Summary
Мы опишем протокол, который позволяет визуализации митохондрий в живых нейронов с помощью флуоресцентной микроскопии в течение длительного времени. Изображения в течение длительного периода осуществляется через лентивирус-опосредованной экспрессии mitochondrially целевых флуоресцентного белка и использование недорогих стадии топ-инкубатор, который был спроектирован и построен в нашей лаборатории.
Protocol
1. Описание лабораторного построенной сцене верхом инкубатор
Сохранение живых клеток на столике микроскопа в течение длительного длительности предлагает три основные задачи: 1) контроль окружающей температуры и регулирования; 2) контроль влажности, то есть, поддерживая влажность экологической атмосферой и 3) обеспечение надлежащей рН в культуральной среде. Эти вопросы «жизнеобеспечения» являются критическими для экспериментов с участием долгосрочного наблюдения культурного нейроны, клетки, которые особенно чувствительны к изменениям температуры и рН. Ниже мы опишем простой лабораторного построенной сцене верхом инкубаторе, что мы спроектирован и построен для живого изображения нейронов в течение длительного длительности. Этот инкубатор связано, по замкнутому контуру, к стандартному культуре ткани инкубатор (Thermo Scientific, Asheville, Северная Каролина), которая обеспечивает стабильную подогревом (37 ° С), влажной атмосфере 10% СО 2 / 90% воздуха.
- Инкубатор корпуса: корпус из инкубатора (рис. 1 (I, II);) был изготовлен на компьютеризированных фрезерный станок C & C из цельного куска черного пластика Delrin. Он измеряет 97.74mm (Д) х 73.60mm (Ш) х 28.58mm (H), (внутренние размеры 96.74mm х 72.60mm х 27.58mm) предоставления замкнутом объеме около 19 370 см 3. Два отверстия были пробурены с обоих концов корпус и оборудована резьбовыми барбусов латуни для размещения входного и выходного шлангов из / в культуре ткани инкубатора. Прямоугольное отверстие измерения 70.0mm х 43.0mm мололи из в верхней части корпуса, чтобы размещение окна поликарбонатного пластика (рис. 1 (I, II), B). Базе инкубатора (рис. 1 (I, II, III); С; вид сверху и профиль подробно показано в верхнем левом углу), фрезерованные от 3 / 16 "алюминиевые акции, меры 159.77mm (Д) х 109.86mm (W ) х 3.175mm (D), и предназначен, чтобы вписаться в вставить перерыва Leica моторизованных 3-пластины этапе (Модель 11-522-068, Leica GmbH, в Лейпциге, Германия). Четыре стали сообщения с внутренней резьбой были прикреплены к . углах thebase по заподлицо винта с потайной головкой Они обеспечивают твердые точки крепления для корпуса инкубатора, которая была пробурена на каждой углу, чтобы принимать сообщения (рис. 1 (II, III), D). sorbothane прокладкой (McMaster Carr, Inc, Элмхерст, Иллинойс) был сокращен и установлен на базу, чтобы обеспечить уплотнение на корпус / базового интерфейса. Четыре латунные винты с резьбой соответствия, что из сообщения используются для крепления корпуса к основанию (рис. 1 (II, III);. D) 35.1mm диаметр отверстия с тонкими встраиваемые губа была сокращена в центре базы инкубатор для размещения 35 GBMs (рис. 1 (III); E; подробно в левом верхнем углу); дополнительные основания были предназначены для размещения других размеров блюдо культуры.
- Нагревательные элементы: два 10 кОм радиатор резисторы (Digi-Key Corp, Thief River Falls, MN) прикреплены к внутренним стенкам корпуса инкубатора. Они подключены к 9В постоянного тока, 500 мА трансформатор, который подключен к террариум Alife 1000 Вт регулятор температуры (Каролина Pet Поставка, Irmo, Южная Каролина). Проводной датчик, размещаемых путем прокладки в окно из поликарбоната корпус инкубатора определяет внутреннюю температуру окружающей среды и определяет ток на резисторы. В сочетании с тканевой культуры инкубатор, резисторы обеспечивают дополнительную меру окружающего контроля температуры.
