Neuromodulatie en Mitochondriale Transport: Live Imaging in hippocampale neuronen dan lange duur

Summary

Beschrijven we een protocol dat beeldvorming van mitochondriën kan in levende neuronen via fluorescentie microscopie over lange duur. Imaging gedurende langere perioden wordt bereikt door lentivirus-gemedieerde expressie van een mitochondrially gerichte fluorescerend eiwit en het gebruik van een goedkope stage-top incubator, dat is ontworpen en gebouwd in ons laboratorium.

Abstract

Om te begrijpen van de relatie tussen mitochondriale vervoer en de neuronale functie, is het essentieel om mitochondriale gedrag in levende gekweekte zenuwcellen voor een langere duur van ^1-3 te nemen. Dit is nu mogelijk door het gebruik van vitale kleurstoffen en fluorescerende eiwitten waarmee cytoskelet componenten, organellen, en andere structuren in levende cellen kunnen worden gelabeld en vervolgens gevisualiseerd via dynamische fluorescentie microscopie. Bijvoorbeeld, in embryonale kip sympathische neuronen, was mitochondriale beweging gekarakteriseerd met behulp van de vitale kleurstof rhodamine 123 ^4. In een andere studie, mitochondriën werden gevisualiseerd in de rat voorhersenen neuronen door transfectie van mitochondrially gerichte EYFP ^5. Echter, beeldvorming van de primaire neuronen gedurende minuten, uren of zelfs dagen presenteert een aantal punten. De belangrijkste hiervan zijn: 1) het onderhoud van de kweekomstandigheden zoals temperatuur, vochtigheid en pH tijdens lange sessies beeldvorming, 2) een sterke, stabiele fluorescerende signaal naar zowel de kwaliteit van verworven beelden en nauwkeurige meting van de intensiteit van het signaal tijdens de beeldanalyse te verzekeren; en 3) het beperken van de blootstelling keer tijdens beeldacquisitie aan fotobleken te minimaliseren en te vermijden fototoxiciteit.

We beschrijven hier een protocol dat de waarneming, visualisatie en analyse van mitochondriale beweging in gekweekte hippocampale neuronen met een hoge temporele resolutie en onder optimale condities leven toelaat. We hebben geconstrueerd een betaalbare stap-top incubator dat een goede temperatuurregeling en atmosferische gasstroom verleent, en beperkt ook de mate van media verdamping, verzekeren een stabiele pH en osmolariteit. Deze incubator is aangesloten, via de inlaat en uitlaat slangen, met een standaard weefselkweek incubator, die een constante vochtigheidsgraad en een sfeer van 5-10% CO ₂ / lucht levert. Dit ontwerp biedt een kosteneffectief alternatief voor de veel duurdere microscoop incubators die niet noodzakelijk de levensvatbaarheid van de cellen te verzekeren gedurende vele uren of zelfs dagen. Om dit te visualiseren mitochondriën, we cellen infecteren met een lentivirus dat codeert voor een rood fluorescerend eiwit dat is gericht op het mitochondrion. Dit zorgt voor een sterke en aanhoudende signalen, die in samenhang met het gebruik van een stabiele xenon lichtbron, laat ons toe om belichtingstijden beperken tijdens beeldacquisitie en alles, maar sluit fotobleken en fototoxiciteit. Twee injectie-poorten aan de bovenkant van het podium-top incubator kan de acute toediening van neurotransmitters en andere reagentia bedoeld om moduleren mitochondriale beweging. Kortom, lentivirus-gemedieerde expressie van een organel-gerichte rood fluorescerend eiwit en de combinatie van onze stage-top incubator, een conventionele omgekeerde fluorescentie microscoop, CCD-camera, en xenon lichtbron ons toelaten om time-lapse beelden van de mitochondriale vervoer te verwerven in levende neuronen over een langere duur dan die mogelijk is in studies inzetten van conventionele vitale kleurstoffen en off-the-shelf life support systemen.

Protocol

1. Beschrijving van Lab-built Stage-top incubator

Behoud van levende cellen op een microscoop podium voor langere duur biedt drie grote uitdagingen: 1) omgevingstemperatuur en regelgeving; 2) vochtregeling, dat wil zeggen, het onderhouden van het vochtgehalte van milieu-sfeer, en 3) handhaving van de juiste pH in het kweekmedium. Deze 'life support' kwesties zijn cruciaal voor experimenten met de lange termijn observatie van gekweekte zenuwcellen, cellen die bijzonder gevoelig zijn voor veranderingen in temperatuur en pH. Hieronder beschrijven we een eenvoudig lab-bouwfase-top incubator die we ontworpen en gebouwd voor live beeldvorming van neuronen gedurende langere looptijden. Deze incubator is aangesloten, via een gesloten circuit, een standaard weefselkweek incubator (Thermo Scientific, Asheville, NC), die een stabiele verwarmd (37 ° C), vochtige atmosfeer van 10% CO ₂ / 90% lucht geeft.

