Summary
En korrekt metod för bedömning av celldöd beskrivs. Protokollet förbättrar konventionella Annexin V / propidiumjodid (PI) protokoll, som visar upp till 40% falskt positiva händelser i cellinjer och primära celler från ett brett urval av djurmodeller.
Abstract
Studier av cellulära apoptos har i betydande utsträckning påverkats sedan införandet av flödescytometri-baserade metoder. Propidiumjodid (PI) används ofta i kombination med Annexin V för att avgöra om cellerna är livskraftiga, apoptotiska eller nekrotiska genom skillnader i plasmamembranet integritet och permeabilitet 1,2. Den Annexin V / PI-protokollet är ett vanligt tillvägagångssätt för att studera apoptotiska celler 3. PI används oftare än andra kärntekniska fläckar eftersom det är ekonomiskt, stabilt och en bra indikator på cellviabiliteten, baserat på dess förmåga att utesluta färga i levande celler 4,5. Möjligheten för PI att ange en cell är beroende av permeabiliteten i membranet, PI inte fläckar bor eller i början av apoptotiska celler på grund av närvaron av en intakt plasmamembran 1,2,6. I slutet av apoptotiska och nekrotiska celler, minskar integritet plasma och nukleära membran 7,8, vilket gör att PI att passera genom membranen, intercalate i nukleinsyror och visa röd fluorescens 1,2,9. Tyvärr finner vi att konventionella Annexin V / PI protokoll leda till ett stort antal falskt positiva händelser (upp till 40%), som är förknippade med PI färgning av RNA inom cytoplasmiska facket 10. Primära celler och cellinjer i ett brett urval av djurmodeller är drabbade, med stora celler (kärnkraft: cytoplasmiska nyckeltal <0,5) visar den högsta förekomsten 10. Häri visar vi en modifierad Annexin V / PI-metoden som ger en signifikant förbättring för bedömning av celldöd jämfört med konventionella metoder. Detta protokoll tar fördel av förändringar av cellens permeabilitet under cellen fastställande underlätta inträdet av RNas A till cellerna efter färgning. Både tidpunkten och koncentration av RNas A har optimerats för borttagning av cytoplasmiska RNA. Resultatet är en betydande förbättring jämfört med konventionella Annexin V / PI-protokoll (<5% händelser med cytoplasmisk PI färgning).
Protocol
Denna procedur kan utföras på 500 mikroliter silikoniserade rör eller 6 ml polystyren rundbottnad FACS rör. Den senare används normalt när de utför bärkraften analyser i samband med andra förfaranden. Alla nämnda volymerna är för 6 rundbottnad mL polystyren FACS rör. För 500 mikroliter silikoniserade rör, minska alla volymerna med 1 / 5.
Den optimala koncentrationen för flödescytometri analys är 2-4 x 10 6 celler per 200 mikroliter volym. Cell förlust kan bli följden av detta förfarande och därför rekommenderar vi att varje prov består av 4 x 10 6 celler i början av förfarandet.
1. Cellberedningen
- Harvest celler - se särskilda förfaranden för motsvarande cellinjer eller primär isolering cell.
- Centrifugera proverna vid 335 x g i 10 minuter och dekantera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 2 ml 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) - / - (ingen kalcium, ingen magnesium).
- Centrifugera proverna vid 335 x g i 10 minuter och dekantera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 1 ml 1 x Annexin V bindande buffert.
- Centrifugera proverna vid 335 x g i 10 minuter och dekantera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 100 mikroliter 1 x Annexin V bindande buffert.
2. Tillämpning av Annexin V / PI Stain
- Lägg Annexin V enligt tillverkarens rekommendationer [t.ex. 5 mikroliter Annexin V Alexa Fluor 488 (molekylära sonder, A13201)].
- Inkubera rören i mörker i 15 minuter i rumstemperatur.
- Tillsätt 100 mikroliter av 1 x Annexin V bindande buffert i varje reaktionsrör. Det bör finnas ungefär 200 mikroliter i varje rör.
- Tillsätt 4 mikroliter PI (Sigma, Cat # P-4864-10ml) som har spätts ut 1:10 i 1 x Annexin V bindande buffert (dvs 1 mikroliter PI med 9 mikroliter 1 x Annexin V bindande buffert). Detta kommer att ge en slutlig PI koncentration av 2 mikrogram / ml i varje prov.
