Thymic लिंफोमा से टी सेल लाइन्स की व्युत्पत्ति एटीएम / - और P53 / - चूहे

Summary

इस वीडियो में हम एक प्रोटोकॉल के लिए माउस thymic लिंफोमा सेल लाइनों की स्थापना प्रदर्शित करता है. और p53 / - thymic लिंफोमा के साथ चूहों इस प्रोटोकॉल का अनुसरण करके, हम सफलतापूर्वक एटीएम / से कई टी सेल लाइनों की स्थापना की है.

Abstract

स्थापित सेल लाइनों एक महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण है कि अनुसंधान में प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग को कम कर सकते हैं. , जैसे एटीएम आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के कुछ उपभेदों ^{- / -} और p53 ^{- / -} लगातार thymic लिंफोमा ^1,2 जीवन में जल्दी विकसित करने, और इस प्रकार, murine टी सेल लाइनों की व्युत्पत्ति के लिए एक विश्वसनीय स्रोत के रूप में सेवा कर सकते हैं. यहाँ हम के रूप में पिछले ^1,3 प्रोटोकॉल में वर्णित interleukins जोड़ने की जरूरत के बिना में स्थापित murine thymic लिंफोमा टी सेल लाइनों के विकास के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे. ट्यूमर तीन से छह महीने के आयु वर्ग के चूहों से काटा गया, hunched मुद्रा के अवलोकन के आधार पर दिखाई ट्यूमर के जल्द से जल्द संकेत पर, श्वास, ^गरीब संवारने और एक अतिसंवेदनशील तनाव 1,4 में बर्बाद कर अस्वाभाविक. ^{/ - -} [FVB/N- एटीएम ^tm1Led / जम्मू] ² और p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / जम्मू] ⁵ चूहों हम सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर कई टी सेल लाइनों और एटीएम की जन्मजात उपभेदों की स्थापना की है. हम आगे दिखाना है कि टी सेल स्थापित जनसंख्या के 90% से अधिक CD3 सीडी 4, और CD8 व्यक्त. लगातार stably स्थापित सेल लाइनों के साथ, वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न टी कोशिकाओं को एक वर्ष से अधिक के लिए किया गया passaged है.

Protocol

1. ट्यूमर के विच्छेदन

1. ट्यूमर विच्छेदन के लिए, एक साफ कागज तौलिया या डिस्पोजेबल सर्जिकल कपड़ा विच्छेदन पैड पर रखा गया है और 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव.
2. इस प्रोटोकॉल के लिए चूहे को _{नियमित} सीओ 2 के साथ euthanized हैं विच्छेदन पैड पर euthanized माउस प्लेस और इथेनॉल के साथ स्प्रे जानवर के दोनों पक्षों. माउस विच्छेदन पैड पर जगह में चार या अधिक धक्का पैरों के माध्यम से डाला और 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से छिड़काव पिन का उपयोग कर के द्वारा आयोजित किया जाता है.
3. midline से अधिक त्वचा बाँझ कैंची का उपयोग करते हुए, जबकि अंतर्निहित मांसपेशियों से बचने और शरीर cavities में प्रवेश करके pubis से सिर के आधार करने के लिए काट रहा है.
4. उदर गुहा बाँझ कैंची और संदंश आंतरिक अंगों को नुकसान नहीं सावधान किया जा रहा की एक नई जोड़ी के साथ खोलें.
5. विदारक और रिब पिंजरे deflecting हानिकारक रक्त वाहिकाओं के बिना ट्यूमर प्रकट के द्वारा वक्ष गुहा खोलें.
6. अन्य अंगों से ट्यूमर अलग, और ठंड पीबीएस में कुल ट्यूमर का लगभग 40-50% (लगभग 1.5 से 0.8 एक्स एक्स 0.8 सेमी) टुकड़े हस्तांतरण बर्फ पर रखा है.
7. ट्यूमर का शेष भाग अन्य assays के लिए सहेजा जा सकता है और एक पूरी necropsy इस समय पर किया जा सकता है.

