Summary
我々は、長時間にわたって蛍光顕微鏡を介して神経細胞を生体内でミトコンドリアのイメージングを可能にするプロトコルを記述する。長期間にわたるイメージングは、我々の研究室で設計し、構築されたミトコンドリア標的蛍光蛋白質と安価なステージトップインキュベーターの使用のレンチウイルスを介した発現を介して実行されます。
Abstract
ミトコンドリア輸送と神経機能の関係を理解するために、それは1-3拡張された期間のためのライブ培養神経細胞におけるミトコンドリアの挙動を観察することが重要です。これは生きている細胞の細胞骨格成分、細胞小器官、および他の構造を標識することができるとの重要な染料と蛍光タンパク質を使用することで可能になりましたし、動的な蛍光顕微鏡を介して可視化した。例えば、胚性ニワトリ交感神経ニューロンにおいて、ミトコンドリアの動きは生体染色色素のローダミン123 4を用いて特徴付けられた。別の研究で、ミトコンドリアはミトコンドリア標的EYFP 5のトランスフェクションにより、ラットの前脳の神経細胞で可視化した。しかし、一次分以上のニューロン、時間、または数日間の撮影は、多くの問題を提示。何よりもこれらの間にある：1）そのような温度、湿度、および長時間の撮像セッション中に、pHなどの培養条件の維持、画像解析時に信号強度の取得画像の品質と正確な測定の両方を確保するため2）強い、安定した蛍光シグナル;および3）退色最小限に抑え、光毒性を避けるために、画像取得時の露光時間を制限する。
ここでは、観察、可視化、および高時間分解能で、最適な生命維持の条件下で培養海馬神経細胞におけるミトコンドリアの動きの分析を可能にするプロトコルを記述する。我々は、良好な温度調節と雰囲気ガスの流れを提供する手頃なステージトップインキュベーターを建設し、また安定したpHと浸透圧を確保し、メディアの蒸発の程度を制限している。このインキュベータは、一定の湿度レベルを提供する標準組織培養インキュベーター、5〜10％のCO 2 /空気の雰囲気に、入口、出口ホースを経由して、接続されている。この設計は、必ずしも多くの時間あるいは数日にわたって細胞の生存を保証していないはるかに高価な顕微鏡のインキュベーターに代わるコスト効率を提供しています。ミトコンドリア可視化するために、我々は、ミトコンドリアを対象としている赤色蛍光蛋白質をコードするレンチウイルスで細胞を感染させる。これは安定キセノン光源の使用と併せて、私たちは画像取得時の露光時間を制限することを可能にし、すべてが光退色と光毒性排除する、強力かつ持続的な信号を、保証します。ステージトップインキュベーターの上部にある2つの注入ポートは、意図した神経伝達物質や他の試薬の急性投与は、ミトコンドリアの動きを調節することができます。オルガネラを標的と赤色蛍光タンパク質と私たちのステージトップインキュベーター、従来の倒立蛍光顕微鏡、CCDカメラ、およびキセノン光源の組み合わせの和、レンチウイルスを介した表現で私たちがでミトコンドリア輸送のタイムラプス画像を取得することができます従来の重要な染料と既製の生命維持システムを導入する研究の可能性よりも長い期間にわたって生きているニューロン。
Protocol
1。ラボ構築されたステージトップインキュベーターの説明
2）環境大気中の水分含有量を維持する湿度制御、すなわち、、3）培養液中の適切なpHの維持1）周囲温度の制御および調節：拡張された期間のための顕微鏡のステージ上で生細胞を維持するには、次の3つの主要な課題を提供しています。これらの"生命維持"の問題は、培養ニューロン、温度やpHの変化に特に敏感な細胞の長期観測を伴う実験のための非常に重要です。以下、我々が設計し、拡張された期間にわたってニューロンのライブイメージングのために構築されたステージトップインキュベーターシンプルラボ構築について説明します。このインキュベータは10％CO 2 / 90％空気の安定した加熱（37℃）、加湿雰囲気を提供する標準的な組織培養インキュベーター（サーモサイエンティフィック、アッシュビル、ノースカロライナ州）、に、閉回路を経由して、接続されている。
- インキュベーターエンクロージャ：インキュベーターの体（ 図1（I、II）;）黒色デルリンプラスチックの固体部分からコンピュータ化されたC＆C加工機で作製した。それは測定97.74ミリメートル（L）× 73.60ミリメートル（幅）× 28.58ミリメートル（H）、（96.74ミリメートルの内部寸法X 72.60ミリメートルX 27.58ミリメートル）約19370センチメートル3の閉じたボリュームを提供する。二つの穴は、筐体の両端に掘削し、/からの組織培養インキュベーターへの入口と出口ホースに対応するためにスレッド化された真鍮製の突起が付いていた。 70.0ミリメートルX 43.0ミリメートルを測定する長方形の開口部は、ポリカーボネートプラスチックのウィンドウ（; B図1（I、II））の配置を可能にするために、エンクロージャの最上部から粉砕した。