- Inkubera rören i mörker i 15 minuter i rumstemperatur.
- Tillsätt 500 mikroliter 1 x Annexin V bindningsbuffert att tvätta cellerna.
- Centrifugera proverna vid 335 x g i 10 minuter och dekantera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 500 mikroliter 1 x Annexin V bindande buffert och 500 mikroliter 2% formaldehyd för att skapa en 1% formaldehyd (fixativ) lösning. Blanda rören genom försiktig rulla.
- Fix prover på is i 10 minuter. Alternativt kan proverna förvaras över natten vid 4 ° C i mörker. Om den senare metoden är vald, se till att vara konsekvent i alla rör som är märkt med Annexin V / PI (inklusive kompensation kontroller).
- Tillsätt 1 ml 1 x PBS - / - till varje prov och blanda försiktigt genom att ställa.
- Centrifugera rören vid 425 x g åtta minuter och dekantera supernatanten.
- Upprepa steg 2,10 och 2,11.
- Resuspendera pellet genom att ställa röret.
- Tillsätt 16 mikroliter av 1:100 utspädd RNas A (Sigma, R4642) för att ge en slutlig koncentration på 50 mikrogram / ml. Inkubera i 15 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 1 ml 1 x PBS - / - och blanda försiktigt genom att ställa.
- Centrifugera rören vid 425 x g åtta minuter.
- Prover är nu redo att analyseras. Alternativt kan prover användas för efterföljande färgning steg om Annexin / PI färgning utförs parallellt med andra förfaranden.
3. Representativa resultat:
Exempel på typer av celler och cellinjer som har olika grader av falskt positiva PI färgning visas i figur 1. Redogöra för de falskt positiva händelser, var cellerna fast och behandlas sedan med RNas A. Detta resulterar i en signifikant minskning av antalet falskt positiva händelser, jämfört med celler som inte genomgått RNas behandling (Figur 2B). Figur 2c visar representativa bilder av celler som genomgick RNase behandling, jämfört med celler som inte hade någon RNas behandling. Figur 3 visar hur den modifierade Annexin V / PI-protokollet, med fixering och RNase steg behandling, förbättrar konventionella protokoll genom att begränsa antalet falskt positiv färgning händelser.
Figur 1. Konventionella propidiumjodid färgning protokoll leda till ett stort antal falskt positiva händelser. Vi har tidigare utvärderat omfattningen av falskt positiv färgning över galvaniska element inom ett brett urval av djurmodeller samt i en rad olika cellinjer 10. Representativa bilder visar omfattningen av falskt positiv färgning i tre unika cellpopulationer (ett vanligt cellinje - RAW makrofager och två primära celler - murina benmärgen makrofager (BMM) och guldfiskar primära makrofager njure (PKM)). Sann positiva händelser visar det förväntade samarbetet lokalisering mellan PI och DRAQ5 inom nukleära facket (gula områdena visar colocalization mellan PI och DRAQ5). DRAQ5 är mycket Membrane genomsläpplig färg som exakt fläckar kärnkraft fack i både levande och döda celler 10,11,12. För att underlätta visuell bestämning av colocalization DRAQ5 fläcken fick en grön pseudocolour.
Figur 2. Att förbättra tillförlitligheten i PI nukleär färgning. (A) Vi bedömde noggrannhet PI nukleär färgning baserad på graden av likhet med ett antal väl karaktäriseras-nukleära fläckar (BrdU, 7-AAD och DAPI) till DRAQ5. BrdU är en syntetisk nukleosidanalog som är inbyggt i DNA celler som förökar sig, och som sådan kommer bara fläcken inom det nukleära facket. 7-AAD har en hög affinitet för DNA och liknande PI, kan inte passera en intakt plasmamembran. DAPI har också en stark affinitet till DNA och är den mest använda kärnkraft fläck i fluorescerande mikroskopi. Graden av likhet var> 99% mellan BrdU, 7-AAD, DAPI och DRAQ5, uppmärksamma deras förmåga att korrekt fläcken cellkärnan i RAW 264,7 makrofager. Däremot leder cytoplasmisk PI färgning Gängse protokoll för att en markant minskning i procent likhet färgning förhållande till DRAQ5. (B) Liknande resultat observerades i två testade galvaniska element: murina benmärg makrofager (BMM) och guldfiskar primära makrofager njure (PKM). Införande av 50 mikrogram / ml RNas A vid specifika skede inom färgningsproceduren bort icke-nukleära PI färgning och kraftigt ökar graden av likhet i förhållande till DRAQ5 färgning. (C) Bilderna är av primär njure makrofager visar graden av likhet för celler med och utan RNas behandling. För att underlätta visuell bestämning av skillnaderna mellan behandlingarna var DRAQ5 fått en grön. Gula områden visar colocalization mellan BrdU och DRAQ5, och PI och DRAQ5.
