Afleiding van thymus lymfoom T-cel-Lines uit Atm ^{- / - En P53 - / - Muizen}

Summary

In deze video zien we een protocol om de muis thymus lymfoom cellijnen vast te stellen. Door het volgen van dit protocol, hebben we met succes een aantal T-cellijnen van ATM-/ - en p53-/ - muizen met thymus lymfoom.

Abstract

Gevestigde cellijnen zijn een kritisch onderzoek tool die het gebruik van proefdieren kunnen verminderen in het onderzoek. Bepaalde stammen van genetisch gemodificeerde muizen, zoals ATM ^{- / -} en p53 ^{- / -} consequent te ontwikkelen thymus lymfoom vroeg in het leven ^1,2, en dus kunnen dienen als een betrouwbare bron voor afleiding van muriene T-cellijnen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de ontwikkeling van bestaande muizen thymus lymfoom T-cellijnen zonder de noodzaak om interleukines zoals beschreven in de vorige protocollen ^1,3 toe te voegen. Tumoren werden geoogst uit muizen leeftijd van drie tot zes maanden, ten vroegste aanwijzing van zichtbare tumoren gebaseerd op de observatie van de gebogen houding, moeilijke ademhaling, slechte verzorging en verspillen in een vatbare stam ^1,4. We hebben met succes een aantal T-cellijnen met behulp van dit protocol en inteeltstammen van ATM ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] ² en p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ muizen. We verder zien dat meer dan 90% van de gevestigde T-cel populatie CD3, CD4 en CD8 uitdrukt. In overeenstemming met stabiel gevestigde cellijnen, hebben de T-cellen gegenereerd met behulp van het huidige protocol is gepasseerd voor meer dan een jaar.

Protocol

1. Dissectie van Tumor

1. Voor tumor dissectie, is een schone handdoek of papieren wegwerp chirurgische draperen op de dissectie pad en besproeid met 70% ethanol.
2. Muizen voor dit protocol worden routinematig geëuthanaseerd met CO _2. Plaats de inslapen muis op de dissectie pad en spuit beide kanten van het dier met ethanol. De muis is op zijn plaats gehouden op de dissectie pad met behulp van vier of meer push pins ingebracht door de benen en grondig bespoten met 70% ethanol.
3. De huid over de middellijn is gesneden uit het schaambeen aan de basis van het hoofd door met steriele schaar, terwijl het vermijden van de onderliggende spieren en dringen in de lichaamsholten.
4. Open de buikholte met een nieuw paar steriele schaar en pincet voorzichtig om geen schade aan de interne organen.
5. Open de borstholte door het ontleden en het afbuigen van de ribbenkast naar de tumor te onthullen, zonder schade aan de bloedvaten.
6. Scheid de tumor van andere organen, en de overdracht van een stuk van ongeveer 40-50% van de totale tumor (ongeveer tot 1,5 x 0,8 x 0,8 cm) in koud PBS op ijs bewaard.
7. Het resterende deel van de tumor kan worden opgeslagen voor andere assays en een volledige autopsie kan worden uitgevoerd op dit moment.

2. Het kweken van lymfoomcellen

1. Spuit de buis met de ontleedde tumor met 70% ethanol en over te dragen aan een bioveiligheid kast.
2. Voeg 10 ml van de cultuur medium om een steriele 150 mm ² petrischaal.
3. Overdracht het stuk van de tumor in de petrischaal met zachte zuigkracht met een pipet.
4. Buig twee steriele 18 gauge naald met uitzicht op de schuine kant naar buiten.
5. Distantiëren van de tumor met behulp van de gebogen naalden.
6. Swirl de schotel, tik en de plaats een hoek ten opzichte van de celsuspensie te verzamelen om een ​​kant, terwijl het vermijden van grote stukken van de tumor.
7. Aspireren de celsuspensie en breng in een 50 ml conische buis terwijl het vermijden van grote stukken van de tumor.
8. Was de plaat met 10 ml medium en zetten in dezelfde buis terwijl het vermijden van grote stukken van de tumor.
9. Meng de celsuspensie samengesteld uit lymfocyten en stromale cellen voorzichtig en breng 5 ml in een T-25 weefselkweek kolf en 10 ml in een T-75 weefselkweek kolf. Zwenk de kolven.
10. Gebruik de resterende celsuspensie tot en met 2, 4, 10100 en 1000 verdunningen te maken in 2,5 ml eindvolume (het kweken van cellen in verschillende dichtheden met behulp van verschillende types van kweekvaten maximaliseert de kans dat de oprichting van een T-cel lijn).
11. Plaat 2,0 ml van elke verdunning in afzonderlijke putjes van een 6-wells plaat. Zwenk de plaat.
12. Incubeer de cellen gedurende 48 uur in bevochtigde CO ₂ atmosfeer in de lucht.