インキュベーターのベース（ 図1（I、II、III）、C、左上にある詳細に示すように上面図とプロファイル）3 / 16から粉砕された、"アルミの株価は、159.77ミリメートル（L）× 109.86ミリメートル（Wを測定内部のスレッドを持つ）× 3.175ミリメートル（D）、およびライカ電動3プレートステージ（モデル11-522-068、ライカ社、ライプツィヒ、ドイツ）の挿入凹部に収まるように設計されています。四スチールポストはに添付された。フラッシュマウントフラットヘッドネジでthebaseのコーナーこれらは、（ 図1（II、III）、D）の記事を受け入れるように各コーナーで外掘削されたインキュベーターの筐体、のための固体接続点を提供しています。sorbothaneのガスケットを（マクマスターカー、（株）、エルムハースト、イリノイ州）カットとエンクロージャ/ベースのインターフェイスでシールを提供するために、ベースに取り付けていた。スレッドの記事のベースに筐体を保護するために使用されていることと一致すると4つの真鍮のつまみねじ（ 図は1（II、III）。E;左上の詳細）、D）が薄い凹型リップと35.1ミリメートルの直径の穴は35mm次性（ 図1（III）を収容するインキュベータ基地の中央で切断し、追加の拠点他の培養皿のサイズに対応できるように設計されています。
- 加熱エレメント：2個の10キロオームヒートシンク抵抗（Digi - Keyは（株）、シーフリバーフォールズ、ミネソタ州）は、インキュベーターの筐体の内壁に固定されている。これらは、9V DC、人工生命1000Wテラリウムの温度コントローラ（キャロライナペットサプライ、アーモ、サウスカロライナ州）に接続されている500mAのトランスに配線されています。インキュベーターのエンクロージャのポリカーボネートの窓にガスケットを介して配置された配線のプローブは、内部の周囲温度を検出し、抵抗に流れる電流を決定します。組織培養インキュベーターと一緒に、抵抗器は周囲温度のコントロールの追加手段を提供しています。
- クローズドサーキットの雰囲気システム：10％CO 2 / 90％空気の定数加湿と加熱された雰囲気を提供するには、ステージトップインキュベーターは、入口と出口ホース（ 図1（I）、F、G）を介して、接続されているため、標準、水ジャケット組織培養インキュベーター（ 図1（I）、H）;フォーマ科学的モデル3154、サーモサイエンティフィック（株）、アッシュビル、ノースカロライナ州）。ちょうどステージトップインキュベーターに接続する前に、インレットホース（ 図1（I）、F）は、標準的な水槽のポンプ（; I; Lifegard QuietOneモデル1200、Pentair水泳、エルモンテ、カリフォルニア図1（I））に実行される閉回路を維持するために（モデル1150、ペリカンプロダクツ、（株）、トーランス、CA; J図1（I））密封ABSプラスチックのボックスで囲まれている。このポンプは、組織培養インキュベーターからステージトップインキュベーターへの連続通気を促進する。ポンプからステージトップインキュベーターへの振動の伝達を最小限に抑えるためにマフラーとして機能する、ポンプのステージの後、入口のホースは、1500ミリリットルの三角フラスコ（K図1（I））に動作します。ステージトップインキュベーターからの組織培養につながるインキュベーター（ 図1（I）、H）は、出口のホース（G図1（I））同封のコンピュータのファン（ 図1（I）、L）が装備され、これは、ポンプのように、また連続的な空気の流れを促進することを意図している。
- 35ミリメートルGBM用PFTE膜の蓋：前イメージングのためのステージトップインキュベーターで神経培養を配置するために、35mmのGBMは、特別な私が付いていますガス交換を可能にすると同時に、培養液の蒸発を最小限に抑えるためにmbraneの蓋（右上に表示される詳細図1（II、IV）; M）。に忍び込むリムにわたりますとバイトンガスケットと場所で開催されている、この蓋はデルリンプラスチックのリムとPFTE膜（アメリカンDurafilm株式会社、ホリストンMAテフロン）のプレカットシートで構成されていますデルリンプラスチックのリムの側面に沿って凹型チャネル。
- 注入ポート：2つの穴がステージトップインキュベーターのポリカーボネートのウィンドウ（ 図1（II）、センターの詳細、Bの近くの黄色の矢印）に掘削された。これらはステンレス鋼ハミルトンシリンジは、与えられた実験中に5 - HT、DA、様々な受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト、および他の試薬を管理するための注入ポートを提供するために、終了を装備した。
2。プライマリ海馬培養の準備