- Закрытая система атмосферу схеме: обеспечить постоянное увлажнение и нагревают атмосферу 10% CO 2 / 90% воздуха, стадии топ-инкубатор связано, через входной и выходной шланги (рис. 1 (I), F, G), к стандарт, с водяной рубашкой культуре ткани инкубаторе (рис. 1 (I); H); Forma Научно Модель 3154; Thermo Scientific, Inc, Asheville, NC). Перед подключением к стадии топ-инкубатор, шланг (рис. 1 (I), F) наталкивается на стандартный насос аквариума (рис. 1 (I); I; Lifegard QuietOne Модель 1200, Pentair водных видов спорта, Эль-Монте, Калифорния) , который был заключен в герметичный пластиковый ABS окне (рис. 1 (I), J; Модель 1150, Pelican Products, Inc, Торранс, Калифорния), чтобы сохранить замкнутой цепи. Этот насос способствует постоянному поток воздуха из тканевой культуры инкубатор на сцену верхом инкубатора. После мощности насоса, шланга бежит к 1500ml колбу (рис. 1 (I), К), который действует как глушитель, чтобы минимизировать передачу вибрации от насоса до стадии топ-инкубатора. Розетке шланг (рис. 1 (I), G), ведущей от стадии топ-инкубатора в культуре ткани инкубаторе (рис. 1 (I); H) оснащен вентилятором закрытых компьютер (рис. 1 (I), L), , которая, как насос, предназначен также для содействия непрерывному воздушного потока.
- PFTE мембраны крышкой для 35-мм GBM: Перед размещением нейронов культуры в стадии топ-инкубатор для работы с изображениями, GBM 35 мм оснащен специальным меняmbrane крышкой (рис. 1 (II, IV); M; подробно показано в верхнем правом углу), чтобы разрешить газовый обмен и в то же время минимизировать испарения питательной среды. Это крышка состоит из обода Delrin пластика и нарезанные лист PFTE мембраны (тефлон, американский Durafilm завод, ОАО, Холлистон MA), которая была натянутой на обод и удерживается на месте с прокладкой витон, что проскальзывает в встраиваемые канал вдоль стороне обода пластиковых Delrin.
- Инъекция порты: два отверстия были пробурены в окно поликарбоната (рис. 1 (II), центр подробно, желтые стрелки рядом Б) стадия-топ-инкубатора. Они были оснащены нержавеющей стали Гамильтон шприц концов, что позволяет обеспечить введение порты для введения 5-HT, Д. А., различных агонистов и антагонистов рецепторов, а другими реагентами во время данного эксперимента.
2. Подготовка первичных культур гиппокампа
Все работы выполняются в любом BSL2 ламинарном боксе или в лавке ламинарного потока. Первичная нейронов гиппокампа изолированы от E18 крысиных эмбрионов в соответствии со стандартными процедурами 6-7, и выращивают в бессывороточной среде, что было обусловлено первичной коры астроцитов. Глиальные клетки получают в соответствии с опубликованной методы 7. Кондиционированной среды состоит из низких глюкозы DMEM, дополненной пролин (1,76 мкг / мл), аспарагин (0,83 мкг / мл), витамин В12 (0,34 мкг / мл), глюкозы (20 мм), богатых липидами BSA (0,5 мг / мл ) и 2% B27 8-10. Нет антибиотики добавляли в среду, поскольку они могут помешать нейронов транскрипции гена.
- Обложка центральной части покровного стекла 35 мм со стеклянным дном культуры блюдо (GBM) с поли-D-лизина (0,05 мг / мл в PBS), и оставить стоять в течение двух часов при температуре 37 ° C. Аспирируйте поли-D-лизин решение, дать высохнуть в течение 20 минут в течение ламинарном BSL2. Обложка поли-D-лизин покрытием покровное часть GBM с ламинин (0,01 мг / мл в PBS), и оставить на минимум 40 минут перед удалением избытка раствора ламинин. Отложите на 20 минут.