1. Incubator behuizing: Het lichaam van de incubator (figuur 1 (I, II); A) werd gefabriceerd op een geautomatiseerde C & C freesmachine uit een massief stuk zwart delrin kunststof. Het meet 97.74mm (L) x 73.60mm (W) x 28.58mm (H), (inwendige afmetingen van 96.74mm x 72.60mm x 27.58mm) het verschaffen van een gesloten volume van ongeveer 19.370 cm ^3. Twee gaten werden geboord aan weerszijden van de behuizing en voorzien van schroefdraad messing weerhaken om in-en uitlaat slangen van / naar de weefselkweek incubator tegemoet te komen. Een rechthoekige opening meet 70.0mm x 43.0mm werd gemalen uit aan de bovenkant van de behuizing om de plaatsing van een polycarbonaat plastic venster (Figuur 1 (I, II), b) mogelijk te maken. De basis van de incubator (figuur 1 (I, II, III), C, bovenaanzicht en het profiel in detail weergegeven linksboven), gefreesd uit 3 / 16 "aluminium voorraad, maatregelen 159.77mm (L) x 109.86mm (W ) x 3.175mm (D), en is ontworpen om te passen in de insert uitsparing van een Leica gemotoriseerde drie-plaat fase (Model 11-522-068, Leica Gmbh, Leipzig, Duitsland). Vier stalen palen met interne discussies werden aan . hoeken van deonderkant door de inbouw platte kop schroeven Deze zorgen voor stevige bevestigingspunten voor de incubator behuizing, welke is geboord op elke hoek aan de palen (figuur 1 (II, III), D) te accepteren. sorbothane Een pakking (McMaster Carr, Inc, Elmhurst, IL) was gesneden en gemonteerd op de basis om een afdichting te leveren tegen de behuizing / base-interface. Vier messing schroeven met schroefdraad die overeenkomt met die van de posten worden gebruikt om de behuizing vast aan de basis (Figuur 1 (II, III). D) een 35.1mm diameter gat met een dunne verzonken lip werd gesneden in het midden van de incubator basis om 35mm GBMS (figuur 1 (III) tegemoet te komen; E; detail bovenaan links); extra bases zijn ontworpen om andere cultuur schotel maten tegemoet te komen.
2. Verwarmingselementen: Twee 10 Kohm koellichaam weerstanden (Digi-Key Corp, Thief River Falls, MN) zijn aangebracht op de binnenwanden van de incubator behuizing. Deze zijn aangesloten op een 9V DC, 500mA transformator die is aangesloten op een Alife 1000W terrarium temperatuurregelaar (Carolina Pet Supply, Irmo, SC). Een bekabelde sonde geplaatst door middel van een pakking in het polycarbonaat venster van de incubator behuizing detecteert inwendige temperatuur en bepaalt de huidige stroom naar de weerstanden. In combinatie met de weefselkweek incubator, de weerstanden zorgen voor een extra maatregel van de omgevingstemperatuur te controleren.
3. Gesloten circuit sfeer systeem: Om een constante bevochtigde en verwarmde atmosfeer van 10% CO ₂ / 90% lucht te bieden, is de fase-top incubator verbonden, via inlaat en uitlaat slangen (zie figuur 1 (I), F, G), een standaard, watermantel weefselkweek incubator (figuur 1 (I); H); Forma Scientific Model 3154, Thermo Scientific, Inc, Asheville, NC). Net voordat u op het podium-top incubator, de toevoerslang (figuur 1 (I); F) loopt in een standaard aquarium pomp (figuur 1 (I); I; Lifegard QuietOne Model 1200, Pentair Aquatics, El Monte, CA) dat is in een gesloten ABS plastic doos (figuur 1 (I), J, Model 1150, Pelican Products, Inc, Torrance, CA) om een gesloten circuit te houden. Deze pomp bevordert de continue luchtstroom van de weefselkweek incubator op het podium-top incubator. Nadat de pomp fase, de inlaat slang loopt naar een 1500 ml erlenmeyer (figuur 1 (I); K), dat fungeert als een uitlaat om de overdracht van trillingen te minimaliseren van de pomp naar het podium-top incubator. Een uitlaat slang (figuur 1 (I); G) die leidt van het podium-top incubator van de weefselkweek incubator (figuur 1 (I); H) is uitgerust met een complete ventilator van de computer (figuur 1 (I); L), die, net als de pomp, is ook bedoeld om continue luchtstroom te bevorderen.
4. PTFE membraan deksel voor 35mm GBM: Voorafgaand aan het plaatsen van de neuronale cultuur in de fase-top incubator voor beeldvorming, de 35mm GBM is uitgerust met een speciale mijmbrane deksel (Figuur 1 (II, IV), M, detail getoond bovenaan rechts) om de gasuitwisseling toe te staan ​​en tegelijkertijd een minimum te beperken verdamping van kweekmedium. Dit deksel bestaat uit een Delrin kunststof velg en een pre-cut vel PTFE membraan (Teflon; Amerikaanse Durafilm Co, Inc, Holliston MA) dat is gespannen over de rand en zijn plaats gehouden met een viton afdichting die glijdt in een verzonken kanaal langs de zijkant van de Delrin kunststof rand.
5. Injectie-poorten: Twee gaten waren geboord in het polycarbonaat venster (Figuur 1 (II), in het midden detail, gele pijlen de buurt van B), van het podium-top incubator. Deze werden voorzien van RVS Hamilton spuit uiteinden aan de injectie-poorten bieden voor het beheer van 5-HT, DA, diverse receptor agonisten en antagonisten, en andere reagentia gedurende een bepaalde experiment.

