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Summary

Um método preciso para a avaliação da morte celular é descrito. O protocolo convencional melhora a anexina V / iodeto de propídio (PI) protocolos, que apresentam até 40% de falsos-positivos eventos em linhagens celulares e pilhas de uma ampla gama de modelos animais.

Abstract

Estudos da apoptose celular foram afetados significativamente desde a introdução da citometria de fluxo baseado em métodos. Iodeto de propídio (PI) é amplamente usado em conjunto com anexina V para determinar se as células são viáveis, apoptóticas ou necróticas através de diferenças na integridade da membrana plasmática e ^1,2 permeabilidade. A anexina V / PI protocolo é um método comumente usado para estudar as células apoptóticas ^3. PI é utilizado mais frequentemente do que outras manchas nuclear porque é econômico, estável e um bom indicador de viabilidade celular, com base em sua capacidade de excluir corante em células vivas ^4,5. A capacidade de PI para inserir uma célula é dependente da permeabilidade da membrana; PI não mancha ao vivo ou no início de células apoptóticas devido à presença de uma membrana plasmática intacta ^1,2,6. No final de células apoptóticas e necróticas, a integridade das membranas plasmática e nuclear diminui ^7,8, permitindo PI para passar através das membranas, intercalam em ácidos nucléicos, e apresentar fluorescência vermelha ^1,2,9. Infelizmente, descobrimos que convencionais anexina V / PI protocolos levar a um número significativo de falsos eventos positivos (até 40%), que estão associados a PI de coloração de RNA no compartimento citoplasmático ^10. Pilhas e linhas celulares em uma ampla gama de modelos animais são afetados, com células grandes (nuclear: relações citoplasmática <0,5), mostrando a maior ocorrência ^10. Aqui, nós demonstramos um método modificado anexina V / PI que proporciona uma melhoria significativa para a avaliação da morte celular em comparação com métodos convencionais. Este protocolo tira proveito das mudanças na permeabilidade celular durante célula de fixação para promover a entrada de RNase A para as células seguintes coloração. Tanto tempo e concentração de RNase A foram otimizados para a remoção de RNA citoplasmático. O resultado é uma melhoria significativa em relação convencional anexina V / PI protocolos (<5% eventos com coloração citoplasmática PI).