3. Feeding lymfoomcellen

1. Na 48 uur incubatie, voeg 5 ml van medium tot de T-25 kolf en 10 ml van medium tot de T-75 fles langs de muur met een minimale verstoring van de cellen.
2. Voeg 2 ml medium aan elk putje van de 6-wells plaat langs de muur met een minimale verstoring van de cellen.
3. Incubeer de cellen voor een extra 72 uur

4. Passage lymfoomcellen

1. Eerste passage
   1. Aan het eind van de vijfde dag van de incubatie worden de cellen gepasseerd op een 1:1-verhouding, met behoud van de oorspronkelijke kolven en platen (het handhaven van de cel-dichtheid bij een concentratie van ongeveer 3x106 / ml tijdens de eerste passages bevordert succesvolle vestiging van een continue cellijn).
      1. Voor de T-25 kolf overdracht 5 ml celsuspensie in een nieuwe kolf met 5 ml medium. Voeg 5 ml medium in de originele kolf.
      2. Voor de T-75 vat, overdracht 10 ml celsuspensie in een nieuwe fles met 10 ml medium. Voeg 10 ml medium in de originele kolf.
      3. Voor de 6-well plaat, overdracht 2 ml celsuspensie uit elk putje in de overeenkomstige putjes van een nieuwe plaat met 2 ml medium in elk putje. Voeg 2 ml medium in elk putje van de originele bronnen.
   2. Incubeer alle kolven en platen voor een extra 72 uur In onze ervaring de meeste cellijnen zijn vastgesteld op basis van deze passage een cultuur (de aanwezigheid van los hechtende schorsing cel aggregaten op de bijgevoegde stromale cellen is een eerste indicatie van een gevestigde cellijn).
   3. Voor de culturen met minder of geen losse aanhanger schorsing cel aggregaten, voer de kolven of platen door voorzichtig te vervangen ongeveer 50% van het medium elke 72 uur Om te voorkomen dat het verwijderen van cellen uit de oorspronkelijke cultuur, zijn kweekvaten blijven staan ​​en ongestoord gedurende minstens 5 minuten naar de cellen te laten sediment op de bodem door de zwaartekracht voor de behoedzame aspiratie van het supernatant medium.
2. Behoud van gevestigde cellijnen
   1. Gevestigde cellijnen zijn gepasseerd in nieuwe flessen en borden. Voor de T-25 en T-75 flessen, voeg 5 ml van het origineel ofpassage een schorsing in 5 ml medium. Voor de 6-well platen, voeg 3 ml van de oorspronkelijke of passage een celsuspensie in 7 ml medium in een T-25 kolf. Voeden en behouden van de oorspronkelijke of passage een cultuur door het vervangen van het volume verwijderd met vers kweekmedium.
   2. Passage cellijnen opgericht in nieuwe T-25 kolven. De cel-lijnen hebben een verdubbeling tijd 18-24 uur De culturen routinematig gehandhaafd op een dichtheid van 1-3x106 / ml en gepasseerd om de 3 dagen. Voeg de vereiste volume van eerdere passage cultuur om nieuwe medium in te halen tot 10 ml. Feed en behoud van de oorspronkelijke cultuur.
   3. Na een paar passages, zullen de niet-hechtende cellen zelf houden zonder dat de hechtende stromale cellen en een kleiner aantal adherente cellen worden overgenomen bij elke passage. Voorbij dit punt, kan de culturen worden gehouden in niet-weefselkweek behandelde T-25 kolven.

