Summary
このプロトコルは、樹脂の埋め込み脳組織を走査型電子顕微鏡、集束イオンビームの3次元で準備し、画像化する方法について説明します。
Abstract
このプロトコルは、どのように生物学的サンプルは、脳組織のように、集束イオンビーム/走査型電子顕微鏡（FIB / SEM）を用いて3次元でイメージングすることができますについて説明します。サンプルは、四酸化オスミウムと酢酸ウラニルを用いてアルデヒド類、重金属で染色して固定されています。そして、彼らはアルコールで脱水し、硬化される樹脂、で浸潤。光学顕微鏡とガラスナイフを持つウルトラミクロトームを用いて、表面に近い領域の関心を含む小さなブロックが行われます。ブロックが次にFIB / SEM、およびブロックの片側に沿ってほぼ工場の垂直面をするために使用されるイオンビーム内に配置され、この地域に近い。画像基本的な構造をして後方散乱電子を用いて、小さな顔は、細かいイオンビームで粉砕し、表面には、イメージングと粉砕される顔の正確な領域を決定するために、より密接に吟味されている。顕微鏡のパラメータは、シリアル画像がブロックのボリュームを介して収集されるように顔が繰り返し粉砕し、結像されるように設定されています。画像のスタックは通常、各方向に小さな4 nm程度の寸法と等方性ボクセルが含まれます。任意の撮像面でこの画質は、ユーザーが画像スタック内の任意の視野角でセルの超微細構造を分析することができます。
Protocol
1。サンプルの固定と樹脂の埋め込み
- 新鮮な組織や細胞のサンプルを2％パラホルムアルデヒド中で少なくとも2時間固定し、pH7.4の0.1 Mリン酸緩衝液中2.5％グルタルアルデヒドされています。サンプルサイズが十分浸透または固定を可能にするために厚さ0.150ミリメートルを超えてはならない、と12時間以上の修正に配置したままにしないでください。
- 20ミリリットルのガラスシンチレーションバイアルにサンプルを配置し、それらに0.1Mカコジル酸緩衝液で3回、5分ごとに、すすいでください。
- 30分間、0.1Mカコジル酸緩衝液（0.1M、pH7.4）中1.5％（w / v）のフェロシアン化カリウムと1％（w / v）の四酸化オスミウムで染色。
- 30分間0.1Mカコジル酸緩衝液で1.0％（w / v）の四酸化オスミウムで染色。
- 3分間蒸留水で一度すすいでください。
- 30分間二重蒸留水の1％（w / v）の酢酸ウラニルで染色。
- 段階的なアルコールのシリーズ、2分ごとに変化（1 × 50％、1 × 70％、1 × 90％、1 × 95％、2 × 100％）で脱水後、蒸留水で5分間のセクションをすすぎ、と。
- 70％、90％、95％、次いで100％エタノールで50％Durcupanから始まるエタノール混合Durcupan樹脂、それぞれの変更30分、濃度の増加に埋め込む、その後に続く。
- 新鮮なDurcupanと交換し、4時間ゆっくり振とうする。
- 場所のセクション、金型分離剤を塗布した、と65の場所ガラスの顕微鏡で、木製のカクテルの棒をスライドを使用して24時間℃のオーブン。
2。 FIB / SEM用サンプルの準備
- 二枚のガラスの顕微鏡スライドの間から、サンプルを含む、樹脂層を分離し、エージェントを分離し、任意の型を削除するには徹底的に洗ってください。
- 低消費電力の目標に透過光顕微鏡を使用して、または樹脂のスライス内に関心領域を識別するために、透過照明で顕微鏡を解剖。
- カミソリの刃を使用して、関心領域の周りに小さな（3mm × 3mmの）正方形を切り取り、アクリル接着剤で空白樹脂ブロック（図1）の上部にこれを貼り付けます。硬化への接着のために5分待ってから、次のステップに進みます。
- ulramicrotomeのホルダーにブロックを固定し、付属の実体顕微鏡を用いて、物質の残物の唯一の小さなピラミッドまで、カミソリの刃で対象領域の周囲にトリム。
- さらに、関心領域を正確に基準にしてブロックの表面（図1）の寸法を配置できるように、ウルトラミクロトームに固定されたガラスナイフを使用して、ブロックをトリム。ブロックの一方の端をカット、垂直のステップはサンプル（図1および2）で切断されるように、関心領域に近い。このステップでは、画像面（図2）を形成する。
- 透過光顕微鏡を用いて、ウルトラミクロトームと写真ブロック内の関心領域からブロックを削除します。
- 残りの樹脂のスタブからトリミングされたブロックをカット。これは、宝石商の鋸を使用して行われ、唯一の小さなブロックがFIB / SEMの内部に配置されることが保証されている。このブロックの全体の高さは5mmを超えてはなりません。
- イメージを作成する側は、最も外側のエッジ（図1）にあることを確実にカーボンペーストをアルミスタブに接着剤がブロック。
- 接着剤が乾燥した後、金の薄層（> 20 nmの、クレッシントンの真空蒸着装置）でコーティングブロックを。
3。 FIB / SEMのイメージング
- 関心とブロックの側面の選択された領域が撮像されるように、低倍率で、そして二次電子を用いてイメージング（5kVの、0.5 NAMP）、オリエントブロックは演算子（図2のC、D）を直面している。
- オリエントは、顔を撮像するようにブロックが加工ビームと平行に位置しています。これは、電子ビームがこの面に54 °（図2 B）に配向していることを意味します。
- 13の現在のイオンビームを使用して - 30 kVで27 NAMPSは、撮像しようとする領域の前面から樹脂の狭いバンドを削除します。