Protocol

Este procedimento pode ser realizado em 500 mL mangueiras siliconizadas ou 6 mL de poliestireno tubos de fundo redondo de FACS. O último é normalmente utilizado na realização de análise de viabilidade em conjunto com outros procedimentos. Todos os volumes indicados são para 6 mL de poliestireno tubos de fundo redondo de FACS. Para 500 mL mangueiras siliconizadas, de reduzir todos os volumes por 05/01. A concentração ótima para a análise de citometria de fluxo é de 2-4 x 10 6 células por volume de 200 mL. Perda de células pode resultar desse procedimento e, portanto, recomendamos que cada amostra composta de 4 x 10 6 células no início do procedimento. 1. Preparação de células Células colheita – referem-se a procedimentos específicos para linhagens de células correspondente ou isolamentos de células primárias. Centrifugar as amostras a 335 x g por 10 minutos e decantar o sobrenadante. Ressuspender as células em 2 mL de fosfato x 1 solução salina tamponada (PBS) – / – (sem cálcio, magnésio não). Centrifugar as amostras a 335 x g por 10 minutos e decantar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL 1 x anexina V buffer de ligação. Centrifugar as amostras a 335 x g por 10 minutos e decantar o sobrenadante. Ressuspender as células em 100 mL 1 x anexina V buffer de ligação. 2. Aplicação de anexina V / PI Stain Adicionar anexina V de acordo com as recomendações do fabricante [por exemplo, 5 mL anexina V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)]. Incubar os tubos no escuro por 15 minutos em temperatura ambiente. Adicionar 100 mL de tampão 1 x V anexina ligação a cada tubo de reacção. Deve haver cerca de 200 mL em cada tubo. Adicionar 4 mL de PI (Sigma, Cat # P-4864-10ML) que foi diluída 1:10 em tampão 1 x V anexina vinculativo (isto é, PI 1 mL com 9 x 1 mL de buffer V anexina ligação). O resultado será uma concentração final de 2 PI mcg / mL em cada amostra. Incubar os tubos no escuro por 15 minutos em temperatura ambiente. Adicionar 500 mL 1 x anexina V tampão de ligação para lavar as células. Centrifugar as amostras a 335 x g por 10 minutos e decantar o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 mL de buffer 1 x aderência à anexina V e 500 mL de formaldeído a 2% para criar uma solução a 1% de formaldeído (fixador). Mix tubos sacudindo gentil. Fix amostras no gelo por 10 minutos. Alternativamente, as amostras podem ser armazenadas durante a noite a 4 ° C no escuro. Se o último método é escolhido, certifique-se de ser coerente em todos os tubos rotulados com anexina V / PI (incluindo controles de compensação). Adicionar 1 mL 1 x PBS – / – para cada amostra e misturar delicadamente por flicking. Centrifugar os tubos a 425 x g por oito minutos e decantar o sobrenadante. Repita os passos 2.10 e 2.11. Ressuspender pellet sacudindo o tubo. Adicionar 16 mL de 1:100 diluídos RNase A (Sigma, R4642) para dar uma concentração final de 50 mcg / mL. Incubar por 15 min a 37 ° C. Adicionar 1 mL 1 x PBS – / – e misture delicadamente sacudindo. Centrifugar os tubos a 425 x g por oito minutos. Amostras está agora pronto para ser analisado. Alternativamente, as amostras podem ser utilizados para as etapas subseqüentes coloração se anexina / PI coloração está sendo realizada em paralelo com outros procedimentos. 3. Resultados representativos: Exemplos de tipos de células e linhas de células que têm diferentes graus de falso-positivo coloração PI são mostrados na Figura 1. Para explicar os eventos falso-positivos, as células foram fixadas e então tratadas com RNase A. Isto resulta em uma diminuição significativa no número de falso-positivo de eventos, em comparação com as células que não foram submetidos a tratamento RNase (Figura 2B). Figura 2C mostra imagens representativas das células que foram submetidos a RNase tratamento, em comparação com as células que não tinha tratamento RNase. A Figura 3 mostra como a modificação anexina V / PI protocolo, com fixação e etapas de tratamento RNase, melhora a protocolos convencionais, limitando o número de eventos de falso-positivo coloração. Figura 1. Convencionais propidium protocolos de coloração iodeto de levar a um número significativo de falsos acontecimentos positivos. Temos previamente avaliados extensão da coloração falso positivo em células primárias em uma ampla gama de modelos animais, bem como em uma variedade de linhas de células 10. Imagens representativas mostram extensão da coloração falso positivo em três populações de células únicas (uma linhagem de células comumente usados ​​- macrófagos RAW e duas pilhas – macrófagos da medula óssea de camundongos (BMM) e macrófagos goldfish primário renal (PKM)). Verdadeiros acontecimentos positivos exibir o esperado co-localização entre PI e DRAQ5 no interior do compartimento nuclear (áreas amarelas representam co-localização entre PI e DRAQ5). DRAQ5 é altamente membrane permeável corante que precisa compartimento manchas nuclear em ambas as células vivas e mortas 10,11,12. Para facilitar a determinação visual da co-localização DRAQ5 mancha foi dado um pseudocolour verde. Figura 2. Melhorar a precisão do PI coloração nuclear. (A) Avaliamos a precisão de PI coloração nuclear com base no grau de semelhança de uma série de bem caracterizados manchas nuclear (BrdU, 7-AAD e DAPI) para DRAQ5. BrdU é um nucleosídeo sintético que é incorporada ao DNA de células em proliferação, e como tal só mancha no interior do compartimento nuclear. 7-AAD tem uma alta afinidade por DNA e, semelhante ao PI, não pode atravessar uma membrana plasmática intacta. DAPI também tem uma forte afinidade por DNA e é o mais comumente usado nuclear mancha em microscopia fluorescente. O grau de similaridade foi> 99% entre BrdU, 7-AAD, DAPI e DRAQ5, destacando a sua capacidade de precisão mancha do núcleo da célula em RAW 264,7 macrófagos. Em contraste, coloração citoplasmática PI baseado em protocolos convencionais leva a uma diminuição acentuada na similaridade de coloração por cento em relação ao DRAQ5. (B) Resultados semelhantes foram observados em duas pilhas testadas: os macrófagos da medula óssea de camundongos (BMM) e macrófagos goldfish primário renal (PKM). Incorporação de 50 mg / mL de RNase A na fase específica dentro do processo de coloração não remove a coloração nuclear PI e aumenta significativamente o grau de semelhança em relação ao DRAQ5 coloração. (C) Imagens representativas de macrófagos primárias de rim de mostrar o grau de semelhança para as células com e sem tratamento RNase. Para facilitar a determinação visual das diferenças entre os tratamentos, DRAQ5 foi dado um verde. Áreas amarelas representam co-localização entre BrdU e DRAQ5 e PI e DRAQ5. Figura 3. Modificado anexina V / PI reduz significativamente a apoptose false / eventos necrótico. Macrófagos goldfish primário renal (PKM) foram coradas com convencional e modificado anexina V / PI protocolos. Gráficos de dispersão retratam a anexina V / PI mancha em PKM goldfish. A dispersão da esquerda mostra convencionais anexina V coloração / PI (sem RNase) de células PKM. A dispersão da direita mostra células PKM manchadas com o anexina V modificado / protocolo IP (com RNase). A adição dos resultados da RNase em uma acentuada redução do PI coloração devido à remoção de manchas falsos positivos. PKM células foram então analisados ​​com base em populações distintas dentro da progenitores culturas precoce (EP), monócitos (Mono) e macrófagos maduros (Mat mac). A redução do número de eventos PI positivo, devido à remoção de falsos eventos positivos é mais pronunciado em grandes macrófagos maduros do que em menor células progenitoras cedo. Conclusões baseadas em protocolos convencionais teria erroneamente sugere uma correlação positiva na morte celular para subconjuntos de macrófagos mais maduro.