すべての作業はどちらBSL2層流フードでまたは層流ベンチで行われます。主海馬ニューロンは、標準的な手順6-7に従って、E18ラットの胚から分離され、一次皮質アストロサイトによって条件付けされた無血清培地で増殖させる。グリア細胞は、公開メソッドを7にしたがって調製されています。ならし培地は低グルコース（1.76 ug / mlと）プロリンを添加したDMEM、、アスパラギン（0.83 ug / mlと）、ビタミンB12（0.34 ug / mlと）、グルコース（20mMの）、脂質が豊富なBSA（0.5 mg / mlの構成されています）とB27 80から10までの2％。彼らは神経細胞の遺伝子の転写を妨げる可能性がない抗生物質を培地に添加されていません。
- 35ミリメートルポリ- D -リジン（PBSに0.05 mg / ml）を持つガラス底培養皿（GBM）、および37℃で2時間立っておく℃の中央のガラスカバーの部分をカバーするポリ- D -リジン溶液を吸引、BSL2層流フード内で20分間乾燥させます。ラミニン（PBSでは0.01 mg / ml）をとGBMのポリ- D -リジンコートしたカバースリップの部分をカバーし、余分なラミニンのソリューションを削除する前に40分の最小値に向けて出発。 20分間置いておきます。
- E18ラットの胎児の脳から海馬を解剖し、神経科学6の現在のプロトコルで説明されているように、それらを解離する。
- GBM 11万個の細胞の密度を可能にするために、成長培地中に解離細胞を希釈する。あなたが準備される次性の数に応じてマスターミックス中の細胞の必要な濃度を計算する。
- 37℃、10％CO 2 / 90％空気の雰囲気の混合物のインキュベーターセットATAの温度で行わシードの次性。
- 3〜5日後、グリア増殖を抑制するために培養する（0.14 ng / ml）のアラビノシドCを追加し、神経細胞の生育条件に応じて。
- 文化はレンチウイルスを感染する前に二週間のために成長することができます。この時間の間に、3日ごとに新鮮な培地に各GBMで培地の体積の3分の1を交換してください。これは浸透圧ショックや細胞死につながる可能性があるので、メディアのこの量を超えないようにしてください。
3。赤色蛍光タンパク質をコードする組換えレンチウイルスの調製
組換えレンチウイルスを生成するための施設へのアクセスを持っていない研究者については、商業エンティティなどのシステムバイオサイエンス（マウンテンビュー、カリフォルニア州）によってカスタム生産はオプションです。
ミトコンドリアを標的と赤色蛍光タンパク質の遺伝子は（MitoTurboRFP。Axxora LLC、サンディエゴ、カリフォルニア州）サイトメガロウイルス主要前初期遺伝子のプロモーター11からエンハンサーの転写制御下で自己不活性化組換えネコ免疫不全ウイルスに挿入されます。組換えレンチウイルスは、一過性293T細胞をトランスフェクトすることにより生産されています。
- PolyJetを（SignaGen使用〜75000個/ cm 2、翌日、組換えウイルスベクター、FIVのgagおよびpol遺伝子、および水疱性口内炎ウイルスG糖蛋白質遺伝子をコードするプラスミドとの同時トランスフェクション細胞の密度でプレートした293T細胞研究所、ゲイサーズバーグ、MD）。 DNA（4.8μgのウイルスベクター、プラスミド4.8μgのgagpol、およびプラスミド2.4μgのVSV G）の12 UGの合計は、293T細胞のすべての10cmの培養皿のために使用されます。
- 24時間後、残存DNAを除去するフェノールレッドを含まないハンクス平衡塩類溶液で培養液および洗浄細胞を吸引除去する。 50μg/ml脂質の豊富なBSAとグルタミンを添加した無血清神経基礎培地10mlのを追加。
- 翌日、0.2ミクロンの低蛋白質の結合フィルタを介して上清を、フィルタを収穫し、Vivaspin 20のポリエーテルスルホン限外ろ過ユニット（ザルトリウス、コンコード、米国）に追加します。順番に70％エタノール、組織培養グレードの水、およびリン酸緩衝生理食塩水で洗浄することによってVivaspinユニットを事前に扱います。 30分間1500xgでウイルスを含む遠心分離によって上清〜50倍を集中する。液体N 2に分注し、ウイルス調製及び保管。
- 濃縮したウイルスのアリコートとラットB104細胞に感染し、72時間後にフローサイトメトリーによる蛍光タンパク質の発現を測定することにより、ウイルスの量を推定する。陽性細胞の割合は、一次ニューロンの特定の数に蛍光タンパク質の発現を得るために必要な濃縮されたウイルスのウイルス、すなわち容積の量の推定値を提供します。
4。培養神経細胞の感染
海馬神経細胞の培養は、単にフローサイトメトリーのデータに基づいて、すべてのニューロンの50％まで感染すると推定ウイルスの量を添加することによりin vitroで 14日間で感染している。いいえポリブレンは使用されません。培養物は、蛍光タンパク質の発現をチェックする前に3日間維持されます。信号が弱すぎる場合は、その文化は、数日後に組織培養インキュベーターと再テストに返されます。
