Timik Lenfoma T-hücre Hatları türetilmesi Atm ^{- / - Ve P53 - / - Fare}

Summary

Bu video, fare timik lenfoma hücre hatları kurmak için bir protokol göstermektedir. Ve p53-/ - farelerde timus lenfoma ile bu protokolü takip ederek, başarıyla birkaç Atm / T-hücre hatları kurduk.

Abstract

Kurulan hücre hatları araştırma laboratuvar hayvanları kullanımını azaltmak kritik bir araştırma aracı. ATM gibi genetiği değiştirilmiş farelerde Bazı suşları ^{/ -} ve p53 ^{- / -} sürekli erken ömrü ^1,2 timik lenfoma geliştirmek, ve böylece, fare T-hücre hatları türetilmesi için güvenilir bir kaynak olarak hizmet verebilir. Burada gerek kalmadan önceki protokoller ^1,3 açıklandığı gibi interlökinler eklemek için kurulan fare timik lenfoma T-hücre gelişimi için ayrıntılı bir protokol mevcut. Tümörler, hunched duruş gözlem dayalı görünür tümörlerin erken göstergesi, üç ila altı ay arası farelerden alınan hasat nefes alma, yetersiz bakım ve duyarlı bir gerginlik ^1,4 de israf yorucu. ^{/ -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] ² ve p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ fareler Biz bu protokolü kullanarak çeşitli T-hücre hatları ve Atm kendilenmiş suşları başarıyla kurduk. Daha kurulan T-hücre nüfusunun% 90'dan daha fazla CD3, CD4 ve CD8 ifade ettiğini göstermektedir. Stably kurulan hücre hatları ile tutarlı, mevcut protokolü kullanılarak üretilen T-hücrelerinin, bir yılı aşkın bir süredir geçişli olmuştur.

Protocol

1. Tümör diseksiyonu

1. Tümör diseksiyonu için, temiz bir kağıt havlu ya da tek kullanımlık cerrahi örtü diseksiyon pad üzerinde yerleştirilir ve% 70 etanol ile püskürtülür.
2. Fareler, bu protokol için rutin olarak _CO 2 ile ötenazi ötenazi fare diseksiyon yastık yerleştirin ve etanol ile hayvanın her iki tarafta sprey . Bacakları içeri sokulur ve% 70 etanol ile iyice püskürtülür dört veya daha fazla itme pimleri kullanarak fare diseksiyonu ped üzerine bir yerde tutulur.
3. Steril makas kullanılarak altta yatan kasları kaçınarak ve vücut boşluklarında nüfuz ederken, orta hat üzerinde cilt pubis kafa tabanına kesilir.
4. Steril makas ve forseps iç organların zarar vermemeye dikkat ederek yeni bir çift ile karın boşluğuna açın.
5. Diseksiyon ve zararlı kan damarları olmadan ortaya çıkarmak için, tümörün göğüs kafesi saptırma ile göğüs boşluğu açın.
6. Diğer organlarda tümör ayırın ve soğuk PBS içine bir parça toplam tümör yaklaşık% 40-50 (yaklaşık 1.5 X 0.8 X 0.8 cm) transfer buz üzerinde tutulmalıdır.
7. Tümör kalan kısmı diğer deneyleri için kaydedilebilir ve tam bir nekropsi şu anda yapılabilir.

2. Kültürleme Lenfoma Hücreler

1. % 70 etanol ve biyogüvenlik kabini transfer disseke tümör içeren tüp püskürtün.
2. Steril bir 150 mm ² Petri kabı için 10 ml kültür ortamı ekleyin.
3. Petri kabı içine bir pipet ile hafif bir emme parça tümör aktarın.
4. Eğimli yan bakan iki steril 18 iğne bükün.
5. Bükülmüş iğneler kullanarak tümör ayrıştırmaları.
6. Swirl çanak hafifçe dokunun ve tümör büyük parça kaçınırken, bir yan hücre süspansiyonu toplamak için bir açıyla yerleştirin.
7. Tümörün büyük parça kaçınırken, 50 ml konik bir tüp içine hücre süspansiyonu ve transfer aspire edin.
8. Tümörün büyük parça kaçınırken, aynı tüp içine 10 ml orta ve transferi ile plaka yıkayın.
9. , Hafifçe lenfositler ve stromal hücrelerden oluşan hücre süspansiyonu karıştırın ve bir T-75 doku kültürü balona bir T-25 doku kültürü şişesi ve 10 ml 5 ml transfer. Matara yavaşça girdap.
10. 2.5 mL son hacmi (kültür damarlarının çeşitli türleri kullanarak farklı yoğunlukları kültür hücreleri T-hücre hattı kurulması olasılığını en üst düzeye çıkarır), 2, 4, 10.100 ve 1000 kat dilüsyonları yapmak için kalan hücre süspansiyonu kullanın.
11. 6 plaka bireysel kuyulara her seyreltme Levha 2.0 mL. Yavaşça girdap plakası.
12. Nemlendirilmiş CO ₂ atmosferde hava hücreler 48 saat inkübe edin.

