Summary
Nukleosomen ELISA (NU-ELISA) är en känslig och kvantitativ metod för att upptäcka globala mönster av post-translationella modifieringar i förberedelserna av infödda, intakt nukleosomer. Dessa ändringar omfattar methylations, acetylations och fosforyleringar vid specifika histon aminosyrarester, och därmed NU-ELISA ger en global proteomik analys av den totala kromatinet modifiering tillstånd av specifika celltyper.
Abstract
Genomet hos eukaryoter existerar som kromatin som innehåller både DNA och proteiner. Den grundläggande enheten i kromatin är nukleosomen, som innehåller 146 baspar i DNA i samband med två vardera histoner H2A, H2B, H3 och H4 1. Den N-terminala svansar av histoner är rika på lysin och arginin och modifieras efter transkriptionellt genom acetylering, metylering och andra post-translationella modifieringar (PTMs). Den PTM konfigurationen av nukleosomer kan påverka transkriptionell aktivitet förknippas DNA, vilket ger ett läge av genreglering som är epigenetisk i naturen 2,3. Vi utvecklade en metod som kallas nukleosomen ELISA (NU-ELISA) för att kvantitativt fastställa det övergripande PTM underskrifter nukleosomer ur celler. NU-ELISA är känsligare och kvantitativa än Western blotting, och är användbart för att förhöra den epiproteomic tillstånd av specifika celltyper. Denna video tidskriftsartikel visar detaljerade förfaranden för att utföra NU-ELISA analys.
Protocol
1. Däggdjursceller Kultur
NU-ELISA kan utföras på alla däggdjur celltyp som kan odlas i kultur. Vi föredrar att förbereda måttliga till stora partier av celler så att nukleosomer kan isoleras i tillräcklig mängd för att förbereda flera identiskt laddade ELISA-plattorna, vilket möjliggör analyser med flera olika antikroppar (ABS). Följande kulturen skalor tillhandahåller omfattande material:
För musen embyronic stamceller odla en eller två 15 cm plattor av celler utan feeder celler. För fibroblaster, växa från 5 till 10 15 cm plattor till sammanflödet.
2. Isolering av Nuclei
Notera: Alla stegen är på is med redan kyld buffertar, förutom vad som anges.
- Trypsinize celler med 3 ml trypsin per platta, kombinera och tillsätt 20 ml iskall PBS / butyrat. Centrifugera vid 1000 rpm i 5 min.
- Resuspendera cellerna i 10 ml PBS / butyrate och centrifugera vid 1000 rpm i 5 min.
- Resuspendera i 4 ml lyseringsbuffert med proteashämmare (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce homogenisera 20 slag med typ B stöt på is.
- Centrifugera vid 2000g i 10 min vid 4 ° C. (Supernatanten innehåller cytoplasma, som inte behövs för detta protokoll, men det kan sparas för andra ändamål om så önskas).
- Suspendera pelleten i 2 ml iskall tvättbuffert C (med proteashämmare).
- Layer den suspenderade materialet över 5 ml 30% sackaros kudde, sedan centrifugera vid 2400g i 5 minuter i en svängig hink rotor. Kärnor kommer att migrera till kudde, och skräp kvar på gränssnittet.
- Ta bort alla vätskevolym noggrant och resuspendera kärnor i 250 l iskallt tvättbuffert C + proteashämmare.
3. Isolering av nukleosomer med in situ Micrococcal nukleasfritt (MNase) Matsmältning
Vi använder ett förfarande där kromatin rötas på plats inom atomkärnor genom att ingjuta dem med MNase, följt av en hypoton behandling för att köra gratis intakt nukleosomer i supernatanten.
- Tillsätt 3 l 0,1 M CaCl 2 till provet. Sätt i 37 ° C värme block. Låt anta 37 ° C temperatur.
- Tillsätt 2 enheter MNase (Micrococcal nukleasfritt, Sigma-Aldrich, upplöst i 2 units/10μl i MNase buffert), sedan inkubera vid 37 ° C i 12 min, med täta blandning med hjälp av en pipett spets.
- Tillsätt 6 ìl av 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0 för att stoppa reaktionen. Sätt på is.
- Centrifugera vid 2000g i 4 min, kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 300 l 0,2 mM Na-EDTA. Förvara på is för 1 h med enstaka milda pipeting. (Dessa hypotoniska villkor befria fri nukleosomer från kärnor).
- Centrifugera vid 3000 g under 4 minuter vid 4 ° C. Spara supernatanten, som innehåller fria nukleosomer, på is.
- Suspendera pelleten igen med 300 l 0,2 mM Na-EDTA. Förvara på is för 1 h med enstaka milda pipeting.