5。クローズドサーキットの生活支援システムの一般的なメンテナンス
- 適切な湿度を維持するために、インキュベーターの水ジャケットが定期的にチェックし、必要に応じて充填されていることを確認してください。水（25ミリメートルの深さ）とアルジサイドの小さなボリュームを含むインキュベーター内部にステンレス鋼やアルミのトレイを配置してください。
- 必要な場合には、集水管から採取した水を空にしてインキュベーターの大気の回路の入口と出口ホースをオフにします。定期的に70％エタノールでホースを洗浄。
6。 GBMとステージトップインキュベータ内の配置に膜の蓋の適用
- ステージトップインキュベーター内部のGBMの配置に先立ち、組織培養フードの膜で覆われた蓋付きプラスチック製のふたを交換してください。これが完了すると、顕微鏡に覆われたGBMを移動することがあります。
- 慎重に座席ステージトップインキュベーターのベースにある埋め込み式の開口部に膜で覆われた蓋付きGBM。 GBMを目白押し避けるために、ベースは顕微鏡のステージ上にすでに配置されていることを確認して、ベースクリップ以来、ステージにいくつかの難しさと、それはベースの位置にある後GBMを配置することをお勧めします。
- インキュベーターのベース上にスチールポストとインキュベーターのエンクロージャの位置を合わせ、ベースに筐体を下げる。良好なシールが筐体とベースの間に達成されるまで、つまみネジを締めます。
7。画像収集
利用可能なイメージングソフトウェアプラットフォームの大半は顕微鏡および関連ハードウェアの広い範囲にわたって同等の機能を持っていることに注意してください。画像取得と解析ソフトウェアは、さまざまなプラットフォームは、MetaMorphやライカアプリケーションスイート、ニコンのNIS - Elementsシリーズ、そしてカールツァイス"AxioVisionのような顕微鏡の特定のmakeのために設計されたプログラム、を含む、利用可能です。このプロトコルでは、我々はSlidebook 5（インテリジェントイメージングイノベーション、デンバー、CO）を用いて行う画像の収集と分析の手順について説明します。しかし、このプロトコルで説明する各操作の構成手順は、容易に他のさまざまなプログラムの使用に適応させることができる。
倒立蛍光顕微鏡、フィルタの構成、CCDカメラ、キセノン光源、およびイメージングソフトウェアの説明：
海馬ニューロンのミトコンドリア輸送の動的イメージングのため、我々はクッククックSensicam EQ CCDカメラ（を搭載11-522-068電動ステージ（ライカマイクロシステムズCMS社、ヴェッツラー、ドイツ）ライカDMI - 6000B倒立型蛍光顕微鏡とモデルを使用してください（株）、デトロイト、ミシガン州）、サターラムダ10月2日フィルターホイールとコントローラ（サター器械公司、ノヴァト、カリフォルニア州）、とサターDG - 4 300Wキセノン光源。セダトクワッドビームスプリッタモデル86100bsはライカDMシリーズのフィルターキューブに装着、クロマテクノロジー; MitoTurboレッド蛍光タンパク質で標識されたミトコンドリアを可視化するために、我々は、DG - 4光の励起と600nmのフィルタのソース（ピーク555nmのフィルタを組み合わせて使用（株）は、排出のために、それぞれ、顕微鏡とフィルターホイールで滝、VT）と617nmのベローズ。
画像収集と分析のために、我々はSlidebook 5デジタル顕微鏡イメージングソフトウェアパッケージを使用してください。これにより、画像取得だけでなく、画像処理および解析モジュールの様々な中に顕微鏡、ステージ、フィルターホイール、カメラ、そして光源の完全自動制御を可能にする包括的なパッケージです。
以下、我々はSlidebook 5を用いて蛍光標識されたニューロンのミトコンドリアの移動の時間経過の画像を取得するための特定、段階を追って説明しています。
- 顕微鏡、フィルタホイールコントローラ、光源、およびCCDカメラをSlidebook 5を開く前にオンになっていることを確認してください。
- ミトコンドリアのライブイメージングについては、63Xの油浸対物レンズに切り替える、十分に顕微鏡のステージの下の目的（とステージへのアクセスを提供するために、客観的タレットを下げるトップ）インキュベーター、そして慎重に客観の表面に直接オイルを適用する。 Slidebookツールバーの"フォーカスウィンドウ"アイコンをクリックして、フォーカスウィンドウを開きます。フォーカスウィンドウで、適切なレベルに明視野輝度を調整する"ランプ"というスライダをスライドさせて、明視野のランプをオンにします。細胞のフィールドにフォーカスを取得し、目的の細胞を見つける。
- "範囲"タブの下に、"CY3"フッ素を選択します。接眼レンズを使用して、蛍光灯照明下で水戸TurbRedタンパク質で標識された細胞内のミトコンドリアのための焦点面を見つける。必要に応じて一度は接眼レンズ、CCDカメラへの切り替えと再獲得焦点でフォーカスを取得しています。