2. Voorbereiding van de primaire hippocampus Culturen

Al het werk wordt uitgevoerd in een van beide een BSL2 laminaire stroming kap of in een laminaire stroming bank. Primaire hippocampale neuronen worden geïsoleerd van E18 rat embryo's volgens standaard procedures ^6-7, en worden gekweekt in serum-vrij medium, dat is geconditioneerd door de primaire corticale astrocyten. Gliacellen worden bereid volgens de gepubliceerde methoden ^7. Het geconditioneerde medium bestaat uit een lage glucose DMEM, aangevuld met proline (1,76 ug / ml), asparagine (0,83 ug / ml), vitamine B12 (0,34 ug / ml), glucose (20mm), lipide-rijke BSA (0,5 mg / ml ) en 2% van de B27 ^8-10. Geen antibiotica worden toegevoegd aan het medium omdat ze kunnen interfereren met neuronale gentranscriptie.

1. Dek de centrale glazen dekglaasje gedeelte van een 35mm glazen bodem cultuur schotel (GBM) met poly-D-lysine (0,05 mg / ml in PBS), en laat gedurende twee uur bij 37 ° C. Aspireren van de poly-D-lysine oplossing, laten drogen gedurende 20 minuten in een BSL2 laminaire stroming kap. Dek de poly-D-lysine-gecoate dekglaasje gedeelte van de GBM met laminine (0,01 mg / ml in PBS), en laat voor een minimum van 40 minuten voor het verwijderen van de overtollige laminine oplossing. Gereserveerd voor 20 minuten.
2. Ontleden hippocampus van de hersenen van E18 rat embryo's, en los ze, zoals beschreven in Current Protocols in Neuroscience ^6.
3. Verdunnen gescheiden cellen in groeimedium om tot een dichtheid van 110.000 cellen per GBM. Bereken de nodige concentratie van de cellen in je master mix op basis van het aantal GBMS u voorbereiden.
4. Plaats gezaaid GBMS in een incubator set ata temperatuur van 37 ° C en een sfeer mengsel van 10% CO ₂ / 90% lucht.
5. Drie tot vijf dagen later, afhankelijk van de groeiomstandigheden van de neuronen, voeg arabinoside C (0,14 ng / ml) om de culturen om gliale proliferatie te onderdrukken.
6. Laat de culturen om gedurende twee weken te groeien voor infecteren met de lentivirus. Gedurende deze tijd, vervangt een derde van het volume van de medium in elk GBM met vers medium om de drie dagen. Neem niet meer dan dit bedrag van de media, omdat dit kan leiden tot osmotische shock en celdood.

3. De voorbereiding van Recombinant lentivirus Encoding Red Fluorescent Protein

Voor onderzoekers die geen toegang hebben tot faciliteiten voor de productie van recombinant lentivirussen, custom de productie van een commerciële entiteit bijv. Systeem Biosciences (Mountain View, CA) is een optie.

Een mitochondrially-gerichte rood fluorescerend eiwit gen (MitoTurboRFP, Axxora LLC, San Diego, CA) is ingebracht in een zelf-inactiverende recombinant feline immunodeficiëntie virus onder de transcriptionele controle van de versterker van het cytomegalovirus grote directe vroege gen promoter ^11. Recombinant lentivirussen worden geproduceerd door kortstondig transfecteren 293T-cellen.