- 関心領域を覆う粉砕顔を表示するには、後方散乱イメージングモードに切り替えます。
- （図2）粉砕し、撮像されるブロックの正確な領域を見つける光顕微鏡の基準画像（ステップ16で撮影）と粉砕顔の画像を使用する。
- 関心領域（図2）の上に、ブロックの表面に、顕微鏡のガス噴射システムを使用して、炭素（または金属）の保護層（約1ミクロンの厚さ）を、入金。
- 700ピコアンペア、細かく粉砕最後の画像が撮影される内のブロックの領域の現在の使用。
- はミリングアーティファクトが顔に見られないようになるまで完全に工場この画像の顔に加工ビームを残す。顔の完全な工場は、視野全体にわたって続く各画像の変化を観察することによってチェックされます。不十分な加工もverticaに現れる白い縞や"カーテン"として見ることができるLLYイメージに。
- 放散させるためにどのような熱変化のための少なくとも2時間顕微鏡を残す。これはブロック面の位置がずれて画像になって、撮像中にドリフトするというリスクを軽減します。
- 顔シリアルイメージングのための顕微鏡のパラメータを選択します。電子ビームは、ブロック面の材料の非常に浅い深さだけのイメージに十分に低い電圧を持っていることを確認してください。これも削除する顔の厚さよりもはるかに浅くする必要があります。 4の間のピクセルサイズを持っている2.0 kVの - - 20 nmのイメージングのための典型的なパラメータは、1.2との間の電圧です。ピクセルは、工場の顔をにして、1つのイメージを取得する総時間は（図3）2分未満に維持されるように、10μsecs周りに保持する時間のニーズに住む。
4。成功の秘訣
ステップ1）のサンプルが150ミクロンより厚くはないことを確認します。これは、材料にさまざまな汚れや樹脂の十分な浸透が可能になります。これは、すぐに固定した後、ビブラトームで試料をセクショニングすることによって達成することができます。この厚さは、脳組織に適しています。他の組織は、適切な固定と染色を確保するためにテストする必要があります。
ステップ3）試料は、自由にソリューション全体に分布し、そしてこの二次固定剤が導入されている間バイアルの一部で一緒に凝集しないようにする必要があります。これは、サンプルの最大の浸透を確保し、この固定の過程で歪んになるサンプルが削減されます。これは、穏やかに解決策が追加された直後にバイアル内のサンプルを旋回することによって達成される。
ステップ15）関心領域は、（<30ミクロン）のすぐ下のブロックの表面に配置されていることを確認してください。これにより、画像取得の段階でイオンビームによる加工量が削減されます。
ステップ22）イオンビームの走査時間は、全体像の顔が完全に粉砕されていることを確認するadequteにする必要があります。不十分な加工は、画像面に垂直に現れる白い縞、または"カーテン"として表示されます。
ステップ26）最後のミルドフェースは、画像化されている顔よりも大きい必要があります。粉砕された樹脂がすぐ近くにあるブロックの表面にブロックとredepositsから排出されるためです。この再堆積は、撮影視野に侵害することができる、とイメージされるよりもはるかに大きな面積を粉砕することによって回避される。 20ミクロン幅の画像ウィンドウでは、粉砕されたブロック面は、30ミクロン幅より大きいです。
ステップ29）これは、電子ビームのパラメータは画像がブロックの表面の唯一の最初の数ナノメートルから出てくる電子によって生成されるようになっていることが重要です。これは、以下の2 kVの電圧を最小限にしていない電子が離れすぎて浸透しないようにすることで、acheved。これはまた最も高いエネルギーを持つ唯一の電子は、最終イメージに貢献するように検出器のグリッド電圧を使用することによって助けられます。通常は、1.3 kVのグリッドの張力は、1.5 kVのイメージング電圧に使用されます。
5。代表的な結果：
図1樹脂ブロックの準備が。）樹脂はsteromicroscopeで表示成体ラットの脳の冠状断面（80ミクロン厚い）を埋め込 まれた。画像は明らかにメス刃を用いて節（b）からカットすることができます別の脳領域を示しています。ここでは、皮質から1mmの正方形は削除され、（C）ブランク樹脂ブロックにスタックしています。D）樹脂ブロックは、ウルトラミクロトームに取り付けられたガラスナイフでトリミングされ、そして一度ブロックだけを残すために削減されています関心領域（E）、ステップが埋め込 まれた材料の表面に対して垂直にカットされるが。f）この全体のトリミング領域は、その後に金属のコーティングとイメージングを処理する準備が樹脂の残りの部分から切断し、アルミニウムのスタブ上にマウントされています走査型電子顕微鏡。
図2。）。FIB / SEMイメージングのためのブロック面を準備し、b）のブロックと画像の顔を（黒双方向の矢印で示される）を作成するために粉砕され、エッジのイラストを表示。イオンビーム（ホワイト）の位置は、撮像面に平行に表示されており、電子ビーム（灰色）は、イオンビームに54 °で顔を打つ示されている。c）は電子ビームで撮影されたブロックのビューを示しています。と二次電子で撮像。ブロックのこの側面に沿ってより暗い領域（点線の白いボックスで示されている）ほぼ粉砕された顔の一部を示しています（ダブルヘッドで表示ED黒い矢印）が基本となるサンプルを明らかにする。d）この領域が埋組織を見ることができる唯一の反射電子を用いて画像化されている場合。ここでは、埋め込まれた組織切片の全幅は、二重頭の白い矢印で示されている。 cのスケールバー）は100ミクロンです。