- Slidebookツールバーの"イメージキャプチャ"アイコンをクリックして、画像キャプチャのウィンドウを開きます。代わりに、あなたが"一旦"ボタンを使用することができます。100msの初期の露光時間で始まる、'test'とボタンが"ベスト検索"を使用して、最適な露光時間を見つける。最小持続時間（例えば、200 - 800ms）以内に、その露光時間が画像全体のフィールドにまたがって十分な強度を（画像キャプチャウィンドウの下部にヒストグラムで示されるなど、0から2500）を提供する必要があります覚えている。
- タイムラプス画像取得を開始する前に、画像キャプチャウィンドウ内に依然として"詳細設定"タブをクリックして、[詳細設定]ウィンドウを開きます。 "フォーカス"タブを見つけ、time-lapse/multipointキャプチャ'オプションの間に"Autofous"をチェックし、タイムラプス画像取得のためにオートフォーカスの設定を調整します。一般的に、我々は、オートフォーカスのための以下のパラメータを使用してください：すべての2〜3フレームの焦点を更新し、探索の総範囲63xの倍率の2ええと、イメージングに使用オートフォーカスチャンネル蛍がミトコンドリア、すなわち、Cy3標識として選択。
- "キャプチャ"ウィンドウで、"キャプチャの種類"ボックスの下に、"タイムラプス'オプションをチェックし、"タイムラプス撮影"オプションの下のイメージングセッションの希望する画像の間隔と期間を選択します。ミトコンドリア輸送上の神経修飾物質の影響の我々の研究では、タイムラプスイメージングが360の画像の合計は、画像間の10秒間隔で取得された中で1時間のセッションで行われた。
- "キャプチャ"ウィンドウで、下部、右側に"Start"ボタンをクリックして、タイムラプス画像取得を開始します。
- 初期、または制御、画像処理セッションの後、ステージトップインキュベーターの上部ポートを経由して神経伝達物質と他の試薬を管理し、新しいイメージングセッションを開始します。
8。画像解析
- 最後のイメージングセッション後に保存した画像ファイルを開きます。
- 個々のミトコンドリアはSlidebook 5に設けマスキング機能を採用することにより、自動または手動でタイムラプス画像のシリーズで標識することができます。
- "マスク"メニューの下に、メニューバーから"セグメント"を選択します。 、"ヒストグラム"ツールの低および高閾値ラインをスライドさせ、画像全体に青色ですべての粒子をマスクして、プロセスに含まれるすべてのミトコンドリアをカバーするが、できる限りの離散粒子を残すことによる。画像全体のシリーズにマスクを適用します。
- 粒子は、以前のマスクが強調されているに興味のあるプロセスを除いて画像全体をカバーする第二のマスクを（"マスク"メニューの下に、"作成"を選択）を作成します。これは有界領域で埋めるために"ペイントのバケツ"ツールを使用して、その後、プロセスの外側の領域の境界をトレース、およびに厚い"鉛筆"ツールを使用して、まず、達成される。画像全体のシリーズにこのマスクを適用します。
- "マスク、"選択"マスク操作"と"マイナス"操作を実行する、すなわち下で、第二のマスクは、拳のマスク（プロセスを除いて全体のイメージ）から減算されます。第3のマスクは、関心のあるプロセスのみがハイライトされて生成されます。この新しいマスクは、画像全体の系列に適用されることに注意してください。
- 下の"注釈、'select'のオブジェクトID。"
- 継続性と個々の数値の割り当ては手動で画像のシリーズの見直しによるミトコンドリアのマスクを確認します（Slidebook 5、"遊び、"'は前方のフレームで、"と"逆方向のフレームを、画像ウィンドウの下"ボタンは、この目的のために使用することができます）。
- メニューバーの"マスク"タブを選択します。それぞれのマスクされたミトコンドリアの重心の座標を含む生成するために下の"マスク、'select'の粒子トラッキング"と実行"基本粒子追跡'パスの統計を、"。
- 二つの隣接画像フレーム間の各ミトコンドリアで移動する距離は、各フレーム内の各粒子の座標から計算されます。
- 一方向に動く"静止"、"振動、'と''：ミトコンドリア運動に対する神経修飾物質の作用の私たちの以前の研究では、我々は、ミトコンドリアの3つの異なる個体群を同定した。ミトコンドリアが0.2未満UM（または2ピクセル、63X倍率で、1ピクセル= 0.10235ええと）を移動する場合、一時間以内に、それは次のように特徴づけられる"静止。"ミトコンドリアは、少なくとも0.2ミクロンを移動しますが、2未満の場合。5μmのは、順行性、逆行サイクルで、それは次のように定義されている"振動。"ミトコンドリアは、一方向に2.5以上のUMの正味距離を移動する場合、最終的にはそれが一方向に移動するとして分類されます。 図2に示すように代表的な実験だけでなく、ミトコンドリアの3つの異なる個体群の割合の分布を示す円グラフにミトコンドリアというラベルの付いたすべての動きを示すヒストグラムである。
