Summary
Bu protokol, taramalı elektron mikroskobu, reçine gömülü beyin dokusu, odaklanmış iyon demeti üç boyutlu olarak hazırlanmış ve yansıması nasıl açıklamaktadır.
Abstract
Bu protokol, ne biyolojik örnekler, beyin dokusu gibi, odaklanmış iyon demeti / taramalı elektron mikroskobu (FIB / SEM) kullanarak üç boyutlu olarak görüntülenmiş olabilir açıklar. Osmiyum tetroksit ve uranil asetat kullanarak aldehitler, ağır metal vitray örnekleri ile sabitlenir. Sonra alkol ile kurutulmuş ve daha sonra sertleşmiş reçine ile sızmış. Işık mikroskobu ve cam bıçak ile ultramicrotome kullanarak, yüzeye yakın bölgede faiz içeren küçük bir blok yapılır. Blok sonra FIB / SEM içine yerleştirilir ve iyon demeti, bu bölgeye yakın bloğunun bir tarafı boyunca kabaca değirmen dikey bir yüz için kullanılır. Saçılmış elektron temel yapıları görüntü kullanarak, daha küçük bir yüzü daha ince bir iyon demeti ile öğütülmüş ve yüzey görüntülü ve öğütülmüş tam yüz alanı belirlemek için daha yakından incelenmektedir. Daha sonra mikroskop parametreleri karşısında arka arkaya seri görüntüler blok hacmi ile toplanır, böylece öğütülmüş ve görüntülü şekilde ayarlanır. Görüntü yığını genellikle her yönde küçük bir 4 mil olarak boyutları ile izotropik vokseller içerecektir. Herhangi bir görüntü düzlemi Bu görüntü kalitesi, kullanıcı görüntü yığını içinde herhangi bir görüş açısı hücre ultrastrüktür analiz sağlar.
Protocol
1. Örnek fiksasyon ve reçine gömme
- , Taze doku ve hücreler örnekleri% 2 paraformaldehid en az 2 saat süreyle sabit ve% 2.5, 7.4 pH 0,1 M fosfat tamponu glutaraldehid. Örneklem büyüklüğü yeterli penetrasyon veya sabitleştirici izin 0.150 mm kalınlığında geçmemesi gerektiğini ve düzeltmenin 12 saatten daha uzun süre bırakılmamalıdır.
- Örnekleri, 20ml cam sintilasyon şişeleri yerleştirin ve onları 0.1M cacodylate tampon üç kez, her biri 5 dakika yıkayın.
- % 1.5 (w / v) 30 dakika için 0.1 M cacodylate tamponu (0.1 M, pH 7.4), potasyum ferrosiyanat ve% 1 (w / v) osmiyum tetroksit Leke.
- 30 dakika boyunca% 1.0 (w / v) 0.1M cacodylate tampon osmiyum tetroksit Leke.
- 3 dakika boyunca bir kez çift distile su ile durulayın.
- % 1 (w / v) 30 dakika çift distile su uranil asetat ile Leke.
- Çift distile su ile 5 dakika için bölümler durulayın ve kademeli alkol serisi her değişikliği (1 x% 50, 1 x% 70, 1 x% 90, 1 x% 95, 2 x% 100), 2 dakika sonra kurutmak.
- % 70,% 90,% 95 ve% 100:% 50 etanol içinde Durcupan başlayan etanol ile karışık Durcupan reçine her değişiklik, 30 dakika, artan konsantrasyonlarda göm, daha sonra takip.
- Taze Durcupan ile değiştirin ve 4 saat boyunca yavaş yavaş tahrik.
- Yeri bölümleri, kalıp ayırma maddesi ile kaplı ve 65 yer, cam mikroskoplar, ahşap, kokteyl çubukları slaytlar kullanarak 24 saat boyunca ° C fırın.
2. FIB / SEM için numune hazırlama
- Örnekleri içeren, iki cam mikroskop slaytlar arasında, reçine katmanı ayrı ve ayırıcı herhangi bir kalıp çıkarmak için iyice yıkayın.
- Düşük güç hedefleri ile bulaşan bir ışık mikroskobu kullanılarak, ya da reçine dilim içinde ilgi bölgeyi tanımlamak için, iletilen aydınlatma ile mikroskop diseksiyon.
