Summary
Un método preciso para la evaluación de la muerte celular se describe. El protocolo de mejora sobre convencional anexina V / yoduro de propidio (PI) protocolos, que muestran hasta falsos positivos del 40% los eventos en las líneas celulares y células primarias de una amplia gama de modelos animales.
Abstract
Los estudios de apoptosis celular se han visto significativamente afectados desde la introducción de la citometría de flujo basado en los métodos. Yoduro de propidio (PI) es ampliamente utilizado en conjunción con la anexina V para determinar si las células son viables, apoptosis o necrosis a través de diferencias en la integridad de la membrana de plasma y 1,2 permeabilidad. La anexina V / PI protocolo es un método comúnmente utilizado para el estudio de las células apoptóticas 3. PI se utiliza con más frecuencia que otras manchas nuclear porque es económico, estable y un buen indicador de la viabilidad celular, basado en su capacidad para excluir de colorante en las células vivas 4,5. La capacidad de PI para entrar en una célula depende de la permeabilidad de la membrana; PI no mancha las células apoptóticas en vivo o temprano debido a la presencia de una membrana plasmática intacta 1,2,6. A finales de células apoptóticas y necróticas, la integridad de la membrana plasmática y nuclear disminuye 7,8, lo que permite pasar a través de PI de las membranas, se intercalan en los ácidos nucleicos, y la pantalla de color rojo fluorescente 1,2,9. Por desgracia, nos encontramos con que convencionales anexina V / IP protocolos de conducir a un significativo número de falsos eventos positivos (hasta un 40%), que se asocian con la tinción PI de ARN en el compartimento citoplásmico 10. Las células primarias y líneas celulares en una amplia gama de modelos animales se ven afectados, de células grandes (nuclear: relación núcleo: citoplasma <0,5) que muestra la mayor incidencia 10. En esto, se demuestra una modificación de anexina V / PI método que proporciona una mejora significativa para la evaluación de la muerte celular en comparación con los métodos convencionales. Este protocolo se aprovecha de los cambios en la permeabilidad celular en células de fijación para promover la entrada de la RNasa A en las células después de la tinción. Tanto el momento y la concentración de RNasa A se han optimizado para la extracción de ARN citoplásmico. El resultado es una mejora significativa con respecto convencionales Anexina V / PI protocolos (<5% de los eventos con tinción citoplasmática PI).
Protocol
Este procedimiento se puede realizar en tubos de 500 l con silicona o 6 mL de poliestireno de fondo redondo de tubos de FACS. Este último se utiliza normalmente en la realización de análisis de viabilidad en relación con otros procedimientos. Todos los volúmenes indicados se refieren a 6 mL de poliestireno de fondo redondo de tubos FACS. De 500 tubos de silicona l, reducir todos los volúmenes de 1 / 5.
La concentración óptima para el análisis de citometría de flujo es de 2-4 x 10 6 células por cada 200 l de volumen. La pérdida de células puede ser consecuencia de este procedimiento y por lo tanto se recomienda que cada muestra constará de 4 x 10 6 células en el inicio del procedimiento.
1. Preparación de células
- Las células de la cosecha - se refieren a procedimientos específicos para las líneas celulares correspondientes o aislamientos de células primarias.
- Centrifugar las muestras a 335 x g durante 10 minutos y decantar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 2 ml x 1-fosfato (PBS) - / - (no el calcio, el magnesio no).
- Centrifugar las muestras a 335 x g durante 10 minutos y decantar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 1 ml de un tampón de anexina V x vinculante.
- Centrifugar las muestras a 335 x g durante 10 minutos y decantar el sobrenadante.
- Resuspender las células en un buffer de 100 L x anexina V vinculante.
2. Aplicación de anexina V / PI manchas
- Añadir anexina V de acuerdo con las recomendaciones del fabricante [por ejemplo, 5 l anexina V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].
- Incubar los tubos en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 100 ml de un buffer x anexina V la unión a cada tubo de reacción. No debe ser de aproximadamente 200 l en cada tubo.
- Agregar 4 l de PI (Sigma, Cat # P-4864-10 ml) que se ha diluido 1:10 en un tampón x anexina V vinculante (es decir, 1 l PI con 9 l 1 x anexina V buffer de unión). Esto dará lugar a una concentración final de PI 2 mg / mL en cada muestra.
- Incubar los tubos en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 500 l 1 x anexina V buffer vinculante para lavar las células.