Discussion

A anexina V / PI protocolo aqui apresentado é uma versão modificada de protocolos convencionais e leva em conta a presença de RNA no citoplasma que também tem alta afinidade para o PI. Introdução de RNase A (50 mg / mL), após um passo de 1% de formaldeído de fixação no final do processo de coloração melhora significativamente a precisão da coloração PI nuclear. Sem efeitos negativos são observados na coloração PI nuclear ou membrana plasmática anexina V coloração. Sem tratamento RNase A, até 40% dos resultados PI mancha pode levar a falsos eventos positivos, o que leva a um impacto potencialmente significativo e negativo sobre as conclusões a jusante ^10.

Nosso modificada anexina V protocolo de coloração / PI é simples e tem sido utilizada de forma eficaz em uma ampla gama de tipos de células (células primário: os macrófagos da medula óssea de camundongos e esplenócitos, células residentes suína pulmão, macrófagos alveolares do pulmão, os isolados do nó de linfa mesentérica, leucócitos do sangue periférico , esplenócitos, células blastoderma frango; macrófagos goldfish primárias de rim; leucócitos do sangue periférico de carpa; linhas Cell: RAW 264,7 macrófagos, células Jurkat T, suína 3D4/31 macrófagos, CCL-71 fibroblastos fin goldfish, peixe-gato 3B11 células B ^10). É importante notar que as células são diferencialmente afetados pela coloração PI falso positivo, com pilhas geralmente tendo um maior número de falsos eventos positivos ^10. As diferenças de coloração PI falso positivo entre essas populações celulares pode ser parcialmente atribuída a diferenças no tamanho das células, mas também podem resultar de diferenças no conteúdo de RNA. Como a incorporação, tais deste procedimento é particularmente relevante para sistemas experimentais que utilizam, entre outras, células submetidos a estresse genotóxico, as células tratadas com drogas parada do ciclo celular, tais como timidina ou hidroxiuréia, as células infectadas por vírus, e estudos sobre células embrionárias, onde a progressão do desenvolvimento é caracterizado por mudanças discretas na síntese de RNA celular.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
1 x PBS-/-
1 x Annexin V Binding Buffer		BD Biosciences	556454
Annexin V-Alexa Fluor 488		Molecular Probes (Invitrogen)	A13201
Propidium iodide (PI)		Sigma-Aldrich	P4864	1 mg/mL in H2O
2% Formaldehyde		Sigma-Aldrich	F1268
RNase A from bovine pancreas		Sigma-Aldrich	R4642
DRAQ5		Biostatus	DR50050	Dilute 1:60 in 1 x PBS-/-