2. संवर्धन लिंफोमा कोशिकाओं

1. 70% इथेनॉल और एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए स्थानांतरण के साथ dissected ट्यूमर युक्त ट्यूब स्प्रे.
2. एक बाँझ 150 मिमी ² पेट्री डिश के लिए संस्कृति के माध्यम के 10 एमएल जोड़ें .
3. पेट्री डिश में एक विंदुक के साथ कोमल चूषण द्वारा ट्यूमर का टुकड़ा स्थानांतरण.
4. दो बाँझ 18 गेज सुई beveled पक्ष का सामना करना पड़ रहा बाहर बेंड.
5. ट्यूमर तुला सुइयों का उपयोग कर अलग कर देना.
6. पकवान भंवर, धीरे से नल और एक कोण पर जगह एक ओर सेल निलंबन इकट्ठा, जबकि ट्यूमर के बड़े टुकड़ों से बचने.
7. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन और स्थानांतरण Aspirate जबकि ट्यूमर के बड़े टुकड़ों से बचने.
8. मध्यम और हस्तांतरण के 10 एमएल के साथ ही ट्यूब में थाली जबकि ट्यूमर के बड़े टुकड़ों से बचने धो.
9. सेल लिम्फोसाइटों और stromal कोशिकाओं धीरे से बना निलंबन मिक्स और T-25 एक ऊतक संस्कृति फ्लास्क और 10 एमएल में एक T-75 टिशू कल्चर फ्लास्क में 5 एमएल हस्तांतरण. धीरे बोतल ज़ुल्फ़.
10. शेष सेल निलंबन का प्रयोग 2.5 एमएल अंतिम मात्रा (अलग संस्कृति वाहिकाओं के कई प्रकार का उपयोग घनत्व पर संवर्धन कोशिकाओं टी सेल लाइन की स्थापना की संभावना अधिकतम) में 2, 4, 10,100 और 1000 गुना dilutions.
11. 6 अच्छी तरह से एक थाली के अलग - अलग कुओं में प्रत्येक कमजोर पड़ने की प्लेट 2.0 एमएल. धीरे थाली ज़ुल्फ़.
12. हवा में humidified सीओ ₂ माहौल में 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं .

3. लिंफोमा कोशिकाओं खिला

1. ऊष्मायन के 48 घंटे के बाद, फ्लास्क T-25 और मध्यम की 10 एमएल कोशिकाओं के कम से कम अशांति के साथ दीवार के साथ 5 एमएल के माध्यम T-75 फ्लास्क को जोड़ने.
2. दीवार के साथ कोशिकाओं के कम से कम अशांति के साथ 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए माध्यम की 2 एमएल जोड़ें.
3. एक अतिरिक्त 72 एच. के लिए कोशिकाओं सेते

