Summary
وصفت طريقة دقيقة لتقييم موت الخلايا. بروتوكول يحسن عند التقليدية Annexin V / propidium البروتوكولات (PI) يوديد ، الذي عرض ما يصل إلى أحداث إيجابية كاذبة بنسبة 40 ٪ في خطوط الخلايا والخلايا الأولية من مجموعة واسعة من النماذج الحيوانية.
Abstract
وقد أجريت دراسات لموت الخلايا المبرمج الخلوية أثرت بشكل ملحوظ منذ تطبيق الأساليب المستندة إلى التدفق الخلوي. ويستخدم على نطاق واسع Propidium يوديد (PI) بالتزامن مع Annexin الخامس لتحديد ما إذا الخلايا قادرة على البقاء ، أفكارك ، أو من خلال الاختلافات في نخرية سلامة غشاء البلازما و1،2 النفاذية. الخامس / PI Annexin البروتوكول هو النهج المتبع عادة لدراسة الخلايا أفكارك 3. ويستخدم في أكثر الأحيان PI البقع النووية الأخرى لأنه من الناحية الاقتصادية ومستقر ومؤشر جيد على سلامة الخلية ، على أساس قدرتها على استبعاد الصبغة 4،5 في الخلايا الحية. PI قدرة على الدخول في الخلية يعتمد على نفاذية الغشاء ؛ PI لا صمة أفكارك الخلايا الحية أو في وقت مبكر بسبب وجود غشاء البلازما 1،2،6 سليمة. في أواخر الخلايا أفكارك ونخرية ، وسلامة الأغشية النووية والبلازما ينخفض 7،8 ، مما يسمح PI بالمرور عبر الأغشية ، ويقحم في الأحماض النووية ، وعرض مضان أحمر 1،2،9. للأسف ، نجد أن التقليدية Annexin V / PI بروتوكولات تؤدي إلى عدد كبير من الأحداث الإيجابية الزائفة (ما يصل الى 40 ٪) ، والتي ترتبط مع تلوين PI من الحمض النووي الريبي داخل المقصورة هيولي 10. تتأثر الخلايا الأساسية وخطوط الخلايا في طائفة واسعة من النماذج الحيوانية ، مع الخلايا الكبيرة (النووي : نسب حشوية <0.5) تبين حدوث أعلى 10. هنا ، علينا أن نظهر معدلة Annexin V / PI الأسلوب الذي يوفر تحسنا ملموسا لتقييم موت الخلايا ، مقارنة بالطرق التقليدية. هذا البروتوكول يستفيد من تغييرات في النفاذية الخلوية خلال تحديد الخلية لتشجيع دخول ريبونوكلياز ألف في الخلايا التالية تلطيخ. وكان كلا من توقيت وتركيز ريبونوكلياز الأمثل لإزالة RNA هيولي. والنتيجة هي تحسن كبير على البروتوكولات التقليدية V / PI Annexin (<5 ٪ مع الأحداث تلطيخ PI حشوية).
Protocol
يمكن تنفيذ هذا الإجراء في أنابيب siliconized ميكرولتر 500 مل أو 6 البوليسترين جولة القاع أنابيب FACS. وعادة ما تستخدم هذه الأخيرة عند تنفيذ تحليل الجدوى بالتزامن مع الإجراءات الأخرى. كافة وحدات التخزين المعطاة لمدة 6 أنابيب البوليسترين مل FACS جولة القاع. للأنابيب 500 siliconized ميكرولتر ، والحد من كافة وحدات التخزين بنسبة 1 / 5.
تركيز الأمثل للتحليل التدفق الخلوي هو 2-4 × 10 6 خلية لكل ميكرولتر 200 الحجم. فقدان الخلية قد تنجم عن هذا الإجراء ، وبالتالي فإننا نوصي بأن كل عينة تتكون من 4 × 6 10 خلايا في بداية هذا الإجراء.
1. خلية التحضير
- خلايا الحصاد -- تشير إلى إجراءات محددة لخطوط الخلية المقابلة أو العزلة الخلية الأولية.
- الطرد المركزي عينات في 335 س ز لمدة 10 دقائق ، وطاف في صب.