1. Plaat 293T-cellen bij een dichtheid van ~ 75.000 cellen / cm ^2, de volgende dag, co-transfecteren van de cellen met plasmiden die coderen voor de recombinante virale vector, FIV gag-en pol-genen, en het vesiculaire stomatitis virus G-glycoproteïne-gen, met behulp van PolyJet (SignaGen Laboratories, Gaithersburg, MD). Een totaal van 12 ug van DNA (4,8 microgram virale vector, 4,8 ug gagpol plasmide, en 2,4 ug VSV G plasmide) wordt gebruikt voor elke cultuur 10cm schotel van 293T-cellen.
2. Na 24 uur, zuigen het kweekmedium en was cellen met fenol rood-vrij Hanks gebalanceerde zoutoplossing om de resterende DNA te verwijderen. Voeg 10 ml van het serum-vrij neurale basaal medium aangevuld met 50μg/ml lipide-rijke BSA en Glutamax.
3. De volgende dag, de oogst van het bovenstaande, filter door een 0,2 micron laag eiwit binding filter en toe te voegen aan een Vivaspin 20 polyethersulfon ultrafiltratie-eenheid (Sartorius, Concord, USA). Pre-behandeling van de Vivaspin apparaat door achtereenvolgens wassen met 70% ethanol, weefselkweek kwaliteit water, en fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Concentreer het virus-bevattende supernatant ~ 50-voudig door centrifugeren bij 1500xg gedurende 30 minuten. Aliquot het virus voorbereiding en op te slaan in vloeibare N ₂.
4. Schat de hoeveelheid virus door het infecteren van rat B104 cellen met een hoeveelheid van geconcentreerde virus, en het meten van fluorescerend proteïne-expressie door middel van flowcytometrie 72 uur later. Het percentage positieve cellen geeft een schatting van de hoeveelheid virus dat wil zeggen het volume van de geconcentreerde virus die nodig is om fluorescerend eiwit expressie te verkrijgen in een bepaald aantal primaire neuronen.

4. Infectie van gekweekte zenuwcellen

Hippocampal neuron culturen zijn besmet na 14 dagen in vitro door simpelweg toevoegen van de hoeveelheid virus geraamd op maximaal infecteren tot 50% van alle neuronen op basis van flowcytometrie gegevens. Geen polybreen wordt gebruikt. Culturen worden gehandhaafd voor 3 dagen voor het controleren op fluorescerende eiwit expressie. Als het signaal te zwak is, dan is de cultuur wordt teruggegeven aan de weefselkweek incubator en opnieuw getest na enkele dagen.

5. Algemeen onderhoud van het Closed Circuit Life Support System

1. Voor een goede luchtvochtigheid, zorg ervoor dat de incubator van de watermantel periodiek wordt gecontroleerd en gevuld indien nodig. Zorg ervoor dat u een roestvrij staal of aluminium schaal plaats in de incubator met een kleine hoeveelheid water (25mm diep) en algicide.
2. Indien nodig, schakelt u het in-en uitlaat slangen van de incubator atmosfeer circuit door het legen verzamelde water uit het stroomgebied buizen. Periodiek door te spoelen van de leidingen met 70% ethanol.

6. Het toepassen van membraandeksel naar GBM en Plaatsing in fase-top incubator

1. Voorafgaand aan de plaatsing van de GBM in de fase-top incubator, vervang dan de plastic deksel met het membraan bedekte deksel in een weefselkweek kap. Zodra dit is gebeurd, kunt u de overdekte GBM-naar de microscoop.
2. Voorzichtig de stoel van de GBM met het membraan bedekte deksel in de uitsparing opening aan de onderkant van de fase-top incubator. Om te voorkomen dat gedrang van de GBM, zorg ervoor dat de basis al is op zijn plaats op de microscoop fase, sinds het referentiejaar clips in het podium met enige moeite, is het het beste om de GBM-plaats na de basis is op zijn plaats.
3. Lijn de incubator behuizing met de stalen berichten op de couveuse en lagere van de behuizing op de basis. Draai de duimschroeven totdat er een goede afdichting wordt bereikt tussen de behuizing en voet.

7. Image Acquisition

Merk op dat het merendeel van de beschikbare imaging software platforms vergelijkbare functionaliteit hebben over een breed scala van microscopen en aanverwante hardware. Een verscheidenheid van het beeld acquisitie en analyse software platforms zijn beschikbaar, waaronder Metamorph en programma's voor specifieke merken microscoop, zoals de Leica Application Suite, Nikon's NIS-Elements, en Carl Zeiss 'AxioVision. In dit protocol beschrijven we het beeld verwerving en analyse procedures die we uitgevoerd met behulp van Slidebook 5 (Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO). Echter, de samenstellende stappen van elke operatie beschreven in dit protocol gemakkelijk worden aangepast aan het gebruik van een verscheidenheid van andere programma's.