5. Invriezen en herstellen Lymfoom cellijnen

1. De cellijnen zijn bevroren in vers bereid RPMI 1640 medium dat 20% FBS en 10% DMSO.
2. Cellen van een 48 uur oude cultuur in de T-25 vat (ongeveer 1.5x10 ⁶ cellen / ml) worden gecentrifugeerd bij 1500 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na het afleggen van het supernatant worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 2 ml koud bevriezing medium. Twee 1,0 mL volumes celsuspensie van elke kolf worden geplaatst in het vriespunt flacons, direct ingevroren bij -80 ° C, en overgebracht naar vloeibare stikstof de volgende dag.
3. Cellen worden teruggewonnen uit vloeibare stikstof opslag door snel ontdooien, en resuspenderen de inhoud van 10 ml vers kweekmedium. Als alternatief worden vers ontdooid cellen eenmaal gewassen in warm kweekmedium aan het DMSO te verwijderen voordat resuspenderen in 10 ml vers kweekmedium. De cellen worden gekweekt voor ten minste 72 uur voordat de volgende passage.

6. Representatieve resultaten

Een ATM ^{- / -} T-cellijn ontwikkeld met behulp van dit protocol en aangeduid DWJ-ATM-1 werd gekenmerkt door kleuring met anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC en anti-CD8-PE en flowcytometrie-analyse (figuur 1). Meer dan 90% van de T-cellen werden CD3, CD4 en CD8 triple-positief.

Figuur 1. Karakterisering van een T-cellijn ontwikkeld met behulp van dit protocol.

Het celoppervlak markers van een gevestigde Atm ^{- / -} cellijn aangewezen DWJ-ATM-1 werden gekenmerkt door kleuring met anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, anti-CD8-PE en flowcytometrie-analyse. In het kort werden 1x10 ⁶ verse cellen eenmaal gewassen met koud PBS (1500 rpm / 5 min), en geïncubeerd bij 4 ° C gedurende 10 minuten met 200 ul van antilichaam cocktail (elk antilichaam bij 1:200 verdunning in PBS met 1% BSA. Cellen kunnen direct worden onderzocht, terwijl vers of vast voor latere analyse. Fixed cellen zijn bereid door toevoeging van neutrale gebufferde formaline in een 4% (vol / vol) eindconcentratie en geïncubeerd bij 4 ° C gedurende 30 min, geoogst door centrifugeren (1500 rpm / 5 min) en geresuspendeerd in 200 pi van PBS met 1% BSA. Een totaal van 1 X 10 ⁴ cellen werden geanalyseerd met behulp van een BD FACS Calibur analyser en CellQuest software (BD Biosciences, San Jose, CA).

Discussion

In dit protocol, bieden we gedetailleerde procedures voor muriene T-cellijnen te stellen uit twee verschillende muis genotypen; Atm ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] en p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . Door het gebruik van dit protocol, een totaal van zes (van de 7 pogingen) Atm ^{- / -} en drie (van de 5 pogingen) p53 ^{- / -} muizen T-cel-lijnen zijn vastgelegd in ons laboratorium. Representatieve gegevens waaruit blijkt dat cellijn DWJ-ATM-1, een ATM ^{- / -} cellijn bestaat uit een cel populatie waarin meer dan 90% van de cellen te drukken CD3, CD4 en CD8 oppervlakte markers te bevestigen dat klonale T-cellijn kan worden opgericht met behulp van onze protocol.