- Jilet kullanarak ilgi bölge etrafında kare (3 mm x 3 mm) Kesme ve akrilik tutkal ile boş reçine blok (Şekil 1) üst sopa. Sertleşmesine tutkal için 5 dakika bekleyin ve sonra bir sonraki adıma devam.
- Ulramicrotome sahibi blok Kelepçe ve ekli stereomikroskopta kullanarak, bir jilet ile ilgi bölgenin çevresinde maddi kalıntıların sadece küçük bir piramit kadar kırpın.
- Ayrıca, ilgi bölgede tam saygı ile blok yüzeyinin (Şekil 1) boyutları bulunan, böylece ultramicrotome içine sabit bir cam bıçak kullanarak, blok kırpın. Bir kenarı blok kesme, dik bir adım örnek üzerinden kesilir (Şekil 1 ve 2), böylece ilgi bölgeye yakın. Bu adım, görüntüleme yüz (Şekil 2) oluşturur.
- Iletilen bir ışık mikroskobu kullanılarak, ultramicrotome ve fotoğraf blok içinde ilgi bölge blok çıkarın.
- Uzak kalan reçine saplama kesilmiş blok kesin. Bu bir kuyumcuya testere kullanılarak yapılan ve sadece küçük bir blok FIB / SEM içine yerleştirilmiş olmasını sağlar. Bu blokta toplam yüksekliği 5 mm'den fazla olmamalıdır.
- Tutkal Görüntülenecek tarafındaki en dış kenarına (Şekil 1) olmasını sağlamak karbon macun ile bir alüminyum saplama blok.
- Tutkal kuruduktan sonra, blok (> 20 nm; Cressington vakum evaporasyon sistemi) altın ince bir tabaka ile kaplayın.
3. FIB / SEM görüntüleme
- Düşük bir büyütme, ilgi ve blok tarafında seçtiğiniz bölge görüntülü böylece ikincil elektron görüntüleme (5 kV, 0.5 nAmp), şark blok kullanarak (Şekil 2 c, d) operatör karşı karşıya.
- Orient yüze görüntülü böylece blok freze ışınına paralel yatıyor. Bu, elektron ışını, bu yüz ila 54 ° (Şekil 2 b) yönelik anlamına gelecektir.
- 13 iyon demeti akımı kullanma - 30 kV 27 nAmps Görüntülenecek bölgenin ön reçine dar bir bant çıkarın.
- Ilgi bölge üzerine, öğütülmüş yüz görüntülemek için saçılmış görüntüleme moduna geçin.
- (Şekil 2) öğütülür ve yansıması blok tam bir bölge bulmak ışık mikroskobu referans görüntü (adım 16 yaşında çekilmiş) ve öğütülmüş yüz görüntü kullanma.
- Mevduat faiz bölge (Şekil 2) Yukarıdaki blok yüzeyine, mikroskop gaz enjeksiyon sistemi kullanarak karbon (veya metal) bir koruyucu tabaka (yaklaşık 1 mikron kalınlığında).
- 700 picoAmps, ince değirmen son görüntüler alınacaktır blok içinde bölgede bir akım kullanılması.
- Freze ışın tamamen değirmen bu görüntü yüzü hiç freze eserler karşısında görülebilir kadar bırakın. Yüz tam bir değirmen tüm görüş alanı genelinde sonraki her görüntü değişiklikleri gözlemleyerek kontrol edilir. Yetersiz freze vertica görünen beyaz çizgiler veya 'perde' olarak görülmektedir.lly görüntü.
- Mikroskop dağıtmak için herhangi bir termal değişiklikler için en az 2 saat bekletin. Bu blok yüz hizalanmamıs görüntüler sonuçlanan görüntüleme sırasında sürüklenme riskini azaltır.
- Yüz seri görüntüleme için mikroskop parametreleri seçin. Elektron ışını blok karşısında malzemenin bir çok sığ bir derinliğe sadece görüntü için yeterince düşük bir gerilim olduğundan emin olun. Bu aynı zamanda kaldırılacak yüz kalınlığı daha çok sığ olmalıdır. Görüntüleme için tipik parametreler 1.2 arasında gerilimleri - 2,0 kV arasındaki piksel boyutları ile 4 - 20 nm. Piksel değirmen yüzü ve tek bir görüntü elde toplam süre (Şekil 3) 2 dakika altında tutulur, böylece yaklaşık 10 μsecs tutulmalıdır zamana ihtiyacı yaşamak.