Beschrijving van de omgekeerde fluorescentie microscoop, filter configuraties, CCD-camera, xenon lichtbron, en imaging software:

Voor dynamische beeldvorming van mitochondriale vervoer in hippocampale neuronen, gebruiken we een Leica DMI-6000B omgekeerde fluorescentie microscoop en Model 11-522-068 gemotoriseerde fase (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Duitsland), uitgerust met een Cooke Sensicam EQ CCD camera (The Cooke corporatie, Romulus, MI), een Sutter Lambda 10-2 filter wiel en controller (Sutter Instrument Company, Novato, CA), en een Sutter DG-4 300W xenon lichtbron. Te visualiseren mitochondria gelabeld met de MitoTurbo rode fluorescente eiwit, gebruiken we de combinatie van een 555nm filter bij de DG-4 lichtbron voor excitatie en filters van 600 nm (piek; Sedat Quad beamsplitter Model 86100bs gemonteerd op Leica DM-serie filter kubus, Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT) en 617nm op de microscoop en filter wiel, respectievelijk voor de emissie.

Voor het imago van acquisitie en analyse, gebruiken we de digitale microscopie imaging software pakket Slidebook 5. Dit is een uitgebreid pakket dat volledig automatisch besturen van de microscoop, toneel, filter wiel, camera en de lichtbron tijdens het beeld acquisitie, evenals een verscheidenheid van beeldverwerking en analyse-modules mogelijk maakt.

Hieronder geven we concrete, stap-voor-stap instructies voor het verwerven van time-lapse beelden van bewegende mitochondria in fluorescent gelabelde neuronen met behulp van Slidebook 5.

1. Zorg ervoor dat de microscoop, filterwiel controller, lichtbron, en de CCD-camera is ingeschakeld voor de opening Slidebook 5.
2. Voor live beeldvorming van mitochondriën, overschakelen naar een 63x olie-immersie objectief, voldoende lager het doel torentje toegang te verlenen tot de doelstelling onder de microscoop stadium (en fase-Top incubator), en zorgvuldig direct toe te passen olie aan het oppervlak van de doelstelling. Open de focus venster door te klikken op de 'Focus Window' icoon op de Slidebook werkbalk. In de focus venster, zet de helderveld lamp te schuiven een slider met het label 'lamp' om helderveld intensiteit aan te passen om een ​​geschikt niveau. Verwerf richten zich op een veld van cellen en vind een cel van belang.
3. Onder de 'Scope' tab, selecteer de 'CY3' fluor. Met behulp van de oculairs, bij tl-verlichting vinden het vlak van de focus voor mitochondria in de cellen die zijn gelabeld met de Mito TurbRed eiwit. Als je eenmaal hebt verkregen focus door de oculairs, overschakelen naar de CCD-camera en opnieuw te verwerven richten indien nodig.
4. Open de afbeelding vast te leggen venster door te klikken op de 'Image Capture' icoon op de Slidebook werkbalk. Te beginnen met een eerste belichtingstijd van 100ms, vind de optimale belichtingstijd met behulp van de 'Test' en 'Find Best' knoppen, als alternatief, kunt u de 'Once' knop te gebruiken. Vergeet niet dat de blootstelling tijd moet voldoende intensiteit verspreid over het hele beeldveld te bieden (bijvoorbeeld 0-2500, aangeduid met histogram aan de onderkant van het beeld vast te leggen venster) binnen een minimale duur (bv. 200-800ms).
5. Voordat u begint met time-lapse beeldacquisitie, opent u de 'Advanced' venster door te klikken op de tab 'Geavanceerd' nog steeds in het beeld vast te leggen venster. Zoek het 'Focus' tab, check de 'Autofous' tijdens optie time-lapse/multipoint vangt ', en pas de autofocus instellingen voor time-lapse beeldacquisitie. Over het algemeen gebruiken we de volgende parameters voor autofocus: update richten om de 2-3 frames te selecteren als de autofocus kanaal de fluor wordt gebruikt voor de beeldvorming gelabeld mitochondriën, dat wil zeggen, CY3; totaal zoekbereik 2 um voor 63x vergroting.
6. In de 'Capture' venster, in vak 'Capture Type', check de 'Time-lapse' optie en selecteer de gewenste beeldvorming interval en de duur van de imaging-sessie onder opties 'Timelapse Capture'. In onze studies naar de effecten van de neuromodulatoren op de mitochondriale vervoer is time-lapse imaging uitgevoerd in een uur durende sessies, waarin een totaal van 360 beelden werden verkregen op 10 seconden tussen de beelden.
7. Start time-lapse beeldacquisitie door te klikken op de knop 'Start' aan de onderkant, rechts, van het 'Capture' venster.
8. Na de eerste, of controle, imaging sessie, beheren neurotransmitters en andere reagentia via de top-poorten van de stage-top incubator en start een nieuwe imaging sessie.