図3。イメージング等方性ボクセルによる脳組織の容積。）ラットの脳の領域内の超微細構造を示すブロック面のコントラスト後方散乱画像を反転。すべての膜は、目に見えるだけでなく、大型の高分子構造です。B）1600の画像の合計は等方性ボクセルによる画像のスタックに、その結果が5nm間隔で収集された。c）このスタックは、同じ解像度を持つ任意の平面上に結像することができます。この画像は、xy平面、yz平面上に結像される単一のシナプス結合を示しています。
Discussion
関心領域が大きすぎるではない場合FIB / SEMの手法は、最適に動作します。画像化されたボリュームの上限は、イオンビームとそれが多くの時間以上繰り返し圧延一貫してできる領域に依存する。今のところ、これが約60 × 60ミクロンの領域で行われている、しかし、画像はこの領域全体では、適切な画像解像度と大きな画像を収集する時間的要因が主な要因は不可能である。ピクセルと例4 KX 4 Kのイメージとして10マイクロ秒までの滞留時間を取得するには、2分40秒かかります、と60ミクロンの視野のために、これはわずか15ナノメートルのピクセルサイズを与えるだろう。イメージング、細胞と組織の超微細構造の場合は、小さい画素サイズがより適している;通常4〜10nmの/ピクセル間。 60 × 60ミクロンの領域のために画像は顕微鏡がこの能力を持っている場合でも、10時間で取得される。これらの理由から、顕微鏡で10 × 10 × 10ミクロン、または全細胞の有意な地域のために画像のボリュームに最適なツールです。これは簡単に、この手順でうまく対比されているサンプルに48時間の期間内に行うことができます。
これまでのプロトコルは、脳組織だけでなく、カバーガラスに付着している哺乳動物培養細胞の様々なタイプで主に使用されています。しかし、固定と染色の手順は同様に、コントラストの画像スタックを生成するために植物材料を含む生物学的材料の他の多くの種類、使用することができます。
したがって、この手法の主な利点は、等方性ボクセルによる画像のボリュームにその容量です。このタイプの画像のスタックは、スタック内の任意の平面で撮影した画像を使って3Dボリュームの分析が可能になります。これの利点は、あらゆる方向からの画像シリーズで、より大きなイメージの詳細（図3）を提供する画像の特徴にオブザーバをできるようにすることです。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanoacrylate glue | |||
| Dissecting microscope: Leica MZ8 | Leica Microsystems | ||
| Durcupan resin | Sigma-Aldrich | ||
| FIB/SEM microscope (Zeiss, NVision 40) | |||
| Glass histology slides | Menzel-Glaser | AA00008032E | |
| Glass knife maker: Leica EM KMR2 | Leica Microsystems | ||
| Glass scintillation vials (20ml) | EMS | 72634 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16222 | |
| Jeweler’s saw | EMS | 72010 | |
| Mould separating agent | Glorex, Switzerland | 62407445 | |
| Osmium tetroxide | EMS | 19110 | |
| Paraformaldehyde | EMS | RT 19208 | |
| Phosphate salts for phosphate buffer | Sigma-Aldrich | 71642 and 71496 | |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | 20840 | |
| Sputter Coater with gold target | Cressington Co. | ||
| Tris base (TBS) | Sigma-Aldrich | T1378 | |
| Ultramicrotome: Leica UCT | Leica Microsystems | ||
| Uranyl acetate | EMS | RT 22451 |
References
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).
- Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue. J Microsc. 235, 336-347 (2009).
- Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy. PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).