- Centrifugera vid 3000g för 4min vid 4 ° C. Behåll supernatanten och kombinera med det första supernatanten från steg 5. Den resulterande mononucleosome preparat kan alikvoteras och förvaras vid -80 ° C.
OBS: Mängden kromatin kan grovt kvantifieras genom att mäta absorbansen vid 260 nm i en 10 l Provet överförs till 990 l vatten. En 260 = 10 (efter justering för 1 / 100 utspädning) motsvarar ungefär 1mg/ml av kromatin. Också, under ovan, kan små prover sparas och senare analyseras för deras DNA innehåll för att kontrollera kvaliteten och omfattningen av MNase digestions, som främst bör innehålla DNA från 146 bp lång. Laddering är ett tecken på ofullständig MNase matsmältning.
OBS: Fig.1 innehåller en diagrammed sammandrag av kärnkraft isolering och digestions MNase steg.
4. Nukleosomen-ELISA (NU-ELISA)
Vi upptäcker PTMs på fraktioner som innehåller infödda intakt nuclesosomes som varit uppbunden på 96 och ELISA mikrotiterplattor. För varje prov, gör vi en serie 2-faldigt spädningar, och dessa är belagda på brunnar i tre exemplar.
- Coat MaxiSorp plattorna vid 4 ° C med 50 l / brunn av nukleosomer utspätt i coatingbuffert. Förslag på seriella dubbla utspädningar av nukleosomer är beredda från översta raden till den nedersta raden genom att lägga till 0,1 mikrogram, 0,05 mikrogram, 0,025 mikrogram, 0,0125 mikrogram, 0,00625 mikrogram, 0,00313 mikrogram, 0,00156 mikrogram, med coatingbuffert bara (0 mikrogram kromatin) i botten rad. (Anmärkning: plåt täcker behövs för detta steg.)
- På morgonen, tvätta plattorna 4 gånger med 200 l / brunn PBS/0.5% Tween-20 i rumstemperatur (RT) för sammanlagt 10 min med en tallrik bricka.
- Block 1 tim vid RT med 100 l / brunn PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA.
- Avlägsna den blockerande buffert genom att skaka den inverterade plattan rasktöver ett handfat. Täck över och förvara plattorna vid -20 ° C, eller gå direkt till nästa steg.
- Tillsätt 1 ° abs i en volym på 50 l / brunn utspädd 1:1000 (eller efter behov) i PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA, inkubera vid RT för 1 timme på en rotator.
- Tvätta plattorna 4 gånger med 200 l / brunn PBS/0.5% Tween-20 vid RT och sammanlagt 10 min i en tallrik bricka.
- Lägg peroxidas pepparrot (HRP)-konjugerade 2 ° Abs, utspädd 1:5000 (eller om det behövs) i PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA RT för en timme på en rotator.
- Tvätta plattorna 4 gånger med 200 l / brunn PBS/0.5% Tween-20. Varje tvätt vid RT och för totalt 10 minuter med en tallrik bricka.
- Utveckla plattorna genom att tillsätta 50 ìl av TMB substrat till varje brunn i 10 min vid RT. Stoppa reaktionen genom tillsats av 50 l / brunn av 2N H 2 SO 4 och läs plattorna 450 nm. (Tips: Centrifugera vid 1500 rpm i 2 minuter på en platta rotor att skingra eventuella luftbubblor i brunnarna före läsning absorbanserna).
- Exportera avläsningar till kalkylblad filer för kvantitativa och statistiska analyser.