4. लिंफोमा कक्ष passaging

1. प्रारंभिक बीतने
   1. ऊष्मायन के पांचवें दिन के अंत में, कोशिकाओं एक 1:1 के अनुपात में passaged हैं, जबकि मूल बोतल और प्लेटें (लगभग 3x106 एमएल / एक एकाग्रता में पहली मार्ग के दौरान सेल घनत्व को बनाए रखने के एक सफल स्थापना को बढ़ावा देता है बनाए रखने सतत कोशिका लाइन).
      1. T-25 फ्लास्क के लिए, एक नए माध्यम की 5 एमएल युक्त कुप्पी में सेल निलंबन के 5 एमएल हस्तांतरण. मूल फ्लास्क में मध्यम 5 एमएल जोड़ें.
      2. T-75 फ्लास्क के लिए एक नया माध्यम के 10 एमएल युक्त कुप्पी में सेल निलंबन के 10 एमएल हस्तांतरण. मूल फ्लास्क में मध्यम के 10 एमएल जोड़ें.
      3. 6 अच्छी तरह से थाली के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक कुएं में एक नया माध्यम की 2 एमएल युक्त थाली की इसी कुओं में सेल निलंबन के 2 एमएल हस्तांतरण. मूल कुओं में से प्रत्येक में अच्छी तरह से मध्यम की 2 एमएल जोड़ें.
   2. एक अतिरिक्त 72 एच. के लिए सभी बोतल और प्लेटें सेते हमारे अनुभव में सबसे सेल लाइनों इन बीतने के एक संस्कृतियों (संलग्न stromal कोशिकाओं से अधिक शिथिल पक्षपाती निलंबन सेल समुच्चय की उपस्थिति की स्थापना की एक सेल लाइन का एक प्रारंभिक संकेत है) से स्थापित कर रहे हैं.
   3. कम या कोई शिथिल पक्षपाती निलंबन सेल समुच्चय के साथ संस्कृतियों के लिए, ध्यान से मध्यम हर 72 एच. के लगभग 50% की जगह द्वारा बोतल या प्लेटें फ़ीड मूल संस्कृति से कोशिकाओं को हटाने से बचने के लिए, संस्कृति वाहिकाओं खड़े हैं और कम से कम 5 मिनट के लिए undisturbed के नीचे सतह पर तैरनेवाला मध्यम की कोमल आकांक्षा से पहले गंभीरता से कोशिकाओं तलछट जाने के लिए छोड़ दिया जाता है.
2. स्थापित सेल लाइनों बनाये
   1. स्थापित सेल लाइनों को नई बोतल और प्लेट में passaged हैं. T-25 और T-75 बोतल के लिए, मूल या 5 एमएल जोड़ेंपारित माध्यम के 5 एमएल में एक निलंबन. 6 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, एक T-25 फ्लास्क में 7 माध्यम की एमएल में मूल या बीतने एक सेल निलंबन के 3 एमएल जोड़ें. फ़ीड और ताजा संस्कृति के माध्यम से हटा मात्रा की जगह के द्वारा मूल या बीतने संस्कृति को बनाए रखने.
   2. नई T-25 बोतल में पारित होने सेल लाइनों की स्थापना की. सेल लाइनों 18-24 एच. के एक दुगनी समय है संस्कृतियों नियमित 1-3x106 एमएल / के घनत्व पर रखा जाता है और हर passaged 3 दिन. नए माध्यम के 10 एमएल बनाने के लिए पिछले बीतने संस्कृति की आवश्यक मात्रा में जोड़ें. फ़ीड और मूल संस्कृति को बनाए रखने.
   3. कुछ अंश के बाद, गैर पक्षपाती कोशिकाओं आत्म पक्षपाती stromal कोशिकाओं के बिना को बनाए रखने और पक्षपाती कोशिकाओं की एक छोटी संख्या पर प्रत्येक बीतने के साथ किया जाता है. इस बिंदु से परे है, संस्कृतियों गैर टिशू कल्चर में बनाए रखा जा सकता है T-25 बोतल इलाज.

5. बर्फ़ीली और पुनर्प्राप्त लिंफोमा सेल लाइन्स

1. सेल लाइनों हौसले से तैयार RPMI 1640 20% FBS और 10% DMSO युक्त मध्यम में जमे हुए हैं.
2. T-25 फ्लास्क (1.5x10 लगभग ⁶ कोशिकाओं / एमएल) में एक 48 घंटे की पुरानी संस्कृति से कक्ष कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर centrifuged हैं. कोशिकाओं रहे हैं सतह पर तैरनेवाला discarding के बाद, ठंड ठंड माध्यम से 2 एमएल में फिर से निलंबित कर दिया. दो 1.0 प्रत्येक कुप्पी से सेल निलंबन के एमएल मात्रा ठंड शीशियों में रखा जाता है, तुरंत -80 पर जमे हुए डिग्री सेल्सियस, और तरल नाइट्रोजन के लिए अगले दिन स्थानांतरित कर दिया.
3. कक्ष तरल नाइट्रोजन भंडारण से त्वरित विगलन, और ताजा संस्कृति के माध्यम के 10 एमएल में resuspending सामग्री बरामद कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, हौसले thawed कोशिकाओं को एक बार गर्म संस्कृति माध्यम में धो रहे हैं पहले ताजा संस्कृति के माध्यम के 10 एमएल में resuspending DMSO हटायें. कोशिकाओं को बाद में पारित होने से पहले कम से कम 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत हैं.

6. प्रतिनिधि परिणाम

एक एटीएम ^{/ -} टी सेल लाइन इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर विकसित और नामित DWJ - एटीएम-1 विरोधी CD3-FITC, विरोधी सीडी 4-APC और विरोधी CD8 पीई और प्रवाह cytometry विश्लेषण (Figure1) के साथ धुंधला हो जाना द्वारा विशेषता थी. टी कोशिकाओं के 90% से अधिक CD3 सीडी 4, और CD8 ट्रिपल पॉजिटिव थे.

चित्रा 1 टी सेल लाइन इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर विकसित की विशेषता है .