4. Başarının sırları
Adım 1) numuneleri 150 mikrondan daha kalın olmadığından emin olun. Bu malzemenin içine farklı lekeleri ve reçine yeterli penetrasyon sağlayacaktır. Bu fiksasyonun hemen sonra bir vibratome örnekleri kesit elde edilebilir. Bu kalınlığı, beyin dokusu için uygun . Diğer dokulara yeterli fiksasyon ve boyama sağlamak için test edilmesi gerekir.
Adım 3) Numuneler çözüm boyunca özgürce dağıtılan ve bu ikincil fiksatif tanıtıldı flakon bir parçası birlikte clumped olmalıdır. Bu örnek maksimum penetrasyon sağlamak ve bu tespit işlemi sırasında bozuk olma örnek azaltacaktır. Bu örnekleri çözüm eklenir hemen sonra flakon içinde yavaşça dönen elde edilir.
Adım 15) ilgi bölgesi (<30 mikron) altında hemen blok yüzeyinde yer olduğundan emin olun. Bu görüntü toplama aşamasında, iyon ışını tarafından freze miktarını azaltır .
Adım 22) iyon demeti tarama süresi, tüm görüntüleme yüzü tamamen öğütülmüş olduğundan emin olmak için adequte olması gerekiyor . Yetersiz freze görüntüleme yüz aşağı dikey olarak görünen beyaz çizgiler ya da 'perde' olarak gösterilir .
Adım 26) son öğütülmüş yüze görüntülü bir yüz daha büyük olmalıdır. Bu öğütülmüş reçine, blok ve blok yüzeyine yakın çevresinde redeposits atılır çünkü . Bu redeposition görüntüleme sahaya tecavüz ve görüntülü olan daha bir çok geniş bir alana öğütülmesi ile önlenmiş olur. 20 mikron genişliğinde bir görüntü penceresi için, öğütülmüş blok yüz 30 mikron genişliğinde daha büyüktür.
Adım 29), elektron ışını parametreleri görüntü blok yüzeyinin yalnızca ilk birkaç nanometre çıkan elektronlar tarafından oluşturulan bu tür kritik . Bu acheved 2'nin altında kV gerilim en aza indirmek ve hiçbir elektron çok uzak nüfuz sağlamak. Bu aynı zamanda en yüksek enerjiler ile sadece elektron nihai görüntü katkıda bulunmak, böylece dedektör üzerinde bir ızgara gerilimi kullanarak katkıda bulunuyor. Tipik olarak, bir ızgara gerilimi 1,3 kV, 1,5 kV bir görüntüleme gerilim için kullanılır .
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1 reçine blok hazırlanması a) Reçine bir steromicroscope görüntülenen bir yetişkin sıçan beyin ile koronal bölümünde (80 mikron kalınlığında) gömülü. Görüntü net bir neşter bıçak kullanarak bölümünde (b) kesilebilir farklı beyin bölgeleri gösterir. Burada, korteks 1 mm kare kaldırılır ve (c), d) Daha sonra reçine blok, bir ultramicrotome monte edilmiş bir cam bıçakla kesilmiş ve bir kez blok sadece terk etmek düşürüldü boş bir reçine blok yapışmış ilgi bölgesi (e), bir adım f) gömülü malzemenin ön yüzeyine dik kesilmiş kesilmiş Bu tüm bölge daha sonra reçine geri kalanından kesilir ve bir alüminyum metal kaplama için hazır saplama ve görüntüleme üzerine monte taramalı elektron mikroskobu.
Şekil 2). FIB / SEM görüntüleme blok yüz hazırlanması ve b) blok ve görüntüleme yüz (siyah çift başlı bir ok ile gösterilen) oluşturmak için öğütülmüş kenarına resimler göstermek. Iyon demeti (beyaz) konumunu görüntüleme yüze paralel olarak gösterilir ve elektron ışını (gri), 54 ° iyon demeti yüz isabet gösterilir. C), elektron ışını ile çekilen blok bir görünümdür. ve ikincil elektronlar ile görüntülenmiş. Bu yan blok boyunca koyu kabaca öğütülmüş yüz bölgesi (noktalı beyaz bir kutu ile gösterilir) bir kısmını gösterir (çift kafalı gösterilened siyah ok) altta yatan bir örnek ortaya çıkarmak için d) bu bölgede sadece saçılmış elektron kullanarak görüntülü gömülü doku görülebilmektedir . Burada gömülü doku bölümün tam genişliğinde çift başlı bir beyaz ok ile gösterilir. C scale bar), 100 mikron .
