Summary
このビデオでは、マウス胸腺リンパ腫細胞株を確立するためのプロトコルを示す。およびp53 - / - - 胸腺リンパ腫を有するマウスはこのプロトコルに従うことによって、我々は成功したいくつかのATM - /からT -細胞株を確立している。
Abstract
確立された細胞株は、研究に実験動物の使用を減らすことができる重要な研究ツールです。特定のATMのような遺伝子改変マウスの系統、 - / - および p53 - / -は一貫して、人生の早い段階1,2の胸 腺リンパ腫を開発し、その結果、マウスのT細胞株の導出のための信頼できるソースとして利用することができます。ここでは、前述のプロトコール1,3で説明されているインターロイキンを追加することなく、確立されたマウス胸腺リンパ腫のT細胞株の開発のための詳細なプロトコールを提示する。腫瘍が3〜6カ月歳のマウスから採取した、猫背の姿勢の観察に基づいて、目に見える腫瘍の最も初期に通知されたときに、貧しいグルーミングおよび感受性株の1,4の浪費、呼吸をこじつけ。 / - - [FVB/N- 櫃tm1Led / J] 2 と p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5匹のマウス我々は正常にこのプロトコルを使用していくつかのT -細胞株および ATMの近交系を確立している。我々はさらに確立されたT細胞集団の90％以上がCD3、CD4とCD8を発現していることを示しています。安定的に確立された細胞株と一致し、現在のプロトコルを使用して生成されるT細胞は、一年以上継代されています。
Protocol
1。腫瘍の解剖
- 腫瘍切開の場合は、きれいなペーパータオルや使い捨て外科用ドレープは、解剖のパッド上に配置され、70％エタノールを噴霧。
- このプロトコルのためのマウスは、定期的にCO 2で安楽死されています。解剖パッドで安楽死させたマウスを重ね、エタノールで動物の両面をスプレー。マウスは足を通して挿入し、70％エタノールで十分に噴霧し、4つ以上のプッシュピンを使用して解剖のパッド上に固定されています。
- 正中線上の皮膚が下層にある筋肉を回避し、体腔内に浸透しながら、滅菌済みのハサミを使って、恥骨から頭のベースにカットされます。
- 内臓を損傷しないように注意して滅菌済みのハサミとピンセットの新しいペアと腹腔を開きます。
- 血管を傷つけることなく、腫瘍を明らかにするために胸郭を解剖し、偏向して胸腔を開きます。
- 他の臓器から腫瘍を分離し、冷PBSに合計腫瘍（約最大1.5 × 0.8 × 0.8センチ）の約40〜50％の部分を転送するには、氷上で保存。
- 腫瘍の残りの部分は、他のアッセイのために保存することができ、完全な剖検は、この時点で行うことができます。
2。培養リンパ腫細胞
- 70％エタノールとバイオセーフティキャビネットへの転送で切除した腫瘍を含むチューブをスプレーしてください。
- 無菌150ミリメートル2ペトリ皿に培地10mLを追加します。
- ピペットで穏やかな吸引により、シャーレに腫瘍の一部を譲渡する。
- 斜めの面を外向きtwo滅菌18ゲージの針を曲げます。
- 曲がった針を用いて腫瘍を取り除きます。
- 渦巻料理は、優しくタップして、腫瘍の大部分を回避しながら、側に細胞懸濁液を収集するために斜めに置きます。
- 腫瘍の大部分を回避しながら、50 mLコニカルチューブに細胞懸濁液と転送を吸引除去する。
- 腫瘍の大部分を回避しながら、同じチューブに培地と転送10mLでプレートを洗浄してください。
- 優しくリンパ球とストローマ細胞から成る細胞懸濁液を混合し、T - 75組織培養フラスコにT - 25組織培養フラスコ、10 mLに5 mLを転送する。優しくスワールフラスコを。
- 2.5mLの最終容量（培養容器のいくつかのタイプを使用して異なる密度で細胞を培養T細胞ラインを確立するの尤度を最大）に2、4、10100、1000倍希釈液を作るために、残りの細胞懸濁液を使用してください。
- 6ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ希釈のプレート2.0 mLを。優しくスワールプレートを。
- 空気中の加湿CO 2雰囲気下で48時間細胞をインキュベートする。
3。摂食リンパ腫細胞
- インキュベーションの48時間後、細胞の軽微な障害を持つ壁に沿ってT - 75フラスコに、T - 25フラスコおよび培地10mLに培地5mLを加える。
- 細胞の軽微な障害を持つ壁に沿って6ウェルプレートの各ウェルに培地2 mlを加え。
- 追加の72時間細胞をインキュベート
4。リンパ腫細胞を継代
- 最初の一節
- オリジナルのフラスコやプレートを（最初の継代の間に約3x106 / mLの濃度で細胞密度を維持するのに成功確立を促進維持しながら、インキュベーション5日目の終わりに、細胞は、1:1の比率で継代されています連続的な細胞株）。
- T - 25フラスコは、培地5 mLを含む新しいフラスコに細胞懸濁液5 mLを転送する。オリジナルのフラスコに培地5mLを追加。
- T - 75フラスコは、培地10 mLを含む新しいフラスコに細胞懸濁液10mLを転送する。オリジナルのフラスコに培地10mLを追加。