- 各ミトコンドリアの平均速度は、ギブンイメージングのセッション中に走行合計距離に応じて計算されます。ミトコンドリアの人口の平均速度は、個々の速度を追加し、ミトコンドリア追跡の総数で割ることによって計算されます。
- KymographsはSlidebook 5で提供されてモジュールを使用して生成することができます。 "マスク"機能を使用して、特定のプロセス（例えば、軸索）の全範囲にわたって細い線を引く、できるだけ多くのミトコンドリアの重心として通過してください。 "、高度な操作"メニューバーを選択で"マスク"タブに移動し、"滑らかな曲線の分析。"滑らかな曲線の解析のためのデフォルト設定を使用するか、または必要に応じてカスタマイズします。滑らかな曲線の解析モジュールを実行します。分析の終了時に、イメージングセッションのカイモグラフが表示されます。
- "、[表示]メニューバーを選択して移動し、次に[エクスポートTIFF。"
- Photoshopでキモグラフまたは同等の画像処理プログラムを含む保存された。tifファイルを開き、グレースケール反転する画像を変換する。
9。代表的な結果
培養海馬神経細胞でミトコンドリアの動きを追跡し、分析することにより、我々は神経調節とミトコンドリアの人身売買との間のリンクを示している。具体的には、そのセロトニン（5 - HT）または5 - HT1A受容体アゴニスト、8 - OH - DPATを発見したドーパミン（DA）またはD2受容体アゴニスト、ブロモクリプチンは、阻害のに対し、ミトコンドリアの動き（ 図2A - C）8 を 、刺激するミトコンドリアの動き（ 図2D - G）9。
図1。閉回路のステージトップインキュベーターシステムの設計インキュベーターシステムの次のコンポーネントが示されています：耐熱デルリンプラスチックの筐体（）;ポリカーボネートプラスチック製のウィンドウの長方形の開口部（B）、インキュベーター（C）のアルミのベース、穴。ベース（D）のスチールポストを受け入れるまで、インキュベーター基地の中央に薄い凹型リップと35.1ミリメートルの直径の穴35ミリメートルGBMの料理（E）に対応するため、nalgeneホース（組織培養とステージトップインキュベーター間の接続は、水分のトラップ）（ F、G、N）、組織培養インキュベーター（H）、水槽のポンプ（I）、気密ABSプラスチックのボックス（水槽ポンプ用ハウジング）（J）、2000ミリリットルの三角フラスコ（ステージ上の前にホースの振動抑制のためのマフラーインキュベーター）（K）、冷却ファン（L）用のプラスチック製筐体、35ミリメートルGBMのふた用プラスチックフレーム（M）、プラスチック製三方活栓の位置（O）。試薬の投与のためのポートの位置は、（II）で黄色の矢印で示されます。
図2。代表的な結果：ミトコンドリア輸送の規制A.。文化の典型的なラット海馬ニューロンの軸索。レンチウイルスでエンコードされた蛍光タンパク質で標識されたミトコンドリアは緑色で表示されます。リン酸化ニューロフィラメント抗体で免疫標識軸索は赤で表示されます。軸索の範囲は、黄色の矢印で示されます。画像は4つのオーバーラップした顕微鏡写真で構成されています。 5 - HTの投与後にミトコンドリアの動きの変化を示すタイムラプス画像のシリーズのB.例。画像は、倒立型蛍光顕微鏡を介して取得し、後でQuicktimeムービーに変換されたシーケンスとして格納されていました。画像の代表的なシーケンスは、異なる時点の前（左パネル）と8 - OH - DPAT、5 - HT1A受容体アゴニストの後（右パネル）管理におけるミトコンドリア個々を示しています。縦の赤い四角形は静止してミトコンドリア（左）と複数の時点にわたって振動ミトコンドリアを（右）が強調表示されます。振動のミトコンドリアは、（左パネル）を示した8 - OH - DPAT（右のパネルに、赤の縁取りの白い矢印）で処理した後に軸索の端末に向かっています。縦の黄色い線（右パネル）は、移動ミトコンドリアの開始位置を示します。時間間隔は、各フレームの右下隅に表示されます。倍率（63 ×）は、右側のパネルの右下隅に表示されています。 C、5 - HTの投与後にミトコンドリアの動きの変化を示すD.プロット。 5 - HTの（C）と後（D）投与前のミトコンドリアの動きの変化は、速度（X軸）対軸索に沿って個々のミトコンドリアの初期位置（Y軸）のプロットとして表示されます。速度と静止の割合（赤）、振動（青）、および方向性移動（グリーン）Mitochondriaは、それぞれ、プロットや円グラフ（プロット上の挿入図）で表現されます。漫画の軸索の強調表示された地域から各プロットのY軸に投影、赤い点線は、イメージを作成した軸索のセグメントのおおよその位置と範囲を示している。 