- مخزنة في خلايا Resuspend 2 × 1 مل الفوسفات الملحي (PBS) -- / -- (لا يوجد الكالسيوم والمغنيزيوم لا).
- الطرد المركزي عينات في 335 س ز لمدة 10 دقائق ، وطاف في صب.
- Resuspend الخلايا في 1 مل العازلة × 1 V Annexin ملزمة.
- الطرد المركزي عينات في 335 س ز لمدة 10 دقائق ، وطاف في صب.
- Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر العازلة × 1 V Annexin ملزمة.
2. التطبيق الخامس Annexin / PI اللطخة
- إضافة Annexin الخامس وفقا لتوصيات الشركة الصانعة [مثلا 5 ميكرولتر Annexin الخامس اليكسا فلور 488 (المسابر الجزيئية ، A13201)].
- احتضان أنابيب في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 100 ميكرولتر من 1 × V عازلة Annexin ملزمة لكل أنبوب التفاعل. يجب أن يكون هناك ما يقرب من 200 ميكرولتر في كل أنبوب.
- إضافة 4 ميكرولتر من PI (سيغما ، القط # P - 4864 - 10ML) الذي تم تخفيفه في 01:10 1 × V عازلة Annexin ملزمة (أي 1 PI ميكرولتر مع 9 1 ميكرولتر العازلة X V Annexin ملزم). هذا سوف تسفر عن تركيز PI النهائي من 2 ميكروغرام / مل في كل عينة.
- احتضان أنابيب في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 500 ميكرولتر 1 × V عازلة Annexin ملزمة لغسل الخلايا.
- الطرد المركزي عينات في 335 س ز لمدة 10 دقائق ، وطاف في صب.
- Resuspend الخلايا في 500 العازلة ميكرولتر × 1 V Annexin ملزم و 500 ميكرولتر الفورمالديهايد 2 ٪ إلى إيجاد حل 1 ٪ الفورمالديهايد (مثبت). مزيج بواسطة أنابيب عبها لطيف.
- الإصلاح العينات في الثلج لمدة 10 دقيقة. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام. إذا تم اختيار الأسلوب الأخير ، تأكد من أن تكون متسقة في جميع الأنابيب المسمى مع V Annexin / PI (بما في ذلك ضوابط التعويض).
- إضافة 1 مل 1 × PBS -- / -- لكل عينة ومزيج بلطف عبها.
- أنابيب الطرد المركزي في ز س 425 لمدة ثماني دقائق ، وسكب وطاف.
- كرر الخطوات من 2.10 و 2.11.
- Resuspend بيليه عبها بواسطة الأنبوب.
- إضافة 16 ألف ميكرولتر من 1:100 ريبونوكلياز المخفف (سيغما ، R4642) لإعطاء تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 1 مل 1 × PBS -- / -- ومزيج بلطف عبها.
- أنابيب الطرد المركزي في ز س 425 لمدة ثماني دقائق.
- نماذج جاهزة الآن ليتم تحليلها. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام عينات للخطوات اللاحقة تلطيخ إذا يتم تنفيذ Annexin / PI تلطيخ بالتوازي مع إجراءات أخرى.
3. ممثل النتائج :
وترد أمثلة على أنواع الخلايا وخطوط الخلية التي لها درجات متفاوتة من تلطيخ PI إيجابية كاذبة في الشكل 1. لحساب أحداث إيجابية كاذبة ، كانت ثابتة الخلايا وبعد ذلك تعامل مع هذه النتائج ألف ريبونوكلياز في انخفاض ملحوظ في عدد إيجابية كاذبة الأحداث ، بالمقارنة مع الخلايا التي لم تخضع لعلاج ريبونوكلياز (الشكل 2B). ويبين الشكل 2C صور ممثل الخلايا التي خضع ريبونوكلياز العلاج ، مقارنة مع الخلايا التي لم يكن العلاج ريبونوكلياز. الشكل 3 يوضح كيفية تعديل Annexin V / PI البروتوكول ، مع التثبيت وخطوات العلاج ريبونوكلياز ، ويحسن على البروتوكولات التقليدية عن طريق الحد من عدد من الأحداث تلطيخ إيجابية كاذبة.
