Summary
Eine genaue Methode für die Beurteilung der Zelltod beschrieben. Das Protokoll verbessert die auf konventionellen Annexin V / Propidiumiodid (PI)-Protokolle, die up-Display zu 40% falsch-positive Ereignisse in Zelllinien und Primärzellen aus einer breiten Palette von Tiermodellen.
Abstract
Studium der Apoptose haben sich seit der Einführung der Durchflusszytometrie-basierte Methoden beeinflusst. Propidiumiodid (PI) ist weit verbreitet in Verbindung mit Annexin V verwendet werden, um festzustellen, ob Zellen lebensfähig, apoptotischen oder nekrotischen werden durch Unterschiede in der Plasmamembran Integrität und Permeabilität 1,2. Die Annexin V / PI-Protokoll ist ein häufig verwendeter Ansatz zur Untersuchung von apoptotischen Zellen 3. PI ist häufiger als andere Kernfärbemittel, weil es wirtschaftlich, stabil und ein guter Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen ist, basierend auf ihrer Fähigkeit, Farbstoff in lebenden Zellen 4,5 ausgeschlossen werden. Die Fähigkeit von PI in eine Zelle ist abhängig von der Durchlässigkeit der Membran; PI keine Flecken zu leben oder frühen apoptotischen Zellen durch das Vorhandensein einer intakten Plasmamembran 1,2,6. In späten apoptotischen und nekrotischen Zellen, verringert sich die Integrität der Plasma-und Kernmembran 7,8, so dass PI durch die Membranen passieren, interkalieren in Nukleinsäuren und zeigen rote Fluoreszenz 1,2,9. Leider finden wir, dass herkömmliche Annexin V / PI-Protokolle führen zu einer erheblichen Zahl von falsch positiven Ereignissen (bis zu 40%), die mit PI-Färbung von RNA im Zytoplasma Fach 10 verbunden sind. Primärzellen und Zelllinien in einer breiten Palette von Tiermodellen betroffen sind, mit großen Zellen (nuclear: zytoplasmatische Verhältnisse <0,5) mit dem höchsten Vorkommen 10. Wir zeigen hier, eine modifizierte Annexin V / PI-Methode, die eine deutliche Verbesserung für die Beurteilung des Zelltods im Vergleich zu herkömmlichen Methoden bietet. Dieses Protokoll nutzt Veränderungen in zellulären Permeabilität während Zellfixierung um das Eindringen von RNase A in Zellen nach Färbung zu fördern. Sowohl das Timing und die Konzentration von RNase A wurden zum Entfernen von cytoplasmatischen RNA optimiert. Das Ergebnis ist eine deutliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Annexin V / PI-Protokolle (<5% events mit zytoplasmatischen PI-Färbung).
Protocol
Dieser Vorgang kann in 500 ul silikonisierten Röhrchen oder 6 ml Polystyrol Rundboden-FACS-Röhrchen durchgeführt werden. Letzteres ist normalerweise verwendet, wenn die Durchführung Lebensfähigkeit Analyse in Verbindung mit anderen Verfahren. Alle Bände beziehen sich auf 6 ml Polystyrol Rundboden-FACS-Röhrchen. Für 500 ul silikonisierten Röhrchen, reduzieren alle Bände von 1 / 5.
Die optimale Konzentration für die Durchflusszytometrie-Analyse beträgt 2-4 x 10 6 Zellen pro 200 ul Volumen. Zellverlust kann durch dieses Verfahren entstehen und somit empfehlen wir, dass jede Probe von 4 x 10 6 Zellen bestehen zu Beginn des Verfahrens.
1. Cell Preparation
- Ernten Sie die Zellen - beziehen sich auf spezifische Verfahren für die entsprechenden Zelllinien oder primären Zellen Isolierungen.
- Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes.
- Die Zellen in 2 mL 1 x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) - / - (kein Kalzium, kein Magnesium).
- Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes.
- Die Zellen in 1 ml 1 x Annexin V-Bindungspuffer.
- Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes.
- Die Zellen in 100 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer.
2. Die Anwendung des Annexin V / PI Stain
- Add Annexin V nach den Empfehlungen des Herstellers [zB 5 ul Annexin V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].
- Die Röhrchen im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Geben Sie 100 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer zu jedem Reaktionsgefäß. Es sollte etwa 200 ul in jedes Röhrchen werden.
- Add 4 ul PI (Sigma, Kat. Nr. P-4864-10ml), dass die verdünnt wurden in 1 x Annexin V-Bindungspuffer (dh 1 ul PI mit 9 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer) 1:10. Man erhält einen endgültigen PI-Konzentration von 2 pg / mL in jeder Probe.
- Die Röhrchen im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Add 500 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer, um die Zellen zu waschen.
- Centrifuge Proben bei 335 x g für 10 Minuten und Dekantieren des Überstandes.
- Die Zellen in 500 ul 1 x Annexin V-Bindungspuffer und 500 ul 2% Formaldehyd zu einer 1% Formaldehyd (Fixativ)-Lösung zu schaffen. Mix Rohre durch vorsichtiges Schnippen.