E、DAの投与後にミトコンドリアの動きの変化を示すF.プロット。前のミトコンドリアの動きの変化（E）と（F）DAの投与は軸索（Y軸）に沿って速度のプロット（X軸）対個々のミトコンドリアの初期位置として表示される後。速度と静止の割合（赤）、振動（青）、および方向性移動（緑）ミトコンドリアはそれぞれ、プロットや円グラフ（プロット上の挿入図）で表現されます。漫画の軸索の強調表示された地域から各プロットのY軸に投影、赤い点線は、イメージを作成した軸索のセグメントのおおよその位置と範囲を示している。 G、前培養神経細胞でミトコンドリアの動きを示すH.代表kymographs（G）と後（H）D1R受容体アゴニスト、ブロモクリプチンの投与。ニューロンは、1時間前（G）とブロモクリプチンの一時間以下（H）管理のために画像化した。
Discussion
レンチウイルスを介した感染培養神経細胞のミトコンドリアをターゲットと蛍光タンパク質の発現と延長期間のための生細胞のイメージングを可能にする安価なラボ構築ステージトップインキュベーターを採用し、我々は、ミトコンドリアの動きと神経調節の信号間のリンクを調査することができた、セロトニン（5 - HT）、ドーパミン（DA）、及びアセチルコリン（ACH）など。神経機能の心臓部である - 私たちの研究は、その、初めて、リンクなどの5 - HTとDAのような神経伝達物質によって変調されたニューロンの活動の変化にミトコンドリアの人身売買シグナル伝達経路を解明するために役立っています。我々は、標的蛍光タンパク質の使用は、より多くの生理学的に関連する重要な染料を使用して可能なはるかに短い期間よりも可能性が長期間にわたって培養神経細胞を生体内でミトコンドリアというラベルの観察を可能にすることがわかります。さらに、蛍光タンパク質のシグナルの強度は、光退色や光毒性の可能性を最小限に抑え、私たちは画像取得時の露光時間を短くすることができます。最後に、シンプルで安価なステージトップインキュベーターメディアの蒸発を最小限に抑えながら、周囲温度、湿度、およびCO 2のレベルを維持し、私たちはさらに数時間または数日にわたってニューロンを生体内でミトコンドリアの動きをたどることができます。ライブニューロンのミトコンドリアの長期的な観測のためにステージトップインキュベーターを作製する研究者が使用する材料の特性（例えば、ガス透過性膜媒体の蒸発を避けるために提供されて、私たちのデザインの正確な詳細に従う必要はありません）と（例えば、温度、湿度コントロール、浸透圧のpHは、メンテナンスのバッファリング）適用される原則は、一般的にこのプロトコールに記載されているものと一致している。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、ステージ上インキュベーターの設計と製造の間に彼の技術的な専門知識と優れた技術を貢献するためにドナルドハットソンに感謝します。私たちは、彼女の優秀な技術支援のためにもAyda Dashtaeiに感謝しています。すべての作業は、神経科学研究財団によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1) Tissue culture incubator (H) | |||
| (1) Heat-resistant plastic enclosure (A) | (delrin or comparable) | ||
| (1) Plastic frame for 35mm GBM lid (M) | (for affixing membrane to petri dish) | ||
| (1-2) linear ft. Clear PFTE (Teflon) | membrane material | ||
| (4) Brass thumb screws | |||
| (2) Small 10kOhm heatsink resistors | used as heating elements inside stage-top incubator enclosure | ||
| (1) Transformer | supply of 9V current to resistors | ||
| (1) Terrarium temperature controller and probe | thermostatic regulation of power to heatsink resistors via transformer | ||
| (1) 2000ml Erlenmeyer flask (K) | muffler for vibration suppression in hose before stage-top incubator | ||
| (1) 1/8" sorbothane sheet | gasket material for base of stage-top incubator | ||