الشكل 1. البروتوكولات التقليدية تلطيخ propidium يوديد تؤدي إلى عدد كبير من الأحداث الإيجابية الكاذبة ، وعلينا تقييم مدى سابقا تلطيخ إيجابية كاذبة عبر الخلايا الأولية عبر طائفة واسعة من النماذج الحيوانية ، وكذلك في مجموعة متنوعة من خطوط الخلية 10. الصور تظهر مدى ممثل تلطيخ إيجابية كاذبة في ثلاث مجموعات فريدة الخلية (سطر واحد الخلية استخداما -- RAW الضامة واثنين من الخلايا الأولية -- الفئران الضامة نخاع العظم (BMM) والضامة ذهبية الكلى الابتدائي (PKM)). الأحداث الإيجابية الحقيقية العرض المتوقع المشترك بين التعريب وPI DRAQ5 داخل المقصورة النووية (المناطق الصفراء تصور colocalization بين PI وDRAQ5). هو غاية membra DRAQ5شمال شرق منفذة بدقة بقع الصبغة التي المقصورة النووية في كل الخلايا الحية والميتة 10،11،12. من أجل تقرير أسهل البصرية colocalization DRAQ5 أعطيت صمة a pseudocolour الخضراء.
الشكل 2. تحسين دقة تلطيخ PI النووية. (A) قيمنا دقة تلطيخ PI النووية على أساس درجة التشابه في عدد من البقع جيدا اتسم النووي (BrdU ، 7 - AAD ودابي) لDRAQ5. BrdU هو نوكليوزيد الاصطناعية التي يتم دمجها في الحمض النووي من الخلايا المتكاثرة ، وعلى هذا النحو سوف صمة عار فقط داخل المقصورة النووية. 7 - AAD لها قابلية عالية على الحمض النووي وعلى غرار PI ، لا يمكن عبور غشاء البلازما سليمة. دابي أيضا لديه ألفة قوية لدنا والنووية الأكثر شيوعا وصمة عار في المجهر الفلورسنت. كانت درجة التشابه> 99 ٪ بين BrdU ، 7 AAD ، ودابي DRAQ5 ، وإبراز قدرتها على بقعة على وجه الدقة في نواة الخلية الضامة 264.7 RAW. في المقابل ، هيولي تلطيخ PI على أساس البروتوكولات التقليدية يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في المئة من التشابه النسبي لتلطيخ DRAQ5. (B) لوحظ نتائج مماثلة في اثنين من الخلايا الأولية اختبار : الفئران الضامة نخاع العظم (BMM) والضامة ذهبية الكلى الابتدائي (PKM). دمج 50 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز ألف في مرحلة معينة ضمن الإجراء يزيل البقع غير الحائزة تلطيخ PI ويزيد بشكل ملحوظ درجة التشابه النسبي لDRAQ5 تلطيخ. (C) وصور ممثل الضامة الكلى الأولية تظهر درجة التشابه للخلايا مع وبدون ريبونوكلياز العلاج. من أجل تقرير أسهل البصرية الخلافات بين المعالجات ، أعطيت DRAQ5 خضراء. تصوير المناطق الصفراء colocalization بين BrdU وDRAQ5 وPI وDRAQ5.
الشكل 3. تعديل Annexin V / PI يخفف كثيرا من موت الخلايا المبرمج كاذبة / الأحداث نخرية. وكانت ملطخة الأولية الضامة الكلى ذهبية (PKM) مع تعديل البروتوكولات التقليدية والخامس / PI Annexin. Scatterplots تصوير الخامس Annexin / PI وصمة عار في PKM ذهبية. مخطط التشتت وعلى اليسار يظهر التقليدية Annexin V / PI تلطيخ (لا ريبونوكلياز) من الخلايا PKM. مخطط التشتت وعلى اليمين يظهر الخلايا PKM ملطخة الخامس Annexin تعديل / بروتوكول PI (مع ريبونوكلياز). إضافة ريبونوكلياز النتائج إلى انخفاض ملحوظ في تلطيخ PI بسبب إزالة البقع إيجابية كاذبة. ثم تم تحليل الخلايا PKM على أساس السكان متميزة داخل الأسلاف الثقافات المبكر (EP) ، وحيدات (مونو) وناضجة الضامة (بساط ماك). التخفيض في عدد من المناسبات PI إيجابية ، ويرجع ذلك إلى إزالة الأحداث الإيجابية الكاذبة هو أكثر وضوحا في خلايا البلاعم الكبيرة نضجا من أصغر الخلايا الاصلية في وقت مبكر. وقد اقترح واستنتاجات تستند البروتوكولات التقليدية خطأ وجود علاقة إيجابية في الموت الخلوي لمجموعات فرعية بلعم أكثر نضجا.