Reagenser
| PBS / butyrat |
| 135 mM NaCl |
| 2,5 mM KCl |
| 8 mM Na 2 HPO 4 |
| 1,5 mm KH 2 PO 4 |
| 10 mM Na-butyrat |
| Lyseringsbuffert |
| 250 mm sackaros |
| 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 |
| 10 mM Na-butyrat |
| 4 mm MgCl 2 |
| 0,1% Triton X-100 |
| Tvättbuffert C |
| 250 mm sackaros |
| 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 |
| 10 mM Na-butyrat |
| 4 mm MgCl 2 |
| Sackaros Kudde |
| 30% (w / v) sackaros i tvättbuffert C |
| Microccocal nukleasfritt Buffer |
| 5 mM NaPO 4 buffert, pH 7,0 |
| 0,025 mM CaCl 2 |
| Coatingbuffert |
| 80 ml lösning A + 170ml Lösning B + 250ml dH 2 O |
| Lösning A: 0,2 M Na 2 CO 3 |
| Lösning B: 0,2 M NaHCO 3 |
5. Representativa resultat
Med hjälp av NU-ELISA metod, en serie av flera identiska plattor är beredda, som kan laddas med kromatin upprättats i form av mononucleosomes. Vi förbereder typiskt serie identiskt laddade plattor så att varje kan sonderas med olika anti-PTM specifika antikroppar (ABS). Vi har också alltid att utarbeta en platta som kan sonderas med en Ab som upptäcker histoner utan hänsyn till att de ändras statens totala kromatin lastning kontroll. Denna kontroll är nödvändig för att sedan kvantitativt jämföra PTM innehåll nukleosomer framställs av olika prover. För att kvantifiera halten av PTMs inom en viss kromatin prov vi rätta till det råa absorbansvärden som använder denna metod: Först, subtrahera vi någon bakgrund signal med hjälp av värden som erhålls från kontrollbrunnarna som inte innehåller kromatin (bakgrund är oftast försumbar). Vi standardisera då PTM-specifika signaler till NU-ELISA resultaten från en identiskt laddade plattan som analyseras med en Ab som upptäcker nukleosomer oberoende av ändringen stat. (Vi har använt polyklonala Abs specifika för histoner H2A eller H2B för detta ändamål). Vi bestämmer då medelvärden och varianser för varje utspädning av kromatin och använda data från den linjära delen av ELISA-analysen. Detaljerade exempel på NU-ELISA matematiska och statistiska analyser har tidigare rapporterat 4
Figur 1. Schematisk diagam av NU-ELISA steg. A. däggdjursceller skördas, B. kärnor separeras från cellerna genom Dounce homogenization, Störd C. celler lastas på toppen av en 30% w / v sackaros kudde, D. Efter centrifugering är kärnor deponeras i pellets, E, F. Chromatin smälts på plats för att främst mononucleomes av MNase, G, H , jag. Lösliga mononucleosomes utvinns av hypoton behandling och upprepade centrifugering av kvarvarande kärnämne. från olika urval J. Mononucleosomes (märkt samp. 1 och 2 i detta fall) är belagd mikroteststrips brunnar i serie identiskt laddade plattor och förhördes med PTM-specifika Abs och PTM-oberoende Abs att bestämma totala kromatin lastning. K. Avbildningar av upptäckt differentiell signal nivåer i två prov som skiljer sig åt i PTM innehåll har ännu likartad total kromatin innehåll, som bedöms av anti-H2B immunreaktivitet.
Discussion
NU-ELISA ger en metod att fastställa den globala status nukleosomen PTMs finns inom en viss celltyp. NU-ELISA studier har visat att den globala nukleosomen modifiering stater skiljer sig i jämförelser av olika celltyper 4. Dessutom har NU-ELISA PTM ändra profiler när celler utsätts för epigenetiska begränsande medel såsom trichostatin-A eller när musen embyronic stamceller differentierade 4. Metoden har också använts framgångsrikt för att studera kromatin av mänskliga ES-celler 5. Det är viktigt att notera NU-ELISA, i sin nuvarande form, kan upptäcka endast komposit underskrift PTMs vistas i summan av de cellulära epigenomet. Detta skiljer sig markant från genomet hela kromatin immunoprecipitation, som kan avgöra fördelningen av en specifik PTM över specifika genetiska loci.
De första stegen i NU-ELISA förfarandena är anpassade från tidigare metoder för att isolera mononucleosomes från däggdjur kärnor 6,7. Dessa är anpassade metoder ger ett ändamålsenligt sätt att få hög kvalitet intakt mononucleosomes från däggdjursceller, och de resulterande fraktioner är omfattande i sin kromatin innehåll, men innehåller en stor mängd övrig kärnämne. Eftersom specifika Abs används, förorenar inte nucleosomal material tolereras väl i NU-ELISA-analys, till skillnad från massa-spec lösningar som kräver större renhet. Det är NU-ELISA mer känsliga och kvantitativa än Western blotting 4, vilket ger bra alternativ till västernfilmer och massa spec för detektion av nucleosomal PTMs.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Utveckling av NU-ELISA-metoden fick stöd av NIH bidrag RO1AG023687.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micrococcal Nucleae | Sigma-Aldrich | N3755 | Make aliquots of 2 U/10μl buffer, stored at -20°C |
| Nunc MaxiSorp Microtiter Plates | Fisher Scientific | 12-565-135 | Adhesive plate covers can also be ordered through Fisher |
| Automated Plate Washer | |||
| 1-Step TMB-ELISAsubstrate | Pierce, Thermo Scientific | 34028 | Store at 4°C pre-warm to RT before use or as directed on the specification sheet |
| Microtiter Plate Reader | Bio-Rad | Most colorimetric plate reader models are suitable |
References
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Turner, B. M. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays. 22, 836-845 (2000).
- Dai, B., Rasmussen, T. P. Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells. Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).
- Tanasijevic, B. Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture. Epigenetics. 4, 330-338 (2009).
- Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).
- Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. Chromatin: a practical approach. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).
