separera harts lager, som innehåller prover från mellan de två glas objektglas och tvätta noggrant för att avlägsna mögel separera agent.
- Med hjälp av en genomlysning mikroskop med låg effekt mål, eller dissekera mikroskop med belysning, för att identifiera regionen av intresse inom den del av kåda.
- Skär ett litet (3 mm x 3 mm) fyrkant runt regionen av intresse med hjälp av ett rakblad och hålla detta till toppen av tomma harts block med akryl lim (Figur 1). Vänta 5 minuter för limmet att härda, och sedan fortsätta med nästa steg.
- Spänn fast blocket till innehavaren av ulramicrotome och med hjälp av bifogade stereomikroskop, trimma runt om i regionen av intresse med ett rakblad tills bara en liten pyramid av material återstår.
- Ytterligare trim blocket, med hjälp av ett glas kniv fast i ultramicrotome, så att regionen av intresse exakt kan lokaliseras med hänsyn dimensioner blockets yta (figur 1). Skär ett kanten av blocket, nära till regionen av intresse, så att en vinkelrät steg skära igenom provet (Figur 1 och 2). Detta steg utgör imaging ansiktet (figur 2).
- Ta bort kvarter från ultramicrotome och fotografera regionen av intresse inom blocket, med en ljus mikroskop.
- Skär den beskurna kvarter från de återstående harts stöta. Detta görs med hjälp av en juvelerare såg och säkerställer att endast ett litet block är placerad inuti FIB / SEM. Den totala höjden på detta block bör inte vara mer än 5 mm.
- Limma blocket till en aluminium stub med kol klistra se till att den sida som ska avbildas är på den yttersta kanten (figur 1).
- När limmet har torkat, päls blocket med ett tunt lager av guld (> 20 nm, Cressington vakuum avdunstning system).
3. Imaging i FIB / SEM
- På en låg förstoring, och använda sekundär elektron imaging (5 kV, 0,5 nAmp), orientera blocket så att den valda regionen av intresse och den sida av blocket som ska avbildas är vänd mot operatören (Figur 2 C, D).
- Orient blocket så att ansiktet ska avbildas ligger parallellt med fräsning strålen. Detta innebär att elektronstrålen är riktat vid 54 ° till denna yta (Figur 2 B).
- Använda en jonström av 13 till 27 nAmps vid 30 kV bort ett smalt band av kåda från framsidan av det område som ska avbildas.
- Växla till backscattered avbildning mode för att visa frästa ansikte som overlies regionen av intresse.
- Med hjälp av ljus bild mikroskopi referens (tas i steg 16) och bilden av den frästa ansiktet lokalisera den exakta regionen på blocket som skall fräsas och avbildas (figur 2).
- Deposition ett skyddande lager (cirka 1 mikron tjockt) av kol (eller metall), som använder systemet injicerats med gas i mikroskop, på ytan av blocket, ovanför regionen av intresse (Figur 2).
- Med hjälp av en ström på 700 picoAmps, fint kvarn regionen blocket inom vilken den slutliga bilder kommer att tas.
- Lämna fräsning strålen att helt kvarnen denna bild ansiktet tills inget fräsning artefakter kan ses i ansiktet. En komplett fabrik i ansiktet kontrolleras genom att iaktta förändringar i varje efterföljande bild över hela synfältet. Otillräcklig fräsning kan också ses som vita streck eller "gardiner" som förekommer Vertically i bilden.
- Lämna mikroskop för en minst 2 timmar för alla termiska förändringar att försvinna. Detta minskar risken att blocket står inför kommer att glida under avbildning, vilket resulterar i dåligt anpassade bilder.
- Välj mikroskop parametrar för bildbehandling ansiktet seriellt. Se till att elektronstrålen har en spänning som är tillräckligt låg för att bara bilden ett mycket grunt djup av material i blocket ansiktet. Detta bör också betydligt grundare än tjockleken på ansiktet som ska tas bort. Typiska parametrar för bildbehandling finns spänningar mellan 1,2 - 2,0 kV med Pixel storlekar på mellan 4 - 20 Nm. Pixeln uppehållstiden måste hållas runt 10 μsecs så att den totala tiden att fräsa i ansiktet och få en bild är under 2 minuter (Figur 3).