| (1) Airtight ABS (or comparable) plastic box (J) | housing for aquarium pump | ||
| (1) Aquarium pump (I) | |||
| (1) Small computer cooling fan | |||
| (1) Plastic enclosure for cooling fan (L) | |||
| (1) 9V transformer for computer cooling fan | |||
| (20-30ft) Nalgene or silicone hose (F,G,N) | connections between tissue culture and stage-top incubators; moisture traps | ||
| (2) Plastic stopcocks (O) | to open and close air flow before and after stage-top incubator | ||
| (4) Barbed brass hose connectors | for hose connections to/from stage-top incubator and aquarium pump enclosure | ||
| (2) Brass quick couplers | for hose connections to/from stage-top incubator | ||
| (2) Brass quick couplers | for hose connections to/from stage-top incubator | ||
| Table 1. Stage-top incubator parts: | |||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| laminin | Roche Group | 11243217001 | |
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek Corp. | P35GC-0-14-C | |
| DMEM | Life Technologies | 10567 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| Lipid-rich BSA | Life Technologies | 11020-021 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | A8381-100G | |
| Vitamin B-12 | Sigma-Aldrich | V2876-100MG | |
| 5-HT | Sigma-Aldrich | H9523-25MG | |
| 8-OH-DPAT | Sigma-Aldrich | H8520-25MG | |
| Dopamine | Sigma-Aldrich | H8502-5G | |
| Bromocriptine | Sigma-Aldrich | B2134-25MG | |
| SKF38393 | Sigma-Aldrich | D047-100MG | |
References
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- Miller, K. E., Sheetz, M. P. Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria. J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).
- Macaskill, A. F. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Crawley, J. N. Current protocols in neuroscience. , J. Wiley. (1999).
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- Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons. Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).
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- Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. , e10848-e10848 (2010).
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