- Рассеките гиппокампе из мозга E18 крысиных эмбрионов, и отделить их, как описано в Текущий протоколов в неврологии 6.
- Развести диссоциированных клеток в питательную среду, чтобы обеспечить плотность 110 000 клеток на GBM. Расчет необходимой концентрации клеток в вашем мастер смеси в зависимости от числа GBMs вы будете готовить.
- Место посеяны GBMs в инкубаторе набор ата температуре 37 ° С и атмосфере смеси 10% CO 2 / 90% воздуха.
- От трех до пяти дней, в зависимости от условий выращивания нейронов, добавьте арабинозид C (0,14 нг / мл) для культур, чтобы подавить глиальных распространения.
- Разрешить культур расти в течение двух недель до заражения с лентивирусов. За это время заменить одну треть объем среды в каждой GBM свежей средой каждые три дня. Не превышать эту сумму из средств массовой информации, как это может привести к осмотическому шоку и гибели клеток.
3. Подготовка рекомбинантной лентивирус Кодирование красный флуоресцентный белок
Для исследователей, которые не имеют доступа к средствам для создания рекомбинантных лентивирусов, пользовательские производства коммерческой организацией, например, система биологических наук (Маунтин-Вью, Калифорния) является вариантом.
Mitochondrially ориентированных ген красного флуоресцентного белка (MitoTurboRFP; Axxora LLC, San Diego, CA) вставляется в само-инактивации рекомбинантной кошачьего вируса иммунодефицита под транскрипционным контролем усилитель от цитомегаловируса основных немедленного раннего промотора гена 11. Рекомбинантный лентивирусов производятся временно трансфекции 293T клеток.
- Пластина 293T клетки с плотностью ~ 75 000 клеток / см 2, на следующий день, со-трансфекции клеток с плазмидами кодирования рекомбинантный вирусный вектор, FIV кляп и пол гены, и вирус везикулярного стоматита G гена гликопротеина, используя PolyJet (SignaGen Лаборатории, Gaithersburg, MD). В общей сложности 12 мкг ДНК (4,8 мкг вирусного вектора, 4,8 мкг gagpol плазмиды и 2,4 мкг плазмиды VSV G) используется для каждого блюда 10см культуры 293T клеток.
- После 24 часов, аспирация питательной среды и промыть клетки с фенолом красным без Хэнкс сбалансированный солевой раствор для удаления остатков ДНК. Добавить 10 мл бессывороточной нейронных базальной среде, дополненной 50μg/ml богатых липидами BSA и Glutamax.
- На следующий день, урожай супернатант, процеживают через 0,2 мкм низкой связывания с белками фильтр и добавить в Vivaspin 20 полиэфирсульфона ультрафильтрации единица (Sartorius, Конкорд, США). Предварительная обработка Vivaspin единицы последовательным промыванием 70% этанола, культуры тканей класса водой, и фосфатно-солевом буфере. Концентрат вируссодержащих супернатант ~ 50-кратного центрифугированием при 1500xg течение 30 минут. Алиготе подготовки вирусов и хранить в жидком N 2.
- Оценка количества вируса и заразить крыс B104 клеток аликвоту концентрированного вируса и измерения флуоресцентных экспрессии белка с помощью проточной цитометрии 72 часов спустя. Процент положительных клеток позволяет оценить количество вируса, т.е. объем концентрированного вируса, необходимые для получения флуоресцентных экспрессии белка в заданное число первичных нейронов.
4. Заражение культивированный Нейроны
Гиппокампа культурах нейронов инфицированных на 14 дней в пробирке путем простого добавления количества вируса оценивается заразить до 50% всех нейронов на основе данных проточной цитометрии. Нет polybrene используется. Культур сохраняются в течение 3 дней перед проверкой для люминесцентных экспрессии белка. Если сигнал слишком слаб, то культура вернулся в культуре ткани инкубатор и повторное обследование через несколько дней.