8. Beeldanalyse

1. Open het image-bestand opgeslagen na de laatste opnamesessie.
2. Individuele mitochondria bestempeld kan worden in een time-lapse image serie automatisch of handmatig door gebruik te maken van de maskering functies die in Slidebook 5.
3. Onder de 'Mask' menu en selecteer 'Segment' in de menubalk. Door schuiven de lage en hoge drempel lijn van de 'histogram' tool, maskeren alle deeltjes in het blauw in het hele beeld, die alle de mitochondria in het proces, maar het verlaten van deeltjes zo discreet mogelijk te maken. Breng het masker om de hele foto serie.
4. Maak een tweede masker (onder de 'Mask' menu, selecteer 'Create') die het gehele beeld dekt, behalve voor het proces van belang waarin de deeltjes is gewezen door de vorige masker. Dit is bereikt in de eerste, door gebruik te maken van de dikste 'potlood' tool om de grenzen van de gebieden buiten het proces te sporen, en vervolgens, met behulp van de 'paint bucket' tool in te vullen begrensd regio's. Pas dit masker om de gehele afbeelding serie.
5. Onder 'Mask', selecteer 'Mask Operations' en uit te voeren 'Minus' operatie, dat wil zeggen, is de tweede masker afgetrokken van de vuist masker (het hele beeld, behalve het proces). Een derde masker wordt gegenereerd, waarin alleen het proces van belang is gemarkeerd. Merk op dat dit nieuwe masker wordt toegepast op de hele afbeelding serie.
6. Onder 'Annotaties', selecteer 'Object-id's. "
7. Controleer of de continuïteit en de numerieke opdrachten van de individuele mitochondria gemaskeerd door handmatig de herziening van de afbeelding serie (in Slidebook 5, de 'play', 'forward frame' en 'reverse frame, kunnen' knop onder de afbeelding venster worden gebruikt voor dit doel).
8. Selecteer de 'Mask' tab in de menubalk. Onder 'Mask', selecteer 'Particle Tracking' en run 'Basic Particle Tracking' naar 'Path Statistics, "met inbegrip coördinaten van het zwaartepunt voor elke gemaskerde mitochondrion te genereren.
9. Afstand afgelegd door elk mitochondrion tussen twee aangrenzende beeldkaders wordt berekend uit de coördinaten van elk deeltje in elk frame.
10. In onze vorige studies naar het effect van neuromodulatoren op de mitochondriale beweging, identificeerden we drie verschillende populaties van mitochondria:. 'Stationair', 'oscillerende' en 'directioneel bewegend' Als een mitochondrion reist minder dan 0,2 um (of 2 pixels, onder 63x vergroting; 1 pixel = 0,10235 um) binnen een uur, wordt het gekarakteriseerd als 'stationair'. Als een mitochondrion beweegt ten minste 0,2 um, maar minder dan 2.5 um, in een anterograde-retrograde cyclus, wordt het gedefinieerd als 'oscillerend.' Ten slotte, als een mitochondrion reist een netto-afstand van meer dan 2,5 um in een richting, wordt het gecategoriseerd als bewegende richtingen. Weergegeven in Figuur 2 is een histogram dat de beweging van alle gelabeld mitochondriën in een representatief experiment, evenals een cirkeldiagram toont procentuele verdeling van de drie verschillende populaties van mitochondria.
11. Gemiddelde snelheid van elk mitochondrion wordt berekend op basis van het totaal afgelegde afstand tijdens een bepaalde beeldvorming sessie. De gemiddelde snelheid van een mitochondriaal bevolking wordt berekend door optelling van de individuele snelheden en te delen door het totaal aantal mitochondria gevolgd.
12. Kymographs kan worden gegenereerd met behulp van een module die in Slidebook 5. Met behulp van de 'Mask' functie, trek je een dunne lijn over de hele omvang van een bepaald proces (bv axon), moet u passeren zo veel mitochondriën hartlijnen mogelijk te maken. Ga naar de 'Mask' tab in de menubalk en selecteer 'Advanced Operations' en vervolgens 'Smooth Curve Analysis.' Met de standaardinstelling voor vloeiende curve analyse of aan te passen naar wens. Voer de vloeiende curve analyse module. Aan het einde van de analyse, zal een kymograaf van de beeldvormende bijeenkomst worden weergegeven.
13. Ga naar de menubalk en selecteer 'View' en vervolgens 'Export TIFF.'
14. Open het opgeslagen. Tif-bestand met de kymograaf in Photoshop of een vergelijkbaar beeldverwerking-programma en de afbeelding naar grijswaarden omgekeerd.