- Fix Proben auf Eis für 10 Minuten. Alternativ können die Proben über Nacht bei 4 ° C gelagert werden in der Dunkelheit. Wenn die letztere Methode gewählt wird, stellen Sie sicher zu sein über alle Rohre mit Annexin V / PI (einschließlich des Ersatzes Kontrollen) bezeichnet konsistent.
- 1 ml 1 x PBS - / - zu jeder Probe und mischen Sie vorsichtig durch flicking.
- Zentrifugenröhrchen bei 425 x g für 8 Minuten und Dekantieren des Überstandes.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,10 und 2,11.
- Pellet Dazu den Schlauch.
- Add 16 ul von 1:100 verdünnt RNase A (Sigma, R4642) zu einer Endkonzentration von 50 ug / mL zu geben. Inkubieren für 15 min bei 37 ° C.
- 1 ml 1 x PBS - / - und vorsichtig mischen durch flicking.
- Zentrifugenröhrchen bei 425 x g für 8 Minuten.
- Die Proben werden nun analysiert werden. Alternativ können die Proben für die anschließende Färbung Schritte verwendet werden, wenn Annexin / PI-Färbung ist in parallel mit anderen Verfahren durchgeführt werden.
3. Repräsentative Ergebnisse:
Beispiele von Zelltypen und Zelllinien, die in unterschiedlichem Maße von falsch-positiven PI-Färbung haben, sind in Abbildung 1 dargestellt. Um der falsch-positiven Ereignisse wurden die Zellen fixiert und anschließend mit RNase A behandelt Daraus ergibt sich eine signifikante Abnahme in der Zahl der falsch-positiven Ereignisse im Vergleich zu Zellen, die nicht unterzogen wurden RNase-Behandlung (Abbildung 2B). Abbildung 2C zeigt repräsentative Bilder von Zellen, die RNase-Behandlung unterzogen, im Vergleich zu Zellen, die keine RNase-Behandlung hatte. Abbildung 3 zeigt, wie die modifizierte Annexin V / PI-Protokoll, mit Fixierung und RNase Behandlungsschritte, auf herkömmliche Protokolle verbessert, indem die Anzahl der falsch-positiven Färbung Veranstaltungen.
Abbildung 1. Konventionelle Propidiumiodidfärbung Protokolle eine signifikante Anzahl von falsch positiven Ereignissen führen. Wir haben früher Ausmaß der falsch-positiven Färbung in primären Zellen in einem breiten Spektrum von Tiermodellen sowie in einer Vielzahl von Zell-Linien 10 ausgewertet. Repräsentative Bilder zeigen Ausmaß der falsch-positiven Färbung in drei einzigartigen Zellpopulationen (eine häufig verwendete Zelllinie - RAW Makrophagen und zwei primäre Zellen - Knochenmark der Maus Makrophagen (BMM) und Goldfische primären Nieren-Makrophagen (PKM)). Wahre positive Ereignisse die erwarteten Co-Lokalisation zwischen PI und DRAQ5 innerhalb der nuklearen Fach (gelbe Flächen zeigen Kolokalisation zwischen PI und DRAQ5). DRAQ5 ist sehr membrane durchlässiger Farbstoff, der genau Flecken nuklearen Fach sowohl in lebenden und toten Zellen 10,11,12. Zur leichteren visuellen Bestimmung der Kolokalisation DRAQ5 Fleck war eine grüne pseudocolour gegeben.
Abbildung 2. Verbesserung der Genauigkeit der PI Kernfärbung. (A) Wir untersuchten die Genauigkeit der PI Kernfärbung auf Grad der Ähnlichkeit einer Reihe von gut charakterisierten Kernfärbemittel (BrdU, 7-AAD und DAPI) zu DRAQ5 basiert. BrdU ist ein synthetisches Nukleosid, die in die DNA proliferierender Zellen eingebaut wird, und als solche wird nur innerhalb der nuklearen Fach Fleck. 7-AAD hat eine hohe Affinität für DNA und, ähnlich wie bei PI, sie können nicht über eine intakte Plasmamembran. DAPI hat auch eine starke Affinität zu DNA und ist die am häufigsten verwendeten nuklearen in Fluoreszenzmikroskopie Fleck. Der Grad der Ähnlichkeit war> 99% zwischen BrdU, 7-AAD, DAPI und DRAQ5, Hervorhebung ihrer Fähigkeit, genau zu färben den Zellkern in RAW 264.7 Makrophagen. Im Gegensatz dazu führt zytoplasmatische PI-Färbung auf herkömmlichen Protokollen zu einer deutlichen Abnahme in Prozent Ähnlichkeit der Färbung gegenüber DRAQ5. Knochenmark der Maus Makrophagen (BMM) und Goldfische primären Nieren-Makrophagen (PKM): (B) Ähnliche Ergebnisse werden in zwei primäre Zellen getestet beobachtet. Der Einbau von 50 ug / mL RNase A bei bestimmten Stufe innerhalb der Färbung entfernt nicht-nuklearen PI-Färbung und erhöht Grad der Ähnlichkeit in Bezug auf DRAQ5 Färbung. (C) Repräsentative Bilder von primären Nieren-Makrophagen zeigen den Grad der Ähnlichkeit für Zellen mit und ohne RNase-Behandlung. Zur leichteren visuellen Bestimmung der Unterschiede zwischen den Behandlungen war DRAQ5 einen grünen gegeben. Yellow Bereichen zeigen Kolokalisation zwischen BrdU und DRAQ5 und PI und DRAQ5.