5. Общее техническое обслуживание замкнутой системы жизнеобеспечения цепи
- Для обеспечения надлежащей влажности, убедитесь, что водяной рубашкой инкубатора периодически проверяется и заполнены в случае необходимости. Убедитесь, что место нержавеющей стали или алюминия лоток внутри инкубатора содержащие небольшое количество воды (25 мм в глубину) и альгицида.
- При необходимости очистить входной и выходной шланги схемы атмосферу инкубатора путем опорожнения собранной воды из водосборных трубок. Периодически флеш шланги с 70% этанола.
6. Применение мембранного Крышка для GBM и размещения в верхней Стадии-инкубатор
- До размещения GBM внутри стадии топ-инкубатор, заменить пластиковой крышкой с покрытые оболочкой крышку капота культуры ткани. Как только это сделано, вы можете переместить покрыты GBM к микроскопу.
- Тщательно сиденье с GBM покрытые оболочкой крышку встраиваемые открытие на базе стадии топ-инкубатора. Чтобы избежать толкотни GBM, убедитесь, что база уже существует на столике микроскопа, так как база клипов в сцене с трудом, лучше всего разместить GBM после база находится в положении.
- Выравнивание корпуса инкубатора стали сообщения на базе инкубатора и нижнего корпуса на базу. Затяните винты, пока хорошее уплотнение достигается между корпусом и базой.
7. Image Acquisition
Обратите внимание, что большинство доступных платформ ПО для обработки изображений имеют сравнимую функциональность в широком диапазоне микроскопы и соответствующее аппаратное обеспечение. Разнообразие захвата изображений и платформ программного обеспечения для анализа доступны, в том числе Метаморф и программ, предназначенных для конкретных делает микроскопа, такие как Leica приложений, компании Nikon NIS-Elements, а AxioVision Carl Zeiss. В этом протоколе описываются захвата изображений и анализ процедур мы осуществляется с помощью Slidebook 5 (Интеллектуальный изображений Инновации, Denver, CO). Тем не менее, учредительные шаги каждой операции, описанные в этом протокол можно легко адаптировать к использованию ряда других программ.
Описание перевернутой флуоресцентного микроскопа, фильтр конфигураций, ПЗС-камера, ксенон источник света, а также для обработки изображений:
Для динамических изображений митохондриальной транспорта в нейронах гиппокампа, мы используем Leica DMI-6000B перевернутой флуоресцентного микроскопа и модель 11-522-068 моторизованных этапе (Leica Microsystems GmbH CMS, Wetzlar, Германия), снабженные Кук Sensicam EQ CCD камера (Cooke Корпорация, Ромул, MI), Саттер Lambda 10-2 фильтр колесо и контроллер (Саттер Instrument Company, Новато, Калифорния), и Саттер DG-4 300W ксенон источник света. Для визуализации митохондрий помечены MitoTurbo красный флуоресцентный белок, мы используем сочетание 555nm фильтр на DG-4 источника света для возбуждения и фильтры 600 нм (пик; Седат Quad Светоделитель Модель 86100bs установлен на Leica DM серии фильтров куб, Chroma технологии Corp, Сильфон-Фолс, VT) и 617nm в микроскоп и фильтр колеса, соответственно, выбросов.
Для приобретения и анализа изображений, мы используем цифровой микроскопии изображений программный пакет Slidebook 5. Это всеобъемлющий пакет, который позволяет полностью автоматизированного управления микроскопом, сцена, фильтр колеса, камеры и источника света во время захвата изображений, а также различные обработки и анализа изображений модулей.
Ниже мы приведем конкретный, шаг за шагом инструкции для приобретения промежуток времени изображения движущихся митохондрий в флуоресцентно меченных нейронов использованием Slidebook 5.
- Убедитесь, что микроскоп, фильтр контроллер колесо, источник света, и ПЗС-камеры были включены, прежде чем открывать Slidebook 5.