3. Besleme Lenfoma Hücreleri

1. Inkübasyon 48 saat sonra hücrelerin minimal rahatsızlık ile duvar boyunca orta, T-75 balona T-25 orta şişeyi ve 10 ml 5 ml ekleyin.
2. 6 plaka hücrelerin minimal rahatsızlık ile duvar boyunca her iyi orta 2 mL ekleyin.
3. Ek bir 72 saat için hücreler inkübe

4. Lenfoma Hücreleri Pasajlanması

1. İlk pasaj
   1. Inkübasyon beşinci günün sonunda orijinal şişeler ve levhalar (ilk geçişleri sırasında yaklaşık 3x106 / ml 'lik bir konsantrasyon hücre yoğunluğu korumak başarılı bir şekilde kurulması teşvik koruyarak, hücreler, 1:1 oranında geçişli. sürekli hücre hattı).
      1. T-25 şişesi için 5 ml orta içeren yeni bir balona, ​​5 ml hücre süspansiyonu aktarın. Orijinal balona orta 5 ml ekleyin.
      2. T-75 şişesi için, 10 ml orta içeren yeni bir balona 10 ml hücre süspansiyonu transfer. Orta orijinal balona 10 ml ekleyin.
      3. 6 plaka için, her iyi orta 2 mL içeren yeni bir plaka ilgili kuyuların içine 2 ml hücre süspansiyonu her bir kuyudan aktarın. Orijinal kuyuların her bir kuyunun içine orta 2 mL ekleyin.
   2. Ek bir 72 saat boyunca tüm matara ve plakalar inkübe Bizim tecrübelerimize göre en hücre hatları bu geçit bir kültürler (gevşek yapışık süspansiyon hücre agrega varlığı ekli stromal hücreleri üzerinde kurulmuş bir hücre hattı erken bir göstergesidir) kurulmuştur.
   3. Az ya da gevşek olarak yapışmış bir süspansiyon hücre agrega ile kültürleri için, dikkatli bir şekilde her 72 saat orta yaklaşık% 50 değiştirerek matara veya plakalar beslemek Orijinal kültür hücreleri kaldırarak önlemek için, kültür damarları supernatant orta hafif aspirasyon önce yerçekimi altındaki hücreleri tortu izin soluklu ve en az 5 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakılır.
2. Kurulan hücre hatları bakımı
   1. Kurulan hücre hatları, yeni şişeler ve tabaklar içine geçişli. T-25 ve T-75 şişeler için, orijinal veya 5 ml ekleyingeçmesine orta 5 ml süspansiyon. 6-iyi plakalar için, T-25 balonuna orta 7 mL aslı veya geçit bir hücre süspansiyonu 3 mL ekleyin. Yem ve taze kültür ortamı ile temizlenebilir hacmi değiştirerek bir kültür aslı veya geçit korumak.
   2. Passage, yeni T-25 şişeler içine hücre hatları kurdu. 18-24 saat hücre hatları iki katına zaman var Kültürleri rutin olarak 1-3x106 / ml yoğunlukta devam ve 3 gün her geçişli. Önceki pasaj kültürünün gerekli hacmi, 10 ml telafi etmek için yeni bir orta ekleyin. Yem ve özgün kültürünü korumak.
   3. Birkaç pasajlar sonra, yapışmaz hücreler kendini yapışık stromal hücreler olmadan sürdürmek ve yapışık hücrelere daha küçük bir sayı her geçiş yapılır. Bu noktanın ötesinde, kültürleri, T-25 şişeler tedavi olmayan doku kültürü muhafaza edilebilir.