4. Hemligheter till framgång
Steg 1) Se till att proverna inte är tjockare än 150 mikrometer. Detta kommer att möjliggöra tillräcklig penetration av olika fläckar och harts in i materialet. Detta kan uppnås genom sektionering av prov med en vibratome omedelbart efter upptagningen. Denna tjocklek är lämplig för hjärnvävnad. Andra vävnader måste testas för att säkerställa adekvat fixering och färgning.
Steg 3) Proverna måste vara fritt fördelas över hela lösningen, och inte hopklumpade tillsammans i en del av flaskan medan detta sekundära fixativ införs. Detta kommer att säkerställa maximal penetration av provet och minska provet blir förvrängd under denna fixering process. Detta uppnås genom att försiktigt snurra de prover inne i flaskan omedelbart efter det att lösningen har lagts till.
Steg 15) Se till att regionen av intresse ligger närmast under (<30 mikrometer) på ytan av blocket. Detta kommer att minska mängden fräsning av jonstrålen under bilden förvärvet fas.
Steg 22) De skanning tiden för jonstrålen måste adequte för att säkerställa att hela avbildning ansiktet är helt fräst. Otillräcklig fräsning visas som vita streck, eller "gardiner" som förekommer lodrätt ner avbildning ansiktet.
Steg 26) Den slutliga slipade ansikte måste vara större än det ansikte som är avbildade. Detta beror på att frästa harts matas ut från blocket och redeposits på blocket yta i omedelbar närhet. Detta redeposition kan inkräkta på avbildning synfält, och undviks genom malning ett mycket stort område än vad som avbildas. För en avbildning fönster som är 20 mikrometer bred, är den frästa blocket står inför större än 30 mikrometer bred.
Steg 29) Det är viktigt att elektronstrålen parametrar är sådana att bilden genereras av elektroner som uppstår från endast de första få nanometer av blockets yta. Detta är en acheved genom att minimera spänningen till under 2 kV och se till att inga elektroner tränga för långt. Detta är också hjälpt av att använda ett rutnät spänning på detektorn så att endast en elektron med den högsta energin bidrar till att den slutliga bilden. Normalt är ett rutnät spänning på 1,3 kV används för en avbildning spänning på 1,5 kV.
5. Representativa resultat:
Figur 1. Beredning av kåda blocket. A) Resin inbäddade koronalt avsnitt (80 mikrometer tjock) med hjälp av en vuxen råtta hjärnan ses i ett steromicroscope. Bilden visar tydligt de olika områden i hjärnan som kan klippas ut ur det avsnitt (b) med hjälp av en skalpell blad. Här är en 1 mm i kvadrat från cortex bort och (c) har fastnat i ett tomt harts block. D) harts blocket sedan putsas med ett glas kniven monterad i en ultramicrotome och när blocket har reducerats till endast lämna regionen av intresse (e), är ett steg skär vinkelrät mot den främre ytan av det inbäddade materialet.) f Hela trimmade regionen skärs sedan från resten av bas och monteras på en aluminium stöta redo för metallbeläggning och bildhantering i svepelektronmikroskop.
Figur 2. Förbereda blocket ansiktet för FIB / SEM avbildning.) A och B) visar illustrationer av blocket och den kant som är slipat för att skapa en avbildning ansiktet (anges med den svarta dubbelriktad pil). Placeringen av jonstrålar (vit) visas parallellt med bildbehandling ansiktet, och elektronstrålen (grå) visas slår ansiktet vid 54 ° till jonstrålar. C) visar en bild av blocket som tagits med elektronstråle och avbildade med den sekundära elektroner. Längs denna sida av kvarteret en mörkare region (markerad med streckad vit ruta) visar en del av ansiktet som har grovmalen (visas med dubbel-headDE svarta pilen) för att avslöja den underliggande provet. d) När denna region är avbildas med bara backscattered elektroner de inbäddade vävnaden kan ses. Här är hela bredden på det inbäddade vävnaden avsnittet anges med en ledning dubbel vit pil. Skala bar i c) är 100 mikrometer.