- Для живого изображения митохондрий, переключиться на 63x нефтью погружения цели, нижняя цель башни настолько, чтобы обеспечить доступ к объективной ниже столик микроскопа (и этапИнкубатор-топ), и осторожно применять масло непосредственно на поверхности цели. Открытая фокус окно, нажав значок «Фокус окна" на панели инструментов Slidebook. В центре окна, включить лампу светлое, сдвинув слайдер с меткой 'лампа', чтобы настроить интенсивность светлого к подходящему уровню. Приобретать сосредоточиться на поле клеток и найти ячейку интерес.
- В разделе "Сфера" выберите пункт "Cy3 'фтора. Использование окуляров, под флуоресцентным освещением найти плоскости фокуса для митохондрий в клетках, которые были помечены белка Mito TurbRed. После того как вы приобрели фокус через окуляры, переключиться на ПЗС-камерой и вновь приобрести фокус, если это необходимо.
- Откройте окно захвата изображения, нажав на иконку "Image Capture" на панели инструментов Slidebook. Начиная с начальной время экспозиции составляет 100 мс, найти оптимальное время экспозиции с помощью «Тест» и «Найти лучших" кнопок; качестве альтернативы, вы можете использовать 'После' кнопку. Помните, что время экспозиции должно обеспечить достаточную интенсивность распространения по всему полю изображения (например, 0-2500; указывает гистограмма в нижней части окна, захват изображения) в минимальный срок (например, 200-800 мс).
- Перед началом покадровой получения изображений, открыть "Дополнительно" окна, нажав на вкладку "Дополнительно" все еще в пределах окна захвата изображения. Найти "Фокус" на вкладке, проверить 'Autofous во время вариант time-lapse/multipoint захватывает ", а также настроить параметры автофокусом покадровой получения изображений. Как правило, мы используем следующие параметры для автофокусировки: обновление фокус каждые 2-3 кадра, выбрать, как автофокус канал плавикового использоваться для работы с изображениями помечены митохондрии, то есть Cy3; общий диапазон поиска 2 мкм для 63x увеличением.
- В 'Capture' окно, в графе "Тип Capture», флажок «Timelapse" и выберите необходимый интервал изображения и продолжительность визуализации сессии в рамках опции «Timelapse Захват». В наших исследованиях эффекты нейромодуляторов на митохондриальной транспорта, покадровой визуализации был выполнен в течение одного часа сессии, в которых в общей сложности 360 изображений были приобретены в 10 секундным интервалом между изображениями.
- Начало покадровой получения изображения, нажав кнопку "Пуск" в нижней части, с правой стороны, из 'Capture' окно.
- После первоначального, или контроля, работы с изображениями сессии, администрирования нейротрансмиттеров и других реагентов через верхнюю порты стадии топ-инкубатор и начать новую сессию изображений.
8. Анализ изображений
- Откройте изображение, файл, сохраненный после последней сессии изображений.
- Индивидуальные митохондрии могут быть помечены в замедленной серии изображений автоматически или вручную, используя маскирующие функции, предусмотренные в Slidebook 5.
- Под «Маска» меню, выберите "Сегмент" из меню. По скользящей низкого и высокого порога линии 'гистограмма' инструмент, маскируя все частицы в синий всего изображения, охватывающие все митохондрий, содержащиеся в этом процессе, но оставив в виде отдельных частиц, как это возможно. Нанесите маску на всю серию изображений.
- Создать вторую маску (под «Маска» меню, выберите "Создать"), который охватывает все изображение за исключением процесса интерес, в котором частицы была подчеркнута предыдущие маски. Это достигается, во-первых, с помощью инструмента "карандаш" толстые проследить границы районы за пределами этого процесса, а затем, используя инструмент "Заливка", чтобы заполнить в ограниченной области. Применять эту маску для всей серии изображений.
- В разделе "Маска", выберите «Маска операции и выполнять" минус "операции, то есть, вторая маска вычитается из кулака маски (все изображение, кроме процесса). Третья маска будет сгенерирована, в которой только процесс интерес выделяется. Заметим, что эта новая маска будет применяться к целой серии изображений.
- В разделе "Аннотации", выберите "идентификаторы объектов.