- 6ウェルプレートの場合は、各ウェルに培地2mLを含む新しいプレートの対応するウェルに各ウェルから細胞懸濁液の2 mLを転送する。オリジナルのウェルの各ウェルに培地2 mlを加え。
- 追加の72時間のすべてのフラスコやプレートをインキュベート我々の経験ではほとんどの細胞系は、これらの通路one文化（添付のストローマ細胞上にゆるく付着懸濁細胞凝集体の存在が確立された細胞株の早期の指示である）から確立されています。
- より少ない、またはまったく緩く接着懸濁細胞凝集体との文化のために、慎重に培地ごとに72時間の約50％を置き換えることにより、フラスコやプレートを供給オリジナルの培養液から細胞を削除しないように、培養容器は、地位、上清培地の穏やかな吸引の前に重力により下部の細胞の沈殿をさせるには、少なくとも5分間静置されています。
- オリジナルのフラスコやプレートを（最初の継代の間に約3x106 / mLの濃度で細胞密度を維持するのに成功確立を促進維持しながら、インキュベーション5日目の終わりに、細胞は、1:1の比率で継代されています連続的な細胞株）。
- 樹立した細胞株の維持
- 樹立した細胞株は、新しいフラスコやプレートに継代されています。 T - 25およびT - 75フラスコのため、オリジナルの5 mLを追加したり、培地5mLに通過oneサスペンション。 6ウェルプレートの場合は、T - 25フラスコに培地7mlの中にオリジナルまたは通過つのセルの懸濁液3 mLを加える。餌と新鮮な培養液で除去量に置き換えることによって、オリジナルまたは通路一つの文化を保持する。
- 通路は、新しいT - 25フラスコに細胞株を確立した。細胞株は、18〜24時間の倍加時間を持っている文化は日常的に1 - 3x106 / mLの密度で維持し、3日毎に継代されています。 10mLに補うために新しい培地に、以前の継代培養の必要量を追加。フィードと独自の文化を保持。
- いくつかの継代後、非接着細胞は、自己接着性間質細胞なしで維持されると付着細胞のより小さい数は、各通路に引き継がれます。このポイントを超えて、文化は、T - 25フラスコを扱う非組織培養で維持することができます。
5。リンパ腫細胞株の凍結およびリカバリ
- 細胞株は、20％FBS、10％のDMSOを含む新しく調製したRPMI 1640培地中で凍結されています。
- T - 25フラスコ（約1.5 × 10 6細胞/ mL）で48時間古い文化からの細胞を室温で5分間1500rpmで遠心分離されています。廃棄上清をした後、細胞を冷凍結培地2mlに再懸濁されている。各フラスコから細胞懸濁液の2つの1.0 mLのボリュームは、凍結バイアルに入れ、直ちに-80℃で凍結し、翌日、液体窒素に転送されます。
- 細胞は急速解凍、そして新鮮な培地10mLに内容を再懸濁することにより、液体窒素貯蔵から回収されています。また、新たに解凍した細胞は、新鮮な培養液10mlに再懸濁する前に、DMSOを除去するために暖かい培地で一度洗浄されています。細胞は、その後の継代する前に少なくとも72時間培養する。
6。代表的な結果
ATMは - / - T細胞ラインこのプロトコルを使用して開発し、指定さDWJ - ATM - 1は抗CD3 - FITC、抗CD4 - APCおよび抗CD8 - PEとフローサイトメトリー分析（図1）で染色することを特徴とした。 T -細胞の90％以上は、CD3、CD4およびCD8三重陽性であった。
図1は、このプロトコルを使用して開発されたT細胞ラインのキャラクタリゼーション。
/ - -確立された櫃の細胞表面マーカーDWJ - ATM - 1、指定された細胞株は、抗CD3 - FITC、抗CD4 - APCで染色、抗CD8 - PEとフローサイトメトリー分析によって特徴づけた。簡単に言えば、1 × 10 6、新鮮な細胞は、（回転数1500rpm / 5分）冷PBSで一度洗浄し、4℃でインキュベートした抗体のカクテル（各抗体を1％BSAを含むPBSで1:200希釈で200μLの10分間。新鮮なまたは後の分析用に固定。固定細胞を4％（vol / vol）の最終濃度で加える中性緩衝ホルマリンで準備し、遠心分離により収集30分、（のために4℃でインキュベートしている間、細胞は、即時に取り調べることができる回転数1500rpm / 5分）と1％BSAを含むPBS 200μLで再懸濁し、1 × 10 4細胞の総数は、BD FACSキャリバーアナライザとCellQuestソフトウェア（BD Biosciences社、サンノゼ、CA）を用いて分析した。
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Discussion
このプロトコルでは、我々は二つの異なるマウスの遺伝子型からマウスT細胞株を樹立するための詳細な手順を提供し、 - / - [FVB/N- 櫃tm1Led / J] と p53 - / -櫃 [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 。 / - -三（5回の試行のうち）p53の- / -このプロトコルは、6の合計（7回のうち）ATMを使って、マウスのT細胞株は、当研究室で確立されている。 / - -その細胞株DWJ - ATM - 1、 櫃を実証代表的なデータのセルラインは、細胞はCD3、CD4およびCD8表面マーカーの90％以上は、そのクローン性T細胞ラインは次のようにできることを確認した細胞集団で構成されています私たちのプロトコルを使用して確立。
