Derivazione di timica linfoma a cellule T Linee da Atm ^{- / - E P53 - / - Mouse}

Summary

In questo video si dimostra un protocollo per stabilire le linee del mouse linfoma delle cellule del timo. Seguendo questo protocollo, abbiamo stabilito con successo diverse linee di cellule T da Atm-/ - e p53-/ - i topi con linfoma del timo.

Abstract

Linee cellulari stabilizzate sono uno strumento di ricerca critica che può ridurre l'uso di animali da laboratorio nella ricerca. Alcuni ceppi di topi geneticamente modificati, come Atm ^{- / -} e p53 ^{- / -} costantemente sviluppare linfoma timico primi anni di vita ^1,2, e quindi, può servire come una fonte affidabile per la derivazione di cellule T murino linee. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per lo sviluppo di linfoma timico stabilito murino linee di cellule T, senza la necessità di aggiungere interleuchine, come descritto in precedenti protocolli ^1,3. I tumori sono stati raccolti dai topi di età compresa tra tre a sei mesi, alla prima indicazione di tumori visibili basa sull'osservazione della postura ingobbita, respiro affannoso, governare poveri e sprecare in un ^1,4 ceppo sensibile. Abbiamo stabilito con successo diverse linee di cellule T usando questo protocollo e ceppi inbred di Atm ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] ² e p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ topi. Abbiamo inoltre dimostrato che oltre il 90% della stabilito cellule T popolazione esprime CD3, CD4 e CD8. Coerentemente con le linee cellulari in modo stabile, le T-cellule generate utilizzando il protocollo attuale sono stati diversi passaggi per oltre un anno.

Protocol

1. Dissezione di tumore

1. Per la dissezione del tumore, un tovagliolo di carta pulito o teli chirurgici monouso viene posto sulla rampa di dissezione e spruzzato con il 70% di etanolo.
2. I topi di questo protocollo sono regolarmente eutanasia con CO _2. Eutanasia Posizionare il mouse sul tappetino dissezione e spruzzare su entrambi i lati dell'animale con etanolo. Il mouse è tenuto in posizione sul pad dissezione utilizzando quattro o più push-pin inseriti attraverso le gambe e spruzzato abbondantemente con etanolo al 70%.
3. La pelle sopra la linea mediana è tagliato dal pube fino alla base della testa usando forbici sterili, evitando i muscoli sottostanti e penetrando nelle cavità del corpo.
4. Aprire la cavità addominale con un nuovo paio di forbici sterili e pinze facendo attenzione a non danneggiare gli organi interni.
5. Aprire la cavità toracica da sezionare e deviando la gabbia toracica per rivelare il tumore, senza danneggiare i vasi sanguigni.
6. Separare il tumore da altri organi, e trasferire un pezzo di circa il 40-50% del tumore totale (circa fino a 1,5 X 0,8 X 0,8 cm) in PBS freddo tenuta in ghiaccio.
7. La parte restante del tumore possono essere salvate per altri test e una necroscopia completa può essere eseguita in questo momento.

2. Coltura Cellule Linfoma

1. Spruzzare il tubo contenente il tumore sezionato con il 70% di etanolo e trasferirli in un armadio biosicurezza.
2. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura ad una sterile 150 mm ² piastra di Petri.
3. Trasferire il pezzo di tumore nella capsula di Petri di aspirazione delicata con una pipetta.
4. Piegare due sterili 18 gauge rivolto verso il lato smussato fuori.
5. Dissociare il tumore con gli aghi piegati.
6. Agitare il piatto, toccare leggermente e porre in un angolo per raccogliere la sospensione cellulare ad un lato, evitando grossi pezzi di tumore.
7. Aspirare la sospensione cellulare e trasferire in una provetta da 50 ml conica, evitando grossi pezzi di tumore.
8. Lavare la piastra con 10 ml di medio e di trasferimento all'interno del tubo stesso, evitando grossi pezzi di tumore.
9. Mescolare la sospensione cellulare composto da linfociti e cellule stromali delicatamente e trasferire 5 ml in un T-25 fiasco di coltura tissutale e 10 ml in un T-75 fiasco di coltura tissutale. Mescolare delicatamente i fiaschi.
10. Utilizzare la sospensione di cellule rimanenti per fare diluizioni 2, 4, 10100 e 1000 volte in 2,5 ml di volume finale (la coltura delle cellule in diverse densità utilizzando diversi tipi di recipienti di coltura massimizza la probabilità di stabilire una linea di cellule T).
11. Piastra di 2,0 ml di ciascuna diluizione in singoli pozzetti di un 6-pozzetti. Agitare delicatamente la piastra.
12. Incubare le cellule per 48 ore in atmosfera umidificata CO ₂ in aria.