- Проверка непрерывности и численного задания индивидуальных масках митохондрий, вручную обзор серии изображений (в Slidebook 5, "играть", "вперед кадр" и "обратный кадр", кнопок, расположенных ниже окна изображения могут быть использованы для этой цели).
- Выберите «Маска» на вкладке меню. В разделе "Маска", выберите "частиц Tracking 'и запустить« Основные частиц Tracking' для создания 'Путь Статистика », включая координаты центра тяжести для каждого масках митохондрии.
- Расстояние, проходимое каждой митохондрии между двумя соседними кадрами изображения рассчитывается исходя из координат каждой частицы в каждом кадре.
- В наших предыдущих исследованиях влияния нейромодуляторов на митохондриальной движение, мы определили три разные популяции митохондрий:. 'Стационарные "," колебательная "и" направленно движущиеся' Если митохондрии путешествует менее 0,2 мкм (или 2 пикселя, под 63x увеличением, 1 пиксель = 0,10235 мкм) в течение одного часа, она характеризуется как «стационарных». Если митохондрии движется не менее 0,2 мкм, но меньше, чем 2.5 мкм, в антероградной-ретроградный цикл, то оно определяется как «колебательный». Наконец, если митохондрии путешествует чистая расстояние более 2,5 мкм в одном направлении, это классифицируется как движение направленно. Изображенный на рисунке 2, гистограмма показывает движение всех меченых митохондрий в эксперименте представителя, а также круговые диаграммы, показывающей процентное распределение трех различных популяций митохондрий.
- Средняя скорость каждого митохондрии рассчитывается в соответствии с общее расстояние, пройденное в течение данного изображения сессии. Средняя скорость митохондриальных населения рассчитывается путем сложения отдельных скоростях и деления на общее число митохондрий отслеживаться.
- Kymographs можно сгенерировать с помощью модуля представлены в Slidebook 5. Использование «Маска» функции, нарисуйте тонкую линию по всем протяжении данного процесса (например, аксон), не забудьте пройти через столько митохондриальной центроиды насколько это возможно. К «Маска» на вкладке меню и выберите пункт "Дополнительные операции", а затем 'Smooth Анализ кривой. Используйте настройки по умолчанию для гладкого анализа кривой или настроить по своему желанию. Выполнить гладкой модуль анализа кривой. В конце анализа, кимограф из изображений сессии будет отображаться.
- Переход к строке меню и меню "Вид" выберите пункт, а затем "Экспорт TIFF.
- Откройте сохраненный. TIF файл, содержащий кимограф в фотошопе или сопоставимые программы обработки изображений и преобразовать изображение в перевернутом оттенках серого.
9. Представитель Результаты
По отслеживание и анализ митохондриальной движение в культуре нейронов гиппокампа, мы продемонстрировали связь между нейромодуляции и митохондриальной торговли людьми. В частности, мы обнаружили, что серотонин (5-HT) или 5-HT1A рецепторов, 8-OH-DPAT, стимулирует митохондриальную движения (Рис. 2A-C) 8, тогда как дофамин (ДА) или D2 агонистов рецепторов, бромокриптин, тормозит митохондриальной движения (рис. 2D-G) 9.
Рисунок 1. Дизайн замкнутой цепи стадии топ-системы инкубатор следующие компоненты системы инкубатор показаны: Термостойкий Delrin пластиковый корпус (); прямоугольное отверстие для оконных поликарбонатного пластика (B), алюминий базе инкубатора (С); отверстий. принять стали сообщения из базы (D); 35.1mm диаметр отверстия с тонкими встраиваемые губой в центре инкубатора базы для размещения 35 блюд GBM (E); Nalgene шланги (соединения между культурой ткани и стадии топ-инкубаторов; влаги ловушки) ( F, G, N); культуре ткани инкубатора (H); аквариум насосом (I); герметичный ABS пластиковый бокс (корпус насоса для аквариума) (J); 2000 мл колбу Эрленмейера (глушитель для подавления вибрации в шланг до стадии топ- инкубатор) (К); пластиковый корпус для охлаждения вентилятора (L), пластиковая рамка для крышки 35 мм GBM (М); положение пластиковых кранами (O). Расположение портов для введения реагентов обозначены желтыми стрелками (II).