Abbildung 3. Geändert Annexin V / PI reduziert falsche Apoptose / Nekrose Veranstaltungen. Primäre Goldfisch Nieren Makrophagen (PKM) wurden mit herkömmlichen und modifizierten Annexin V / PI-Protokolle gefärbt. Streudiagramme zeigen die Annexin V / PI in Goldfische PKM Fleck. Das Streudiagramm auf der linken Seite zeigt konventionellen Annexin V / PI-Färbung (keine RNase) von PKM-Zellen. Das Streudiagramm auf der rechten Seite zeigt PKM-Zellen mit dem modifizierten Annexin V / PI-Protokoll (mit RNase) gefärbt. Die Zugabe von RNase führt zu einer deutlichen Reduzierung der PI-Färbung durch das Entfernen von falsch-positiven Flecken. PKM Zellen wurden dann auf unterschiedliche Populationen innerhalb der Kulturen und frühen Vorläuferzellen (EP), Monozyten (Mono) und reifen Makrophagen (Mat mac) analysiert wurden. Der Rückgang in der Anzahl der positiven PI Ereignisse, aufgrund der Entfernung von falsch-positiven Ereignisse ist ausgeprägter in großen reifen Makrophagen als in kleineren frühen Vorläuferzellen. Schlussfolgerungen zu herkömmlichen Protokollen basieren würden fälschlicherweise vorgeschlagen haben eine positive Korrelation in zellulären Tod für die reifere Makrophagen Teilmengen.
Discussion
Die Annexin V / PI-Protokoll hier vorgestellte ist eine modifizierte Version der herkömmlichen Protokollen und berücksichtigt das Vorhandensein von RNA in das Zytoplasma, die auch eine hohe Affinität für PI. Einführung von RNase A (50 pg / mL) bei einer 1% Formaldehyd Fixierung Schritt spät in der Färbung deutlich verbessert die Genauigkeit der nuklearen PI-Färbung. Keine negativen Auswirkungen sind in der nuklearen PI-Färbung oder Plasmamembran Annexin V-Färbung beobachtet. Ohne RNase A-Behandlung können bis zu 40% der PI-Färbung Ergebnisse zu falsch positiven Ereignisse, die zu einer potenziell signifikante und negative Auswirkungen auf die nachgelagerten Schlussfolgerungen 10 führt zu führen.
Unsere modifizierte Annexin V / PI-Färbung Protokoll ist einfach und wurde effektiv in einem breiten Spektrum von Zelltypen (primäre Zellen verwendet: Knochenmark der Maus Makrophagen und Splenozyten; Schweinegrippe Lunge residenten Zellen, Lunge Alveolarmakrophagen, Mesenteriallymphknoten Isolate, Leukozyten des peripheren Blutes , Splenozyten; Huhn Blastoderm Zellen; Goldfische primären Nieren-Makrophagen; Karpfen Leukozyten des peripheren Blutes; Zelllinien: RAW 264.7 Makrophagen, Jurkat T-Zellen, Schweine 3D4/31 Makrophagen, CCL-71 Goldfischen fin Fibroblasten, 3B11 Wels B-Zellen 10). Es ist wichtig zu beachten, dass die Zellen differentiell durch falsche positive PI-Färbung, mit primären Zellen in der Regel mit einer größeren Anzahl von falsch positiven Ereignissen 10 betroffen. Die Unterschiede falsch positiven PI-Färbung bei diesen Zellpopulationen können teilweise auf Unterschiede in der Zellgröße zugeschrieben werden, kann aber auch aus Unterschieden in RNA-Gehalt führen. Als solche Einbindung dieses Verfahrens ist besonders relevant für die experimentelle Systeme, die zu nutzen, unter anderem, Zellen, die eine genotoxischen Stress, Zellen mit Zellzyklusarrest Drogen wie Thymidin oder Hydroxyurea, viral infizierte Zellen, und Studien an embryonalen Zellen, in denen Entwicklungsfortschritt behandelt wird durch diskrete Veränderungen in der zellulären RNA-Synthese aus.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von einem Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) Forschungsstipendium und Alberta Agriculture Funding Consortium gewähren DRB unterstützt. AMR ist durch ein NSERC Vanier kanadischen Graduate Scholarship, der University of Alberta Lehre Assistenzzeit und Queen Elizabeth II Graduiertenstipendium unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x PBS-/- | |||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes, Life Technologies | A13201 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | |
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
References
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