3. Alimentazione cellule del linfoma

1. Dopo 48 ore di incubazione, aggiungere 5 ml di terreno al T-25 pallone e 10 ml di medio-T-75 fiasco lungo la parete con il minimo disturbo delle cellule.
2. Aggiungere 2 ml di medium in ciascun pozzetto della piastra ben 6 lungo la parete con il minimo disturbo delle cellule.
3. Incubare le cellule per ulteriori 72 ore

4. Passaging cellule del linfoma

1. Passaggio iniziale
   1. Alla fine del quinto giorno di incubazione, le cellule sono diversi passaggi con un rapporto 1:1, pur mantenendo i palloni originali e piatti (mantenendo la densità delle cellule ad una concentrazione di circa 3x106 / ml durante i passaggi prima istituzione promuove il successo di un linea cellulare continua).
      1. Per il T-25 borraccia, trasferire da 5 ml di sospensione cellulare in un pallone nuovo contenente 5 ml di terreno. Aggiungere 5 ml di terreno nel pallone originale.
      2. Per il T-75 fiasco, il trasferimento di 10 ml di sospensione cellulare in un pallone nuovo che contiene 10 ml di mezzo. Aggiungere 10 ml di terreno nel pallone originale.
      3. Per il 6-pozzetti, trasferimento 2 ml di sospensione cellulare da ogni pozzetto nei pozzetti corrispondenti di una nuova piastra contenente 2 ml di mezzo in ogni bene. Aggiungere 2 ml di mezzo in ciascun pozzetto della pozzi originale.
   2. Incubare tutti i palloni e le piastre per altre 72 ore Nella nostra esperienza più linee cellulari sono stabiliti da questi passaggio uno culture (la presenza di aggregati sospensione liberamente aderente cellule nel corso del cellule stromali allegato è una prima indicazione di una linea di cellule prestabilite).
   3. Per le culture con meno o nessun vagamente aderente aggregati di cellule sospensione, nutrire i palloni o piastre con attenzione la sostituzione di circa il 50% della media ogni 72 h. Per evitare di rimuovere le cellule dalla cultura d'origine, recipienti di coltura sono rimasto in piedi e indisturbati per almeno 5 minuti per consentire il sedimento cellule in basso dalla forza di gravità prima di aspirazione dolce del mezzo sopranatante.
2. Il mantenimento di linee cellulari stabilizzate
   1. Linee cellulari stabilizzate sono diversi passaggi in fiaschi e nuovi piatti. Per i T-25 e T-75 boccette, aggiungere 5 ml dell'originale opassaggio una sospensione in 5 ml di terreno. Per 6-pozzetti, aggiungere 3 ml di originale o di passaggio una sospensione di cellule in 7 ml di mezzo in un T-25 pallone. Mangimi e conservare l'originale o passaggio una cultura sostituendo il volume rimosso con terreno di coltura fresco.
   2. Passaggio stabilito linee cellulari in nuovi T-25 fiaschi. Le linee di cellule hanno un tempo di raddoppio di 18-24 h. Le culture sono regolarmente mantenuti ad una densità di 1-3x106 / ml e diversi passaggi ogni 3 giorni. Aggiungere il volume richiesto di cultura passaggio precedente al nuovo mezzo per rendere fino a 10 ml. Mangimi e mantenere la cultura d'origine.
   3. Dopo alcuni passaggi, il non-aderenti cellule si auto senza sostenere le cellule stromali aderenti e un minor numero di cellule aderenti sono riportati ad ogni passaggio. Al di là di questo punto, le culture possono essere mantenuti in non tessuto coltura trattata T-25 fiaschi.