Ontwikkeling van muizen T-cellijnen is gemeld ^3,6,7, maar gedetailleerde protocollen voor de oprichting van deze lijnen zijn niet eerder beschreven. Hoewel slechts twee muis genotypen werden gebruikt voor de afleiding van muriene T-cellijnen in ons laboratorium zijn wij van mening dat deze procedures van toepassing zijn op een breed scala van spontane T-cel lymfomen gevonden in andere stammen van muizen, zoals Kras defect, en mogelijk andere diersoorten. Muriene T-cellijnen hebben potentiële toepassingen in het begrijpen van fundamentele vragen in de immunologie en oncologie. Momenteel zijn we met behulp van deze cellijnen in studies gericht op het karakteriseren van gastheer-pathogeen interacties en genotoxin-geïnduceerde cytotoxiciteit waaronder de mechanismen van cel cyclus arrest en apoptose. Gezien het feit dat muizen T-cellijnen genomische veranderingen, zoals verwijderingen van PTEN en FBXW7 gemeen met acute menselijke T-cel-lymfoblastische leukemie en lymfomen delen, zijn ze bijzonder geschikt voor onderzoek naar kanker biologie ^acht, en kan verdere toepassingen voor een snelle pre -klinische effectiviteit van immunologische screening en kanker chemotherapeutische middelen in vitro. Of deze cellijnen kunnen worden gekweekt in vivo in een van beide syngene of immuungecompromitteerde muizen is nog niet vastgesteld.

In tegenstelling tot eerdere protocollen waarin de succesvolle oprichting van een T-cel line-up duurde tot drie maanden ^zes, cellijnen ontwikkeld met behulp van het huidige protocol was ingesteld binnen een maand (tussen de passage 2-8). We vonden dat de aanwezigheid van los hechtende cel aggregaten meer dan bevestigd stromale cellen is een kritische eerste indicatie van een gevestigde cellijn. Om ervoor te zorgen muriene T-cellen voor onbepaalde tijd te propageren, vonden we ook dat het belangrijk is om te vertrekken de eerste losjes aanhanger celaggregaten ongestoord tijdens de voedingen. Daarnaast, het onderhouden van de cel dichtheid bij een concentratie van ongeveer 3x10 ⁶ / ml tijdens de eerste passages bevordert ook de succesvolle oprichting van een continue cellijn. In onze ervaring, het kweken van cellen in verschillende dichtheden met behulp van verschillende types van kweekvaten maximaliseert de kans dat de oprichting van een T-cellijn. De meeste T-cel-lijnen werden vastgesteld op basis van T-75 flessen of 6-well platen en 10 of 100 voudige verdunningen die overeenkomen met ongeveer 1x10 1x10 ⁷ of ⁶ cellen / ml. Een eerdere protocol aanbevolen kweken van cellen die op 5 x 10 ^6, 1 x10 ^7, en 2 x 10 ⁷ cellen per putje in 6-well platen, en het voeden na 7 dagen (7). We zagen dat het voeren van de eerste culturen op 48 uur en passage 72 uur later, op dag 5 optimaal is. Langer wachten voordat de eerste voeding en de passage zorgt ervoor dat de cellen om hun levensvatbaarheid te verliezen en te delen te stoppen.

De laatste parameter die we hebben gevonden is van cruciaal belang voor een succesvolle voortplanting van muriene T-cellen in vitro is de aanwezigheid van FBS in het kweekmedium dat de snelle celgroei kunnen ondersteunen. Verschillende partijen en leveranciers van FBS moet voorafgaand worden gescreend aan de start van de afleiding van T-cellijnen voor de identificatie van een geschikt reagens. Als muis T-cellijnen zijn niet beschikbaar voor screening, primaire culturen van thymus lymfocyten geplaatst in putjes van een 24-wells plaat bij een concentratie van 1x10 ⁶ per ml van de test-medium dat Concanavaline A (1μg / ml) om een snelle celgroei te stimuleren is voldoende. In de aanwezigheid van een optimale bron van FBS moet het aantal cellen verdubbelen elke 18 tot 24 uur

Materials

Ice bucket 70% ethanol Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins Two sets of small sterile scissors and forceps Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13) Sterile 18 gauge needles 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829) 10% buffered formalin Tissue culture flasks T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025) T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075) 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506) Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS) Culture medium RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following: 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03) 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI) 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI) 55 mM 2β-mercapt–thanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752) Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275) Antibodies (eBioScience, San Diego, CA) anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85) anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83) anti-CD8-PE (cat.#12-081-85) Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017) Concanavalin A (Sigma cat# C5275) 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)