マウスT細胞株の開発は、3,6,7が報告されているが、これらのラインを確立するための詳細なプロトコールは、以前に記載されていない。唯一の2つのマウスの遺伝子型が我々の研究室でマウスT細胞株の導出のために使用されたが、我々はこれらの手順はこのような欠陥のある、潜在的に他のKrasのようなマウスの他の株に見られる自発的なT細胞リンパ腫の広い範囲に適用可能であることを信じて動物種。マウスT細胞株は、免疫学、腫瘍学における基本的な質問を理解する上で潜在的なアプリケーションを持っている。現在、我々は、宿主 - 病原体相互作用と細胞周期停止とアポトーシスのメカニズムを含む、遺伝毒性物質誘発細胞毒性の特性を目的とした研究ではこれらの細胞株を使用しています。マウスT細胞株は急性ヒトT細胞リンパ芽球性白血病およびリンパ腫との共通点などPTENとFBXW7の削除などのゲノム変化を共有していることを考えると、彼らは特に癌生物学8での研究に適しています、そして迅速なプレさらにアプリケーションがあるかもしれませんin vitroでの免疫学と癌化学療法剤の臨床効果のスクリーニング。これらの細胞株を同系または免疫不全のどちらのマウスで生体内で伝播することができるか否かが判断されていません。
T細胞ラインの成功確立が3カ月6、現在のプロトコルを使用して開発された細胞株に取り上げたれる以前のプロトコルとは対照的に（継代2月8日の間）ヶ月以内に設立された。我々は、添付されたストローマ細胞上に緩く接着細胞の凝集体の存在が確立された細胞株の重要な早期の指示であることがわかった。マウスT細胞が無限に伝播することを可能にするために、我々はまた、授乳時に邪魔されずに初期緩く接着細胞の凝集体を残すことが重要であることがわかった。さらに、最初の通路の間に約3 × 10 6 / mLの濃度で細胞密度を維持することも、連続的な細胞株の成功確立を推進しています。我々の経験では、培養容器のいくつかのタイプを使用して異なる密度で培養する細胞はT細胞ラインを確立する可能性を最大化します。ほとんどのT細胞ラインはT - 75フラスコまたは6ウェルプレートと約1 × 10 7または1 × 10 6細胞/ mLに相当する10または100倍希釈から確立された。以前のプロトコルでは、5 × 10 6、1 × 10 7、6ウェルプレートにウェル当たり2 × 10 7細胞での細胞培養をお勧めします、と7日間（7）の後に供給。我々は最初の48時間で培養し、継代を供給すると72時間後、5日目に最適であることを観察した。第一給餌と通過する前に長く待っていると、細胞がその生存を失い、分裂を停止する原因となります。
我々はin vitroで T細胞マウスの正常な伝播に重要な発見最後のパラメータは、細胞の急速な成長をサポートできる培地中のFBSの存在です。 FBSの異なるロットとサプライヤーは、適切な試薬の同定のためのT細胞ラインの導出を開始する前にスクリーニングすべきである。マウスT細胞株は、スクリーニングに利用できない場合、急速な細胞増殖を刺激するコンカナバリンAを（1μgの/ mL）を含む試験培地1mlあたり1 × 10 6の濃度で24ウェルプレートのウェルに配置された胸腺リンパ球の一次培養十分です。 FBSの最適なソースの存在下で、細胞の数は、18〜24時間を倍にしてください
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、有用な議論をコロンビア大学で微生物学免疫学教室から博士ボリスReizisに感謝したい。我々はまた、フローサイトメトリーおよびビデオ編集の支援のための陸黄との技術援助のために獣医学部の大学、コーネル大学で微生物学免疫学専攻から博士マーガレットバイノー、博士ロッドマンゲッチェルとDeequa Mahamedに感謝したい。 - / -マウス著者らはまた、p53を繁殖し、遺伝子型決定のためにワイス研究所からその重要な原稿や映像制作の見直し、そしてステファニーYazinskiためデュアメルとワイスの研究室のメンバーに感謝したい。動物実験は、コーネル大学動物実験用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。この研究は米国農務省、協同組合の国家研究、教育、および拡張サービス、動物の健康と疾病の研究プログラム（GEDおよびRSWに）とNIHの助成金R03 HD058220とR01CA108773（RSWまで）で提供される資金によって部分的にサポートされていました。ビデオはデュアメル＆ヴァイス研究所から担当者が社内の設備を用いて作製した。
Materials
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References
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