- Centrifugar las muestras a 335 x g durante 10 minutos y decantar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 500 l 1 x tampón de anexina V vinculante y 500 l de formaldehído al 2% para crear una solución de formaldehído al 1% (fijador). Mezcle los tubos de revoloteo suave.
- Fijar las muestras en hielo durante 10 minutos. Por otra parte, las muestras pueden ser almacenadas durante la noche a 4 ° C en la oscuridad. Si el último método que se elija, asegúrese de ser coherente en todos los tubos etiquetados con Anexina V / PI (incluidos los controles de compensación).
- Añadir 1 mL 1 x PBS - / - para cada muestra y mezclar suavemente accionando.
- Tubos de centrífuga a 425 x g durante ocho minutos y decantar el sobrenadante.
- Repita los pasos 2.10 y 2.11.
- Resuspender pellet accionando el tubo.
- Añadir 16 l de 1:100 diluida RNasa (Sigma, R4642) para dar una concentración final de 50 ug / mL. Incubar durante 15 min a 37 ° C.
- Añadir 1 mL 1 x PBS - / - y mezcle suavemente agitando.
- Tubos de centrífuga a 425 x g durante ocho minutos.
- Las muestras están ahora listos para ser analizados. Por otra parte, las muestras se puede utilizar para los pasos de tinción posterior si la anexina / PI tinción se realiza en paralelo con otros procedimientos.
3. Los resultados representativos:
Ejemplos de tipos de células y líneas celulares con diferentes grados de tinción PI falsos positivos se muestran en la Figura 1. Para dar cuenta de los eventos de falsos positivos, las células fueron fijadas y luego tratados con RNasa A. Esto se traduce en una disminución significativa en el número de falsos positivos acontecimientos, en comparación con células que no se sometieron a tratamiento RNasa (Figura 2B). La Figura 2c muestra imágenes representativas de las células que se sometieron a RNasa tratamiento, en comparación con células que no recibieron tratamiento RNasa. La Figura 3 muestra cómo la modificación Anexina V / PI protocolo, con la fijación y los pasos RNasa tratamiento, mejora en los protocolos convencionales, al limitar el número de eventos de tinción de falsos positivos.
Figura 1. Convencionales de propidio protocolos de tinción con yoduro de conducir a un significativo número de falsos eventos positivos. Hemos evaluado previamente el alcance de la tinción de falsos positivos en las células primarias a través de una amplia gama de modelos animales, así como en una variedad de 10 líneas celulares. Representante imágenes muestran el grado de tinción de falsos positivos en tres poblaciones de células únicas (una línea común de células - los macrófagos RAW y dos pilas - murino macrófagos de médula ósea (BMM) y los macrófagos peces de colores primarios de riñón (PKM)). Verdadera acontecimientos positivos mostrar la espera co-localización entre el PI y DRAQ5 dentro del compartimiento nuclear (áreas amarillas representan colocalización entre PI y DRAQ5). DRAQ5 es muy membrane permeable tinte que con precisión las manchas compartimiento nuclear, tanto en las células vivas y muertas, 10,11,12. Para facilitar la determinación visual de la colocalización DRAQ5 mancha se le dio un pseudocolor verde.
Figura 2. Mejorar la exactitud de la tinción PI nuclear. (A) Se evaluó la exactitud de la tinción PI nuclear basada en el grado de similitud de una serie de bien caracterizado manchas nuclear (BrdU, 7-AAD y DAPI) para DRAQ5. BrdU es un nucleósido sintético que se incorpora en el ADN de las células proliferantes, y como tal, sólo se mancha en el compartimento nuclear. 7-AAD tiene una gran afinidad por el ADN y, de forma similar a la PI, no puede cruzar una membrana plasmática intacta. DAPI también tiene una fuerte afinidad por el ADN nuclear y es el más comúnmente utilizado en la tinción de microscopía de fluorescencia. El grado de similitud era> 99% entre BrdU, 7-AAD, DAPI y DRAQ5, destacando su capacidad de tinción con precisión el núcleo de la célula en los macrófagos RAW 264.7. Por el contrario, la tinción PI citoplasmática basado en protocolos convencionales conduce a una marcada disminución en la similitud de las manchas por ciento en relación con DRAQ5. (B) Resultados similares se observaron en dos pilas a prueba: los macrófagos de médula ósea murina (BMM) y los macrófagos peces de colores primarios de riñón (PKM). Incorporación de 50 mg / ml RNasa A en la etapa específica dentro del procedimiento de tinción elimina no nucleares tinción PI y aumenta significativamente el grado de similitud en relación con DRAQ5 manchas. (C) imágenes representativas de los macrófagos renal primaria muestran el grado de similitud de las células con y sin tratamiento RNasa. Para facilitar la determinación visual de las diferencias entre los tratamientos, DRAQ5 se le dio un color verde. Zonas amarillas representan colocalización entre BrdU y DRAQ5 y PI y DRAQ5.