Figur 3. Imaging en volym hjärnvävnad med isotrop voxlar. A) Återförda kontrast backscattered bild av blocket ansiktet visar ultrastruktur inom en region av råtta hjärnan. Alla membran är synliga såväl som stora konstruktioner makromolekylära. B) Totalt 1600 bilder samlades in vid 5 nm avstånd resulterar i en bild stack med isotrop voxlar. C) Detta stacken kan avbildas på något plan med samma upplösning. Denna bild visar samma synaptisk anslutning som avbildas i XY-planet och YZ-planet.
Discussion
Tekniken att FIB / SEM fungerar optimalt när regionen av intresse inte är för stor. Den övre gränsen för ett avbildas volym beror på jonstrålen och det område som det kan konsekvent kvarn upprepade gånger under flera timmar. Hittills har detta gjorts med områden på cirka 60 x 60 mikron dock avbildning hela det här området är inte möjligt med en lämplig bildupplösning, främst på grund av tidsfaktorn samla in en så stor bild. Som ett exempel, en 4 KX 4 k bilden med en pixel uppehållstid till 10 mikrosekunder skulle ta 2 minuter och 40 sekunder att söka, och för ett synfält på 60 mikron detta skulle bara ge en pixelstorlek på 15 nm. För avbildning av ultrastruktur celler och vävnader, är en mindre pixelstorlek mer passande, vanligtvis mellan 4 och 10 nm / pixel. För ett område på 60 x 60 mikron bilden skulle köpas i 10 timmar, även om mikroskop hade denna förmåga. Av dessa skäl är mikroskopet ett perfekt verktyg för bild-volymer i storleksordningen 10 x 10 x 10 mikrometer, eller betydande delar av hela celler. Detta kan lätt göras inom en 48 timmars period på prover som är väl i kontrast till detta förfarande.
Hittills har det protokoll som har använts främst hjärnvävnad, samt olika typer av odlade däggdjursceller följa täckglas. Däremot kan fixering och färgningsproceduren användas tillsammans med många andra typer av biologiskt material, bland annat växtmaterial för att producera lika väl kontrasterade bild stackar.
Därför den största fördelen med denna teknik är dess förmåga att bildvolymer med isotrop voxlar. Bild staplar av denna typ möjliggör analyser av 3D-volym med bilder tagna på någon plan i stacken. Fördelen med detta är att låta betraktaren att bilden funktioner i bildserie från alla håll och ger en mer detaljerad bild (Figur 3).
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanoacrylate glue | |||
| Dissecting microscope: Leica MZ8 | Leica Microsystems | ||
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | ||
| FIB/SEM microscope (Zeiss, NVision 40) | |||
| Glass histology slides | Menzel-Glaser | AA00008032E | |
| Glass knife maker: Leica EM KMR2 | Leica Microsystems | ||
| Glass scintillation vials (20ml) | EMS | 72634 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16222 | |
| Jeweler’s saw | EMS | 72010 | |
| Mould separating agent | Glorex, Switzerland | 62407445 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19110 | |
| Paraformaldehyde | EMS | RT 19208 | |
| Phosphate salts for phosphate buffer | Sigma-Aldrich | 71642 and 71496 | |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | 20840 | |
| Sputter Coater with gold target | Cressington Co. | ||
| Tris base (TBS) | Sigma-Aldrich | T1378 | |
| Ultramicrotome: Leica UCT | Leica Microsystems | ||
| Uranyl acetate | EMS | RT 22451 |
References
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).
- Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue. J Microsc. 235, 336-347 (2009).
- Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy. PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).