Рисунок 2. Представитель результаты: регулирование митохондриального транспорта А.. Axon типичного нейрона гиппокампа крыс в культуре. Митохондрии помечены лентивирус кодировке флуоресцентный белок отображаются зеленым цветом; аксонов immunolabeled с фосфорно-нейрофиламентов антител показаны красным цветом. Объем аксона обозначается желтой наконечники для стрел. Изображение состоит из четырех перекрывающихся снимках. Б. Пример покадровой серии изображений, показывающих изменения в митохондриальной движения после введения 5-HT. Изображения были получены с помощью перевернутой флуоресцентного микроскопа и хранится в виде последовательности, которые впоследствии были преобразованы в Quicktime фильмов. Представитель последовательность изображений показаны отдельные митохондрии в различные моменты времени до (слева) и после (справа) администрацией 8-OH-DPAT, 5-HT1A рецепторов. Вертикальный прямоугольник красного подчеркивает стационарных митохондрии (слева) и колебательные митохондрии (справа) в течение нескольких моментов времени. Колебательные митохондрии указано (слева) движется в сторону аксон терминала после лечения с помощью 8-OH-DPAT (правая панель, красный-белый граничит наконечники стрел). Вертикальная желтая линия (справа) указывает на начальную позицию движущихся митохондрии. Временные интервалы приведены в правом нижнем углу каждого кадра. Увеличение (63 ×) указывается в правом нижнем углу правой панели. C, D. участки, показывающие изменения в митохондриальной движения после введения 5-HT. Изменения в митохондриальной движения до (C) и после (D) введение 5-HT приводятся в виде графиков скорости (ось Х) по сравнению с начальной позиции отдельных митохондрий вдоль аксона (Y ось). Скорость и доля стационарных (красный), колебательной (синий), и направленно движется (зеленый) мitochondria представлены на участках и круговые диаграммы (вставками выше участков), соответственно. Красной пунктирной линией проецирование подчеркнул регионов мультфильма аксону к Y-ось каждого участка указывают приблизительное местоположение и степень аксон сегмент, который был образ. E, F. участки, показывающие изменения в митохондриальной движения после введения DA. Изменения в движении, прежде чем митохондриальная (E) и после (F) администрации Д. А. приводятся в виде графиков скорости (ось Х) по сравнению с начальной позиции отдельных митохондрий вдоль аксона (Y ось). Скорость и доля стационарных (красный), колебательной (синий), и направленно движется (зеленый) митохондрий представлены на участках и круговые диаграммы (вставками выше участков), соответственно. Красной пунктирной линией проецирование подчеркнул регионов мультфильма аксону к Y-ось каждого участка указывают приблизительное местоположение и степень аксон сегмент, который был образ. G, H. представитель kymographs показывает митохондриальной движения в культурной нейрона до (G) и после (H) администрации агонистов рецепторов D1R, бромокриптин. Нейрон отображаемого на один час раньше (G) и один час после (H) администрации бромокриптина.