^{/ - -} एक स्थापित एटीएम की कोशिका की सतह मार्करों सेल लाइन नामित DWJ - एटीएम-1 के साथ धुंधला हो जाना द्वारा विशेषता थे विरोधी CD3 FITC, विरोधी CD4 APC, विरोधी CD8-पीई और प्रवाह cytometry विश्लेषण. संक्षेप में, 1x10 ⁶ ताजा कोशिकाओं को एक बार ठंड पीबीएस (1500 rpm / 5 मिनट) में धोया थे, और 4 में incubated ° सी 1% BSA साथ 1:200 पीबीएस में कमजोर पड़ने पर 200 एंटीबॉडी (कॉकटेल प्रत्येक एंटीबॉडी के μL के साथ 10 मिनट के लिए. कक्ष तुरंत जांच की जा सकती है जबकि ताजा या बाद में विश्लेषण के लिए निर्धारित फिक्स्ड कोशिकाओं जोड़ने बफर तटस्थ formalin द्वारा 4% (/ खंड खंड) अंतिम एकाग्रता में तैयार कर रहे हैं और 4 ° C में incubated 30 मिनट, centrifugation द्वारा काटा (के लिए 1500 rpm / 5) मिनट और 1% BSA के साथ 200 पीबीएस की μL में resuspended है. 1 ^{एक्स 10} 4 कोशिकाओं की कुल बी.डी. FACS Calibur विश्लेषक और CellQuest सॉफ्टवेयर (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, CA) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम दो अलग माउस जीनोटाइप से murine टी सेल लाइनों की स्थापना, ^{एटीएम /} - [FVB/N- ^{एटीएम} tm1Led / जम्मू] और ^{p53 -} / के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं ^{प्रदान करते} हैं - ^[129/S6- Trp53 / tm1Tyj जम्मू] . ^{/ -} और तीन (बाहर 5 प्रयास) p53 ^{- / -} इस प्रोटोकॉल, 6 की कुल (7 के प्रयास के बाहर) एटीएम का उपयोग करके murine टी सेल लाइनों हमारी प्रयोगशाला में स्थापित किया गया है. ^{/ -} प्रतिनिधि है कि सेल लाइन DWJ - एटीएम-1, एक एटीएम का प्रदर्शन डेटा कोशिका लाइन में जो कोशिकाओं व्यक्त CD3, CD4 और CD8 सतह मार्करों के 90% से अधिक की पुष्टि करते हैं कि clonal टी सेल लाइन किया जा सकता है एक सेल आबादी के होते हैं हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर स्थापित किया गया था.

Murine टी सेल लाइनों का विकास ^3,6,7 सूचित किया गया है, तथापि, इन लाइनों की स्थापना के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल पहले से वर्णित नहीं है . हालांकि केवल दो माउस जीनोटाइप हमारी प्रयोगशाला में murine टी सेल लाइनों की व्युत्पत्ति के लिए इस्तेमाल किया गया है, हम विश्वास है कि इन प्रक्रियाओं सहज टी सेल lymphomas दोषपूर्ण क्रास जैसे चूहों के अन्य उपभेदों में पाया की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू होते हैं , और संभवतः अन्य जानवरों की प्रजातियों. Murine टी सेल लाइनों इम्यूनोलॉजी और ऑन्कोलॉजी में बुनियादी सवालों को समझने में संभावित आवेदन किया है. वर्तमान में, हम मेजबान रोगज़नक़ बातचीत कोशिका चक्र गिरफ्तारी और apoptosis के तंत्र सहित और genotoxin प्रेरित cytotoxicity निस्र्पक करने के उद्देश्य से अध्ययन में इन सेल लाइनों का उपयोग कर रहे हैं. यह देखते हुए कि murine टी सेल लाइनों तीव्र मानव टी सेल लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया और lymphomas के साथ आम में PTEN और FBXW7 के विलोपन के रूप में जीनोमिक परिवर्तन का हिस्सा है, वे विशेष रूप से अच्छी तरह से कर ^रहे हैं कैंसर जीव विज्ञान आठ में अनुसंधान के लिए अनुकूल है, और तेजी से पूर्व के लिए आगे अनुप्रयोगों हो सकता है और इन विट्रो में प्रतिरक्षाविज्ञानी कैंसर chemotherapeutic एजेंट की प्रभावकारिता नैदानिक ​​स्क्रीनिंग. निर्धारित किया गया है, चाहे या नहीं इन सेल लाइनों या तो syngeneic या immunocompromised चूहों में vivo में प्रचारित नहीं किया जा सकता है.