5. Congelamento e Recupero linee cellulari linfoma

1. Le linee cellulari sono preparati al momento congelati in RPMI 1640 medium contenente 20% FBS e il 10% di DMSO.
2. Cellule di una coltura di 48 h vecchio T-25 pallone (circa 1.5x10 ⁶ cellule / ml) sono centrifugate a 1500 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, le cellule sono risospese in 2 ml di medium freddo gelo. Due volumi di 1,0 ml di sospensione cellulare da ciascuno dei palloni sono collocati in fiale congelamento, immediatamente congelati a -80 ° C, e trasferito ad azoto liquido il giorno successivo.
3. Le cellule sono recuperate dallo stoccaggio di azoto liquido da scongelamento rapido, e risospendere il contenuto in 10 ml di terreno di coltura fresco. In alternativa, le cellule vengono lavate appena scongelato una volta terreno di coltura caldo per rimuovere il DMSO prima di risospendere in 10 ml di terreno di coltura fresco. Le cellule sono coltivate per almeno 72 ore prima del passaggio successivo.

6. Rappresentante Risultati

Un Atm ^{- / -} T-linea cellulare sviluppato usando questo protocollo e designato dwj-Atm-1 è stato caratterizzato da colorazione con anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC e anti-CD8-PE e analisi di citometria a flusso (Figura 1). Più del 90% delle cellule T sono state CD3, CD4 e CD8 triple-positivi.

Figura 1. Caratterizzazione di una linea di cellule T sviluppato usando questo protocollo.

I marcatori di superficie cellulare di un Atm stabilito ^{- / -} linea cellulare designato dwj-Atm-1 sono stati caratterizzati da colorazione con anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, anti-CD8-PE e analisi di citometria a flusso. In breve, 1x10 ⁶ cellule fresche sono stati lavati una volta in PBS freddo (1500 giri / 5 min), e incubate a 4 ° C per 10 minuti con l di cocktail di anticorpi (ogni anticorpo a diluizione 1:200 in PBS con 1% BSA 200. Le cellule possono essere esaminate immediatamente mentre le cellule fisso freschi o fisso per la successiva analisi. vengono preparati con l'aggiunta di formalina tamponata neutra ad una concentrazione del 4% (vol / vol) finale e incubate a 4 ° C per 30 minuti, raccolte mediante centrifugazione (1500 rpm / 5 min) e risospeso in 200 ml di PBS con BSA 1%. Un totale di 1 x 10 ⁴ cellule sono state analizzate utilizzando un BD FACS Calibur analizzatore e CellQuest software (BD Biosciences, San Jose, CA).

Discussion

In questo protocollo, forniamo le procedure particolareggiate per stabilire murino linee di cellule T da due genotipi differenti del mouse; Atm ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] e p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . Usando questo protocollo, per un totale di 6 (su 7 tentativi) Atm ^{- / -} e tre (su 5 tentativi) p53 ^{- / -} murini linee di cellule T sono state istituite nel nostro laboratorio. Dati rappresentativi dimostrando che linea cellulare dwj-Atm-1, un Atm ^{- / -} linea cellulare è costituito da una popolazione di cellule in cui più del 90% della esprimere cellule CD3, CD4 e CD8 marcatori di superficie conferma che clonale di cellule T linea può essere stabilita utilizzando il nostro protocollo.