Discussion
Используя лентивирус-опосредованной экспрессии флуоресцентный белок, ориентированные на митохондрии в инфицированных культурный нейронов и недорогие лабораторные построенной сцене верхом инкубатор, который позволяет изображений живых клеток в течение длительного длительности, мы смогли исследовать связь между митохондриальной движения и neuromodulatory сигналы , таких как серотонин (5-HT), допамина (ДА), а также ацетилхолин (АХ). Наши исследования помогли выяснить, что сигнальный путь, в первый раз, ссылки митохондриальной торговли изменений в активности нейронов модулированных по нейромедиаторов, таких как 5-НТ и DA - что лежат в основе нейронных функции. Мы считаем, что использование целевых флуоресцентных белков позволяет наблюдение меченых митохондрий в живых культурных нейронов в течение длительного периода, что может быть более актуальным, чем физиологически гораздо более короткие сроки, которые возможны с использованием витальных красителей. Кроме того, интенсивность флуоресцентного сигнала белка позволяет нам держать экспозиции в течение короткого захвата изображения, сводя к минимуму возможность фотообесцвечивания или фототоксичности. Наконец, простой и недорогой стадии топ-инкубатор, который поддерживает температуру окружающей среды, влажность и уровень СО2, при сведении к минимуму испарение средства массовой информации, позволяет проследить движение митохондриальной в живых нейронов в течение часов или даже дней. Исследователи, которые хотят изготовить стадии топ-инкубатор для долгосрочного наблюдения митохондрий в живых нейронах не должны следовать точные данные о нашем проекте, при условии, что свойства используемых материалов (например, газ мембрану, чтобы избежать испарения СМИ ) и принципы, применяемые (например, контроль температуры и влажности, буферизации рН, поддержание осмолярности) в целом согласуются с тем, что описано в этом протоколе.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Дональд Хатсон за вклад его технический опыт и высокое мастерство в ходе проектирования и изготовления стадии топ-инкубатора. Мы также благодарны Айда Dashtaei за отличную техническую помощь. Все Работа выполнена при поддержке Фонда исследования нейронаук.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1) Tissue culture incubator (H) | |||
| (1) Heat-resistant plastic enclosure (A) | (delrin or comparable) | ||
| (1) Plastic frame for 35mm GBM lid (M) | (for affixing membrane to petri dish) | ||
| (1-2) linear ft. Clear PFTE (Teflon) | membrane material | ||
| (4) Brass thumb screws | |||
| (2) Small 10kOhm heatsink resistors | used as heating elements inside stage-top incubator enclosure | ||
| (1) Transformer | supply of 9V current to resistors | ||
| (1) Terrarium temperature controller and probe | thermostatic regulation of power to heatsink resistors via transformer | ||
| (1) 2000ml Erlenmeyer flask (K) | muffler for vibration suppression in hose before stage-top incubator | ||
| (1) 1/8" sorbothane sheet | gasket material for base of stage-top incubator | ||
| (1) Airtight ABS (or comparable) plastic box (J) | housing for aquarium pump | ||
| (1) Aquarium pump (I) | |||
| (1) Small computer cooling fan | |||
| (1) Plastic enclosure for cooling fan (L) | |||
| (1) 9V transformer for computer cooling fan | |||
| (20-30ft) Nalgene or silicone hose (F,G,N) | connections between tissue culture and stage-top incubators; moisture traps | ||
| (2) Plastic stopcocks (O) | to open and close air flow before and after stage-top incubator | ||
| (4) Barbed brass hose connectors | for hose connections to/from stage-top incubator and aquarium pump enclosure | ||
| (2) Brass quick couplers | for hose connections to/from stage-top incubator | ||
| (2) Brass quick couplers | for hose connections to/from stage-top incubator | ||
| Table 1. Stage-top incubator parts: | |||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| laminin | Roche Group | 11243217001 | |
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek Corp. | P35GC-0-14-C | |
| DMEM | Life Technologies | 10567 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| Lipid-rich BSA | Life Technologies | 11020-021 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | A8381-100G | |
| Vitamin B-12 | Sigma-Aldrich | V2876-100MG | |
| 5-HT | Sigma-Aldrich | H9523-25MG | |
| 8-OH-DPAT | Sigma-Aldrich | H8520-25MG | |
| Dopamine | Sigma-Aldrich | H8502-5G | |
| Bromocriptine | Sigma-Aldrich | B2134-25MG | |
| SKF38393 | Sigma-Aldrich | D047-100MG | |
References
- Ligon, L. A., Steward, O. Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons. J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).
- Miller, K. E., Sheetz, M. P. Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria. J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).
- Macaskill, A. F. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Crawley, J. N. Current protocols in neuroscience. , J. Wiley. (1999).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Protocols for neural cell culture. , 3rd edn, Humana Press. (2001).
- Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons. Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).
- Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons. PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).
- Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. , e10848-e10848 (2010).
- Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors. Mol Ther. 1, 31-38 (2000).