Figura 3. Modificado Anexina V / PI reduce significativamente la apoptosis falso / eventos necrótico. Macrófagos primarios de riñón peces de colores (PKM) se tiñeron con convencionales y modificados Anexina V / PI protocolos. Diagramas de dispersión muestran la anexina V / PI mancha en PKM peces de colores. El diagrama de dispersión de la izquierda muestra convencional Anexina V / PI tinción (sin RNasa) de las células de PKM. El diagrama de dispersión de la derecha muestra las células PKM manchadas con la anexina V modificado / protocolo IP (con RNasa). La adición de los resultados de RNasa en una marcada reducción de la tinción PI debido a la eliminación de falsos positivos manchas. PKM células fueron analizadas sobre la base de distintas poblaciones dentro de los progenitores y principios de las culturas (EP), monocitos (Mono) y macrófagos maduros (Mat mac). La reducción en el número de eventos PI positiva, debido a la eliminación de falsos eventos positivos es más pronunciada en las grandes macrófagos maduros que en las pequeñas células progenitoras tempranas. Las conclusiones basadas en protocolos convencionales que erróneamente han sugerido una correlación positiva en la muerte celular de subconjuntos de macrófagos más maduro.
Discussion
La anexina V / PI protocolo que aquí se presenta es una versión modificada de los protocolos convencionales y tiene en cuenta la presencia de ARN en el citoplasma, que también tiene gran afinidad por el PI. Introducción de RNasa A (50 mg / ml) después de un paso de formaldehído fijación de un 1% al final del procedimiento de tinción mejora significativamente la precisión de las armas nucleares tinción PI. No se observaron efectos negativos se observan en la tinción nuclear PI o tinción de la membrana plasmática anexina V. Sin RNasa A de tratamiento, hasta un 40% de los resultados de PI mancha puede dar lugar a falsos eventos positivos, lo que conduce a un impacto potencialmente significativo y negativo en las conclusiones posteriores 10.
Nuestra modificado Anexina V / PI protocolo de tinción es simple y se ha utilizado con eficacia en una amplia gama de tipos de células (células primarias: murino macrófagos de médula ósea y esplenocitos; porcina células residentes del pulmón, los macrófagos alveolares de pulmón, los ganglios linfáticos mesentéricos aislados, leucocitos de sangre periférica , los esplenocitos, células de pollo blastodermo; macrófagos peces de colores primarios de riñón, la carpa leucocitos en sangre periférica, líneas celulares: macrófagos RAW 264.7, las células Jurkat T, macrófagos porcinos 3D4/31, CCL-71 fibroblastos aleta peces de colores, 3B11 células B bagre 10). Es importante tener en cuenta que las células son diferencialmente afectados por la tinción PI falsos positivos, con pilas por lo general tienen un mayor número de falsos eventos positivos 10. Las diferencias falsas tinción PI positiva entre estas poblaciones celulares puede ser atribuida en parte a diferencias en el tamaño de la celda, pero también puede deberse a diferencias en el contenido de ARN. Como tal incorporación, de este procedimiento es particularmente relevante para los sistemas experimentales que utilizan, entre otras, las células sometidas a estrés genotóxico, las células tratadas con los fármacos detención del ciclo celular como la timidina o hidroxiurea, las células infectadas por virus, y estudios sobre las células embrionarias en la progresión del desarrollo se caracteriza por cambios discretos en la síntesis del ARN celular.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por una de Ciencias Naturales e Ingeniería del Consejo Canadiense de la subvención (NSERC) de investigación y una Agricultura de Alberta financiación del Consorcio otorga a DRB. AMR está apoyado por una beca NSERC Vanier canadiense de Posgrado, de la Universidad de Alberta ayudantía de enseñanza y la reina Isabel II de becas de postgrado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x PBS-/- | |||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes, Life Technologies | A13201 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | |
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
References
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