Figur 3. Ändrad Annexin V / PI reducerar falska apoptos / nekrotiska händelser. Primär guldfisk njure makrofager (PKM) färgades med konventionella och modifierad Annexin V / PI protokoll. Scatterplots skildra Annexin V / PI fläcken i Goldfish PKM. Den spridningsdiagram till vänster visar konventionella Annexin V / PI färgning (ingen RNas) av PKM celler. Den spridningsdiagram till höger visar PKM cellerna färgas med den modifierade Annexin V / PI-protokoll (med RNase). Tillägget av RNas resulterar i en markant minskning av PI färgning på grund av avlägsnandet av falskt positiva fläckar. PKM celler har sedan analyserats baserat på skilda populationer inom kultur-tidiga stamceller (EP), monocyter (mono) och mogna makrofager (Mat Mac). Minskningen av antalet positiva PI händelser, på grund av avlägsnad falskt positiva händelser är mer uttalad i stora mogna makrofag celler än i mindre tidiga stamceller. Slutsatser baserade på konventionella protokoll skulle ha felaktigt föreslagit en positiv korrelation i cellulära död för mognare makrofager undergrupper.
Discussion
Den Annexin V / PI-protokollet som presenteras här är en modifierad version av vanliga protokoll och tar hänsyn till förekomsten av RNA i cytoplasman som också har hög affinitet för PI. Införande av RNas A (50 mikrogram / ml) efter en 1% formaldehyd fixering steg sent i färgningsproceduren förbättrar avsevärt riktigheten av kärntekniska PI färgning. Inga negativa effekter har observerats i nukleär PI färgning eller plasmamembranet Annexin V färgning. Utan RNas En behandling kan upp till 40% av PI fläcken resultat leda till falskt positiva händelser, vilket leder till en potentiellt betydande och negativ påverkan på nedströms slutsatser 10.
Vår modifierad Annexin V / PI färgningsprotokollet är enkel och har använts effektivt i en rad olika celltyper (Primärceller: murina benmärg makrofager och splenocytes, svin lunga bosatt celler, lung-alveolära makrofager, kröslymfknutor nod isolat, perifert blod leukocyter , splenocytes, kyckling BLASTODERM celler; guldfisk primära njure makrofager, karp perifera leukocyter, cellinjer: RAW 264,7 makrofager, Jurkat T-celler, svin 3D4/31 makrofager, CCL-71 guldfiskar fin fibroblaster, 3B11 havskatt B-celler 10). Det är viktigt att notera att cellerna differentiellt påverkas av falskt positiva PI färgning, med primära celler i allmänhet har ett större antal falskt positiva händelser 10. Skillnaderna falskt positiva PI färgning bland dessa cellpopulationer kan delvis hänföras till skillnader i cellstorlek, men kan också beror på skillnaden i RNA innehåll. Som sådan, införlivande av detta förfarande är särskilt relevant för experimentella system som använder bland annat celler genomgår genotoxiska stress, celler som behandlats med gripandet cellcykeln droger som tymidin eller hydroxiurea, viralt-infekterade celler, och studier på embryonala celler där utvecklande progression kännetecknas av diskreta förändringar i cellulärt RNA syntes.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie fick stöd av en naturvetenskaplig och teknisk Council of Canada (NSERC) forskningsanslag och ett Alberta Jordbruk Finansiering Consortium bidrag till DRB. AMR stöds genom en NSERC Vanier kanadensiska Graduate Scholarship, University of Alberta undervisning assistent och en drottning Elizabeth II examen stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x PBS-/- | |||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes, Life Technologies | A13201 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | |
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
References
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).
- Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).
- Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation. Apoptosis. 7, 41-47 (2002).
- Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data. J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).
- Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).
- Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13, 795-808 (1992).
- Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).
- Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).
- Faleiro, L., Lazebnik, Y. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).
- Edward, R. Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells. Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).
- Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).