पिछले प्रोटोकॉल जिसमें एक टी सेल लाइन के सफल स्थापना के तीन ⁶ महीने, सेल लाइनों वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग कर विकसित करने के लिए ले लिया करने के लिए इसके विपरीत में एक महीने के भीतर स्थापित किए गए थे (08/02 बीतने के बीच) . हमने पाया है कि संलग्न stromal कोशिकाओं से अधिक शिथिल पक्षपाती सेल समुच्चय की उपस्थिति एक स्थापित सेल लाइन का एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक संकेत है. आदेश में murine टी - कोशिकाओं को अनिश्चित काल के प्रचार के लिए अनुमति देने के लिए, हम यह भी पाया कि यह महत्वपूर्ण है प्रारंभिक शिथिल पक्षपाती सेल feedings के दौरान undisturbed समुच्चय छोड़. इसके अलावा, 3x10 लगभग ⁶ एमएल / के एक एकाग्रता में पहली मार्ग के दौरान सेल घनत्व को बनाए रखने के एक सतत कोशिका लाइन के सफल स्थापना को बढ़ावा देता है. हमारे अनुभव में, अलग संस्कृति वाहिकाओं के कई प्रकार का उपयोग घनत्व पर संवर्धन कोशिकाओं टी सेल लाइन की स्थापना की संभावना अधिकतम. हाल टी सेल लाइनों T-75 बोतल या 6 अच्छी तरह प्लेटें और 10 या 100 गुना dilutions जो 1x10 लगभग ⁷ या 1x10 ⁶ कोशिकाओं / एमएल के अनुरूप से स्थापित किए गए थे. पिछले एक प्रोटोकॉल 5 10 x ⁶ 1 ⁷ x10, और 2 x 6 अच्छी तरह प्लेटें में 10 ⁷ में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं में संवर्धन कोशिकाओं सिफारिश की है, और 7 दिनों (7) के बाद खिला . हम ने कहा कि 48 घंटे बीतने के और 72 घंटे में प्रारंभिक संस्कृतियों के बाद 5 दिन पर, भोजन के लिए इष्टतम है. पहली खिलाने और पारित होने से पहले अब इंतजार कर कोशिकाओं उनकी व्यवहार्यता को खोने के लिए और विभाजित रोक का कारण होगा.

पिछले पैरामीटर है जो हमने पाया है इन विट्रो में murine टी कोशिकाओं के सफल प्रचार करने के लिए महत्वपूर्ण है संस्कृति माध्यम है कि तेजी से सेल के विकास का समर्थन कर सकते हैं में FBS की उपस्थिति है. FBS के विभिन्न बहुत और आपूर्तिकर्ताओं के लिए एक उपयुक्त अभिकर्मक की पहचान के लिए टी सेल लाइनों की व्युत्पत्ति की शुरुआत से पहले जांच करना चाहिए. यदि murine टी सेल लाइनों स्क्रीनिंग के लिए उपलब्ध नहीं हैं, thymic 1x10 परीक्षण के माध्यम से एमएल concanavalin ए (1μg / एमएल) से युक्त करने के लिए तेजी से सेल के ^{विकास} को प्रोत्साहित 6 प्रतिशत की एक एकाग्रता में 24 अच्छी तरह से एक थाली के कुओं में रखा लिम्फोसाइटों के प्राथमिक संस्कृतियों पर्याप्त है. FBS की एक इष्टतम स्रोत की उपस्थिति में, कोशिकाओं की संख्या में हर 18 से 24 एच. डबल चाहिए

Materials

Ice bucket 70% ethanol Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins Two sets of small sterile scissors and forceps Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13) Sterile 18 gauge needles 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829) 10% buffered formalin Tissue culture flasks T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025) T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075) 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506) Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS) Culture medium RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following: 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03) 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI) 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI) 55 mM 2β-mercapt–thanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752) Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275) Antibodies (eBioScience, San Diego, CA) anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85) anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83) anti-CD8-PE (cat.#12-081-85) Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017) Concanavalin A (Sigma cat# C5275) 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)