9. Representatieve resultaten

Door het bijhouden en analyseren van mitochondriale beweging in gekweekte hippocampale neuronen, hebben we aangetoond een link tussen neuromodulatie en mitochondriale mensenhandel. Specifiek, vonden we dat serotonine (5-HT) of de 5-HT1A receptor agonist, 8-OH-DPAT, stimuleert mitochondriale beweging (Figuur 2A-C) ^acht, terwijl dopamine (DA) of de D2 receptor agonist, bromocriptine, remt mitochondriale beweging (figuur 2D-G) ^9.

Figuur 1. Ontwerp van een gesloten circuit stage-top incubator systeem De volgende onderdelen van de couveuse-systeem worden weergegeven: Hittebestendige Delrin kunststof behuizing (A); rechthoekige opening voor polycarbonaat plastic venster (B); aluminium onderstel van de incubator (C); gaten. te accepteren stalen masten base (D), 35.1mm diameter gat met dunne lippen verzonken in het centrum van incubator basis om 35mm GBM gerechten (E) tegemoet te komen; Nalgene slangen (verbindingen tussen weefselkweek en podium-top incubatoren; vocht vallen) ( F, G, N); weefselkweek incubator (H); aquarium pomp (I); luchtdichte ABS plastic doos (behuizing voor aquarium pomp) (J); 2000ml erlenmeyer (demper voor trillingen in de slang voor de stage-top incubator) (K), plastic behuizing voor ventilator (L), plastic frame voor 35mm GBM deksel (M) en in de positie van kunststof kranen (O). Locaties van de havens voor het beheer van reagentia zijn aangegeven met gele pijlen in (II).

Figuur 2. Representatieve resultaten: regulering van mitochondriale transport A.. Axon van een typisch rat hippocampal neuron in de cultuur. Mitochondriën gelabeld met een lentivirus-gecodeerde fluorescent eiwit worden weergegeven in het groen; axons immunolabeled met fosfo-neurofilament antilichaam worden weergegeven in het rood. Omvang van de axon wordt aangegeven door gele pijlen. Beeld is opgebouwd uit vier overlappende microfoto. B. Voorbeeld van een time-lapse image serie laten zien veranderingen in het mitochondriaal beweging na toediening van 5-HT. Beelden werden verkregen via een omgekeerde fluorescentie microscoop en opgeslagen als sequenties die later werden omgezet naar QuickTime-films. Een vertegenwoordiger opeenvolging van beelden geeft de afzonderlijke mitochondriën op verschillende tijdstippen voor (linker paneel) en na (rechts paneel) toediening van 8-OH-DPAT, een 5-HT1A receptor agonist. Verticale rode rechthoek wijst op een stilstaande mitochondrion (links) en een oscillerende mitochondrion (rechts) over meerdere tijdstippen. De oscillerende mitochondrion aangegeven (linker paneel) zich beweegt in de richting van de axon terminal na de behandeling met 8-OH-DPAT (rechterkant van het scherm, rood-wit omzoomd pijlpunten). De verticale gele lijn (rechter paneel) geeft de uitgangspositie van de bewegende mitochondrion. Tijdsintervallen worden weergegeven in de rechter bovenhoek van elk frame. Vergroting (63 x) is aangegeven op de rechter benedenhoek van rechter paneel. C, D. Plots zien veranderingen in het mitochondriaal beweging na toediening van 5-HT. Veranderingen in het mitochondriaal beweging voor (C) en na (D) toediening van 5-HT worden gepresenteerd als plots van de snelheid (X-as) versus de eerste positie van de individuele mitochondria langs de axon (Y-as). Snelheid en het aandeel van stationaire (rood), oscillerend (blauw), en directioneel bewegend (groen) mitochondria zijn vertegenwoordigd in de plots en cirkeldiagrammen (inzetstukken boven percelen), respectievelijk. Rode gestippelde lijnen projecteren voor de gemarkeerde gebieden van de cartoon axon om de Y-as van elk perceel aangegeven locatie bij benadering en de omvang van het axon segment dat werd in beeld gebracht. E, F. Plots zien veranderingen in het mitochondriaal beweging na toediening van DA. Veranderingen in het mitochondriaal beweging voor (E) en na (F) administratie van DA worden gepresenteerd als plots van de snelheid (X-as) versus de beginletters van de afzonderlijke mitochondriën langs de axon (Y-as). Snelheid en het aandeel van stationaire (rood), oscillerend (blauw), en directioneel bewegend (groen) mitochondriën zijn vertegenwoordigd in de plots en cirkeldiagrammen (inzetstukken boven percelen), respectievelijk. Rode gestippelde lijnen projecteren voor de gemarkeerde gebieden van de cartoon axon om de Y-as van elk perceel aangegeven locatie bij benadering en de omvang van het axon segment dat werd in beeld gebracht. G, H. vertegenwoordiger kymographs zien mitochondriale beweging in een beschaafde neuron voor (G) en na (H) administratie van de D1R receptor agonist, bromocriptine. Het neuron werd in beeld gebracht voor een uur voor (G) en een uur na (H) de toediening van bromocriptine.