5. Lenfoma Hücre Hatları dondurulması ve Kurtarma

1. Hücre hatları% 20 FBS ve% 10 DMSO içeren taze hazırlanmış RPMI 1640 orta dondurulur.
2. T-25 balonuna (yaklaşık 1.5x10 ⁶ hücre / ml) 48 saat eski kültür Hücreler oda sıcaklığında 5 dakika 1500 rpm'de santrifüj. Atarak süpernatantı sonra, 2 mL soğuk dondurma orta hücrelerin yeniden askıya alınır. Her balona iki hücre süspansiyonu 1.0 mL hacimli hemen -80 dondurulmuş, donma şişeleri yerleştirilir ° C, ve ertesi gün sıvı azot aktarılır.
3. Hücreler, hızlı bir çözülme ve 10 ml taze kültür ortamı içindekilerin resuspending sıvı azot depolama kurtarıldı. Alternatif olarak, 10 ml taze kültür ortamı resuspending önce DMSO kaldırmak için taze çözülmüş hücreler ılık kültür ortamı kez yıkanır. Hücreleri sonraki geçirilmesinden önce en az 72 saat süreyle kültüre.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bir Atm ^{/ -} T-hücre hattı bu protokolü kullanılarak geliştirilen ve belirlenmiş DWJ-Atm-1 anti-CD3-FITC, anti-CD4 APC ve anti-CD8-PE ve akış sitometri analizi (Şekil 1) ile boyama ile karakterize edilmiştir. T-hücrelerinin% 90'dan fazlası, CD3, CD4 ve CD8 triple-pozitif.

Şekil 1 bu protokolü kullanarak geliştirilen T-hücre hattı Karakterizasyonu.

^{/ - -} Kurulmuş bir Atm hücre yüzey belirteçleri hücre hattı DWJ-Atm-1 ile boyanması ile karakterize edilmiştir atanmış anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, anti-CD8-PE ve flow sitometri analizi. Kısaca, 1x10 ⁶ taze hücreler soğuk PBS (1500 d / 5 dk) bir kez yıkanmış ve 4 inkübe ° C, PBS içinde% 1 BSA ile 1:200 dilüsyon antikor kokteyli (her antikor mcL 200 ile 10 dk . taze veya daha sonra analiz için sabit. Sabit hücreleri bir final konsantrasyon% 4 (hacim / hacim) ekleyerek nötr tamponlu formalin tarafından hazırlanan ve 30 dakika santrifüj yoluyla hasat, (4 ° C'de inkübe ise hücreler hemen incelenebilir 1500 d / 1 X 10 ⁴ hücrelerinin toplam 5 dakika) ve% 1 BSA ile PBS 200 mcL yeniden bekletildi. BD FACS Calibur analizörü ve CellQuest yazılımı (BD Biosciences, San Jose, CA) kullanılarak analiz edildi.

Discussion

Bu protokolde, iki farklı fare genotipleri fare T-hücre hatları kurmak için ayrıntılı yordamlar sağlar; ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] ve p53 ^{- / -} Atm [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . ^{/ -} Ve üç (5 girişimleri), p53 ^{- / -} Bu protokol, 6 olmak üzere toplam (7 girişimleri) Atm kullanarak fare T-hücre laboratuvarda kurulmuştur. ^{/ -} Bu hücre hattı DWJ-Atm-1, bir Atm gösteren Temsilcisi veri hücre hattı hücreleri açık CD3, CD4 ve CD8 yüzey belirteçleri% 90 daha bu klonal T-hücre hattı olabilir teyit hangi bir hücre popülasyonu oluşur Bizim protokolü kullanılarak kurulmuştur.