Sviluppo di murino linee di cellule T è stata riportata ^3,6,7, tuttavia, protocolli dettagliati per stabilire queste linee non sono state descritte in precedenza. Anche se solo due genotipi del mouse sono stati utilizzati per la derivazione di murino linee di cellule T nel nostro laboratorio, noi crediamo che queste procedure sono applicabili a una vasta gamma di spontanea linfomi a cellule T si trovano in altri ceppi di topi come as Kras difettosa, e potenzialmente altre specie animali. Murino linee di cellule T hanno potenziali applicazioni nella comprensione dei problemi di base di immunologia e oncologia. Attualmente, stiamo utilizzando queste linee cellulari in studi volti a caratterizzare interazioni ospite-patogeno e genotoxin indotta citotossicità preveda meccanismi di arresto del ciclo cellulare e apoptosi. Dato che murino linee di cellule T parti alterazioni genomiche quali delezioni di PTEN e FBXW7 in comune con leucemia linfoblastica acuta umana a cellule T e linfomi, sono particolarmente adatti per la ricerca in biologia del cancro ^8, e potrebbe avere ulteriori applicazioni per una rapida pre -efficacia di uno screening clinico immunologico e cancro agenti chemioterapici in vitro. Se queste linee cellulari possono essere propagati in vivo nei topi sia singenici o immunocompromessi non è stata determinata.

A differenza di precedenti protocolli in cui stabilimento di successo di una linea di cellule T hanno fino a tre mesi ^6, linee cellulari sviluppato utilizzando il protocollo attuale sono stati istituiti entro un mese (tra il passaggio 2-8). Abbiamo scoperto che la presenza di aggregati di cellule debolmente aderenti oltre attaccato cellule stromali è un'indicazione fondamentale primi di una linea di cellule prestabilite. Al fine di consentire murino cellule T per propagare indefinitamente, abbiamo anche scoperto che è importante lasciare gli aggregati iniziale delle cellule debolmente aderenti indisturbati durante la poppata. Inoltre, il mantenimento della densità cellulare ad una concentrazione di circa 3x10 ⁶ / ml durante i primi passaggi promuove anche all'istituzione di successo di una linea cellulare continua. Nella nostra esperienza, le cellule in coltura di diverse densità utilizzando diversi tipi di recipienti di coltura massimizza la probabilità di stabilire una linea di cellule-T. La maggior parte delle linee di cellule T sono state stabilite da T-75 fiaschi o 6-pozzetti e 10 o 100 diluizioni che corrispondono a circa ⁷ o 1x10 1x10 ⁶ cellule / ml. Un precedente protocollo raccomandato cellule di coltura a 5 x 10 ^6, 1 x10 ⁷ e 2 x 10 ⁷ cellule per bene in 6 pozzetti, e l'alimentazione dopo 7 giorni (7). Abbiamo osservato che l'alimentazione culture iniziale a 48 ore e 72 h passaggio più tardi, il giorno 5 è ottimale. In attesa più lunghi prima che la prima poppata e farà sì che il passaggio di cellule perdono la loro vitalità e smettono di dividersi.

L'ultimo parametro che abbiamo trovato è fondamentale per la propagazione di successo di T-cellule murine in vitro è la presenza di FBS nel terreno di coltura in grado di supportare la rapida crescita delle cellule. Vari lotti e fornitori di FBS dovrebbe essere sottoposto a controllo prima di iniziare la derivazione di linee di cellule T per l'identificazione di un appropriato reagente. Se murino linee di cellule T non sono disponibili per lo screening, colture primarie di linfociti del timo posto in pozzetti di una piastra da 24 pozzetti ad una concentrazione di 1x10 ⁶ per ml di mezzo di prova che contiene concanavalina A (1μg / ml) per stimolare la crescita rapida delle cellule è adeguata. In presenza di una fonte ottimale di FBS, il numero di celle dovrebbe raddoppiare ogni 18 a 24 ore

Materials

Ice bucket 70% ethanol Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins Two sets of small sterile scissors and forceps Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13) Sterile 18 gauge needles 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829) 10% buffered formalin Tissue culture flasks T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025) T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075) 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506) Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS) Culture medium RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following: 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03) 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI) 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI) 55 mM 2β-mercapt–thanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752) Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275) Antibodies (eBioScience, San Diego, CA) anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85) anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83) anti-CD8-PE (cat.#12-081-85) Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017) Concanavalin A (Sigma cat# C5275) 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)