Discussion

Gebruikmakend van lentivirus-gemedieerde expressie van een fluorescerend eiwit gericht op mitochondria in geïnfecteerde gekweekte neuronen en een goedkope lab-bouwfase-top incubator die beeldvorming van levende cellen voor langere duur maakt, zijn we in staat geweest om de link tussen beweging en mitochondriale neuromodulatory signalen te onderzoeken , zoals serotonine (5-HT), dopamine (DA) en acetylcholine (ACh). Onze studies hebben bijgedragen tot een signaalroute dat voor de eerste keer, mitochondriale mensenhandel links naar veranderingen in de activiteit van neuronen-gemoduleerd door neurotransmitters zoals 5-HT en DA verduidelijken - die zich in het hart van de neurale functie. We vinden dat het gebruik van gerichte fluorescente eiwitten de observatie van gelabelde mitochondria in levende gekweekte neuronen gedurende langere perioden die mogelijk meer fysiologisch relevante dan de veel kortere duur, die mogelijk met behulp van vitale kleurstoffen vergunningen. Bovendien is de intensiteit van het fluorescerende eiwit signaal stelt ons in staat om de blootstelling keer kort te houden tijdens het beeld acquisitie, het minimaliseren van de mogelijkheid van fotobleken of fototoxiciteit. Ten slotte is een eenvoudige en goedkope stage-top incubator die omgevingstemperatuur, vochtigheid en CO ₂ niveau handhaaft, terwijl het minimaliseren van de verdamping van de media, laat ons toe om mitochondriale beweging volgen in levende neuronen in uren of zelfs dagen. Onderzoekers die wensen om een ​​stage-top incubator fabriceren voor de lange-termijn observaties van mitochondriën in levende neuronen hoeft niet aan de precieze details van ons ontwerp, op voorwaarde dat de eigenschappen van de gebruikte materialen (bijvoorbeeld gas permeabel membraan om verdamping van de media te voorkomen ) en principes toegepast (bijvoorbeeld, temperatuur en luchtvochtigheid, buffering van de pH, onderhoud van de osmolariteit) zijn over het algemeen consistent met wat is beschreven in dit protocol.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1) Tissue culture incubator (H)
(1) Heat-resistant plastic enclosure (A)			(delrin or comparable)
(1) Plastic frame for 35mm GBM lid (M)			(for affixing membrane to petri dish)
(1-2) linear ft. Clear PFTE (Teflon)			membrane material
(4) Brass thumb screws
(2) Small 10kOhm heatsink resistors			used as heating elements inside stage-top incubator enclosure
(1) Transformer			supply of 9V current to resistors
(1) Terrarium temperature controller and probe			thermostatic regulation of power to heatsink resistors via transformer
(1) 2000ml Erlenmeyer flask (K)			muffler for vibration suppression in hose before stage-top incubator
(1) 1/8" sorbothane sheet			gasket material for base of stage-top incubator
(1) Airtight ABS (or comparable) plastic box (J)			housing for aquarium pump
(1) Aquarium pump (I)
(1) Small computer cooling fan
(1) Plastic enclosure for cooling fan (L)
(1) 9V transformer for computer cooling fan
(20-30ft) Nalgene or silicone hose (F,G,N)			connections between tissue culture and stage-top incubators; moisture traps
(2) Plastic stopcocks (O)			to open and close air flow before and after stage-top incubator
(4) Barbed brass hose connectors			for hose connections to/from stage-top incubator and aquarium pump enclosure
(2) Brass quick couplers			for hose connections to/from stage-top incubator
(2) Brass quick couplers			for hose connections to/from stage-top incubator
Table 1. Stage-top incubator parts:
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
laminin	Roche Group	11243217001
35 mm glass-bottom dishes	MatTek Corp.	P35GC-0-14-C
DMEM	Life Technologies	10567
B27	Life Technologies	17504-044
Glutamax	Life Technologies	35050
Lipid-rich BSA	Life Technologies	11020-021
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Proline	Sigma-Aldrich	A8381-100G
Vitamin B-12	Sigma-Aldrich	V2876-100MG
5-HT	Sigma-Aldrich	H9523-25MG
8-OH-DPAT	Sigma-Aldrich	H8520-25MG
Dopamine	Sigma-Aldrich	H8502-5G
Bromocriptine	Sigma-Aldrich	B2134-25MG
SKF38393	Sigma-Aldrich	D047-100MG