Şekil 3 görüntülenmesi izotropik vokseller ile beyin dokusunun hacmi. A) sıçan beyin bir bölge içinde ultrastrüktür gösteren blok yüz kontrast saçılmış görüntü Ters. Tüm membranlar görünür yanı sıra büyük makromoleküler yapıları vardır. B) 1600 görüntülerin toplam 5 nm aralığı izotropik vokseller c) Bu yığın aynı çözünürlüğe sahip herhangi bir düzlemde yansıması ile sonuçlanan bir görüntü yığını toplanmıştır . Bu görüntü, xy düzlemi ve yz düzleminde görüntülü tek sinaptik bağlantı gösterir.
Discussion
Ilgi bölgede çok büyük değilken FIB / SEM tekniği en iyi şekilde çalışır. Görüntülü bir hacim için üst limit iyon ışını ve alana bağlı olduğunu, uzun çalışma saatleri boyunca tekrar tekrar sürekli değirmen. Şimdiye kadar bu alanlarda yaklaşık 60 x 60 mikron yapıldı, ancak, görüntüleme tüm bu alanda, uygun bir görüntü çözünürlüğü ile böyle büyük bir görüntü toplama zaman faktörü nedeniyle mümkün değildir. Bir örnek olarak, bir pikselin ile 4 kx k 4 görüntü 10 mikrosaniye zaman 2 dakika ve 40 saniye kazanmak için alacağını ve 60 mikron bakış bir alan için bu sadece bir piksel boyutu 15 nm verecek yaşamak. Ultrastrüktür hücre ve doku görüntüleme için daha küçük bir piksel boyutu daha uygundur; genellikle 4 ve 10 nm / piksel arasında. Mikroskop bu yeteneği olsa bile görüntü 60 x 60 mikron bir alan için, 10 saat içinde kazanılmış olacaktır. Bu nedenlerden dolayı, mikroskop, görüntü birimleri için 10 x 10 x 10 mikron, ya da bütün hücrelerinin önemli bölgelerinde sırasını ideal bir araçtır. Bu, 48 saatlik bir süre içinde bu yordamı ile tezat örnekler üzerinde kolayca yapılabilir.
Şimdiye kadar ağırlıklı olarak beyin dokusu lamelleri için kalarak kültür memeli hücrelerinin yanı sıra, çeşitli türleri ile protokol olmuştur. Ancak, fiksasyon ve boyama işlemi eşit derecede iyi kontrastlı görüntü yığınları üretmek için bitki materyali de dahil olmak üzere diğer birçok türde, biyolojik madde ile birlikte kullanılabilir.
Bu nedenle bu tekniğin ana avantajı izotropik vokseller ile görüntü birimleri için kapasitesini. Bu tür görüntü yığınları, yığın içinde herhangi bir düzlemde alınan görüntüleri kullanarak 3d bir hacim analizleri için izin verir. Bu yarar, herhangi bir yönden gelen görüntü serisi ve daha büyük bir görüntü ayrıntısı (Şekil 3) sağlayan görüntü özellikleri gözlemci izin vermektir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanoacrylate glue | |||
| Dissecting microscope: Leica MZ8 | Leica Microsystems | ||
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | ||
| FIB/SEM microscope (Zeiss, NVision 40) | |||
| Glass histology slides | Menzel-Glaser | AA00008032E | |
| Glass knife maker: Leica EM KMR2 | Leica Microsystems | ||
| Glass scintillation vials (20ml) | EMS | 72634 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16222 | |
| Jeweler’s saw | EMS | 72010 | |
| Mould separating agent | Glorex, Switzerland | 62407445 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19110 | |
| Paraformaldehyde | EMS | RT 19208 | |
| Phosphate salts for phosphate buffer | Sigma-Aldrich | 71642 and 71496 | |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | 20840 | |
| Sputter Coater with gold target | Cressington Co. | ||
| Tris base (TBS) | Sigma-Aldrich | T1378 | |
| Ultramicrotome: Leica UCT | Leica Microsystems | ||
| Uranyl acetate | EMS | RT 22451 |
References
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).
- Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue. J Microsc. 235, 336-347 (2009).
- Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy. PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).