Fare T-hücre hatlarının geliştirilmesi ^3,6,7 bildirilmiştir; Ancak, önce bu satırları kurulması için ayrıntılı protokol olarak tanımlanmıştır . Laboratuvarımızda fare T-hücre hatları türetilmesi için sadece iki fare genotipleri kullanılmış olmasına rağmen, biz bu prosedürlerin hatalı Kras gibi farelerin diğer suşları bulundu spontan T-hücreli lenfomalar geniş bir yelpazede uygulanabilir olduğunu inanıyorum, ve büyük olasılıkla diğer hayvan türleri. Murin T-hücre, immünoloji ve onkoloji temel soruları anlamada potansiyel uygulamalar var. Şu anda, hücre döngüsü tutuklama ve apoptosis mekanizmaları da dahil olmak üzere, konak-patojen etkileşimi ve genotoxin indüklenen sitotoksisite karakterize yönelik çalışmalarda, bu hücre hatları kullanılarak. Fare T-hücre, insan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi ve lenfoma ile ortak PTEN ve FBXW7 silinmesi gibi genomik değişikliklerin payı olduğu göz önüne alındığında, özellikle de kanser ^biyolojisi 8 araştırma için uygundur ve hızlı öncesi için daha fazla uygulamalar olabilir immünolojik ve kanser kemoterapötik ajanların in vitro klinik etkinlik tarama. Bu hücre hatları ya singeneik veya immün sistemi baskılanmış farelerde in vivo olarak dağıtılmasını olsun ya da olmasın tespit edilmemiştir.

T-hücre hattı başarılı bir şekilde kurulması, üç ^{ay 6,} mevcut protokolü kullanılarak geliştirilen hücre hatları kadar aldığı önceki protokollerin aksine bir ay içinde (geçit 2-8 arasında) kuruldu . Biz gevşek bağlı stromal hücreleri üzerinde yapışık hücre agrega varlığı kurulmuş bir hücre hattında kritik bir erken göstergesi olduğunu bulundu. Fare T-hücrelerinin süresiz yaymak için izin vermek için, biz de beslenmeleri sırasında rahatsız ilk gevşek yapışık hücre agrega terk önemli olduğunu bulundu. Buna ek olarak, ilk geçişleri sırasında, yaklaşık ^{3x10 6} / mL 'lik bir konsantrasyon hücre yoğunluğu koruyarak sürekli bir hücre hattı başarılı bir şekilde kurulması da teşvik etmektedir . Bizim tecrübelerimize göre, kültür damarlarının çeşitli türleri kullanarak farklı yoğunlukları kültür hücreleri T-hücre hattı kurulması olasılığını en üst düzeye çıkarıyor. En T-hücre hatları T-75 matara ya da 6-iyi plakaları ve yaklaşık ^{1x10 7} veya ^1x10 6 hücre / mL 'karşılık 10 veya 100 kat dilüsyonları kuruldu. Bir önceki protokol 5 x 10 ^6, 1 x10 ⁷ ve 6-kuyucuğu başına 2 x 10 ⁷ hücre hücreleri kültür tavsiye, ve 7 gün sonra (7) besleme. Biz 5 gün, 48 saat ve geçişi 72 saat sonra ilk kültürlerin beslenme uygun olduğunu gözlemledik. Ilk beslenme ve geçirilmesinden önce uzun bekleme hücreler canlılığını kaybeder ve bölen durdurmak için neden olacaktır.

Bulduğumuz son parametre in vitro T-hücrelerinin fare başarılı yayılımı için kritik hızlı hücre büyümesini desteklemek, kültür ortamında FBS varlığı. Farklı birçok FBS ve tedarikçileri uygun bir reaktif tanımlanması için T-hücre hatları türetme başlamadan önce taranmalıdır. Fare T-hücre hatları tarama için mevcut değilse, 1x10 ⁶ Concanavalin A (1μg / ml) içeren hızlı hücre büyümesini teşvik etmek için test ortamı mL başına bir konsantrasyonda, 24 plaka kuyu yerleştirilir timik lenfositler primer kültürlerinde yeterlidir. FBS optimal bir kaynak varlığı, hücre sayısı her 18 ila 24 saat çift

Materials

Ice bucket 70% ethanol Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins Two sets of small sterile scissors and forceps Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13) Sterile 18 gauge needles 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829) 10% buffered formalin Tissue culture flasks T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025) T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075) 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506) Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS) Culture medium RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following: 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03) 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI) 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI) 55 mM 2β-mercapt–thanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752) Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275) Antibodies (eBioScience, San Diego, CA) anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85) anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83) anti-CD8-PE (cat.#12-081-85) Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017) Concanavalin A (Sigma cat# C5275) 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)