Discussion
الخامس Annexin / بروتوكول PI المقدمة هنا هو نسخة معدلة من البروتوكولات التقليدية وتأخذ بعين الاعتبار وجود RNA في السيتوبلازم الذي لديه أيضا قابلية عالية للPI. إدخال ريبونوكلياز (50 ميكروغرام / مل) بعد خطوة تثبيت الفورمالديهايد 1 ٪ في وقت متأخر من تلطيخ الداخلي تحسن كبير في دقة تلطيخ PI النووية. لم يلاحظ أي آثار سلبية في تلطيخ PI النووية أو غشاء البلازما تلطيخ Annexin الخامس. وبدون علاج ريبونوكلياز ، يمكن أن تصل إلى 40 ٪ من النتائج وصمة عار PI يؤدي إلى أحداث إيجابية كاذبة ، الأمر الذي يؤدي إلى احتمال تأثير كبير وسلبي على النتائج النهائية 10.
لدينا بروتوكول تعديل Annexin تلطيخ V / PI بسيط واستخدمت على نحو فعال في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا (خلايا الأولية : الفئران الضامة نخاع العظم وsplenocytes ؛ الخنازير خلايا الرئة المقيمين ، البلاعم السنخية الرئة ، يعزل المساريقي العقدة الليمفاوية ، الكريات البيض في الدم المحيطي ، splenocytes ؛ الخلايا الأريمة الدجاج ؛ الضامة ذهبية الكلى الأولية ؛ الكريات البيض في الدم المحيطي المبروك ؛ خطوط الخلوي : RAW 264.7 الضامة ، Jurkat خلايا T ، الخنازير 3D4/31 الضامة ، CCL - 71 الليفية زعنفة سمكة ذهبية ، 3B11 خلايا B القرموط 10). ومن المهم أن نلاحظ أن تتأثر بشكل مختلف الخلايا كاذبة تلطيخ PI إيجابية ، مع وجود الخلايا الأولية عموما أكبر عدد من الأحداث الإيجابية الكاذبة 10. قد تكون الاختلافات كاذبة تلطيخ PI الإيجابية بين هؤلاء السكان الخلوية يعزى جزئيا إلى الاختلافات في حجم الخلية ، ولكن قد ينتج أيضا عن الاختلافات في محتوى الحمض النووي الريبي. على هذا النحو ، إدراج هذا الإجراء هو ذات الصلة ولا سيما بالنسبة للأنظمة التي تستخدم التجريبية ، من بين أمور أخرى ، تمر خلايا التوتر السامة للجينات والخلايا المعالجة بالأدوية اعتقال خلية دورة ثيميدين أو مثل هيدروكسي يوريا ، والخلايا المصابة فيروسي ، ودراسات حول الخلايا الجنينية حيث التقدم التنموي وتتميز بتغيرات في تركيب الحمض النووي الريبي منفصلة الخلوية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من جانب العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا منحة (NSERC) والزراعة ألبرتا اتحاد منحة لتمويل DRB. ويدعم من خلال المنح الدراسية AMR فانييه NSERC دراسات الكندية ، كأستاذ في جامعة ألبرتا التدريس والمنح الدراسية العليا الملكة اليزابيث الثانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x PBS-/- | |||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes, Life Technologies | A13201 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | |
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
References
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).
- Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).
- Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation. Apoptosis. 7, 41-47 (2002).
- Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data. J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).
- Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).
- Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13, 795-808 (1992).
- Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).
- Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).
- Faleiro, L., Lazebnik, Y. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).
- Edward, R. Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells. Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).
- Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).
