Neuromodulering och mitokondriell Transport: Bildproduktion i hippocampus nervceller under långa löptider

Summary

Vi beskriver ett protokoll som gör att avbildning av mitokondrierna i levande nervceller via fluorescensmikroskopi långa löptider. Imaging under längre perioder sker genom lentivirus-medierade uttryck för en mitochondrially riktade fluorescerande proteinet och användningen av ett billigt steg-topp inkubator som designades och byggdes i vårt laboratorium.

Abstract

För att förstå relationen mellan mitokondriernas transporter och neuronal funktion, är det viktigt att observera mitokondrie beteendet i levande odlade nervceller för längre löptider ^1-3. Detta är nu möjligt genom användning av vitala färgämnen och fluorescerande proteiner som cytoskelettala komponenter, organeller och andra strukturer i levande celler kan märkas och sedan visualiseras via dynamisk fluorescensmikroskopi. Till exempel i embryonala kyckling sympatiska nervceller, var mitokondrie rörelse kännetecknas med vitala färgämnet Rhodamine 123 ^4. I en annan studie var mitokondrier visualiseras i nervceller råtta framhjärnan av transfektion av mitochondrially riktade eYFP ^5. Däremot presenterar avbildning av primära neuroner än minuter, timmar eller dagar ett antal frågor. Främst bland dessa är: 1) underhåll av kultur som temperatur, fuktighet och pH under långa avbildning sessioner, 2) en stark och stabil fluorescerande signal för att säkra både kvaliteten av förvärvade bilder och noggrann mätning av signalstyrka under bildanalys; och 3) att begränsa exponeringen gånger under bilden förvärvet för att minimera fotoblekning och undvika fototoxicitet.

Här beskriver vi ett protokoll som tillåter observation, visualisering och analys av mitokondrie-rörelsen i odlade hippocampus nervceller med hög temporal upplösning och under optimala livsuppehållande förhållanden. Vi har konstruerat ett prisvärt steg-topp inkubator som ger bra temperaturreglering och atmosfärisk gasflöde, och också begränsar graden av media avdunstning, säkerställa stabila pH och osmolaritet. Detta inkubator är ansluten via in-och slangar utlopp, till en vanlig vävnadsodling inkubator som ger konstant luftfuktighet och en atmosfär av 5-10% CO ₂ / luft. Denna design erbjuder ett kostnadseffektivt alternativ till betydligt dyrare mikroskop inkubatorer som inte nödvändigtvis garantera livskraften i cellerna under flera timmar eller tom dagar. Att visualisera mitokondrierna, infektera vi celler med en lentivirus kodning en röd fluorescerande protein som är riktade till mitokondrien. Detta ger en stark och ihållande signal, som i samband med användning av en stabil xenon ljuskälla, ger oss möjlighet att begränsa exponeringen gånger under bildtagning och alla, men utesluter fotoblekning och fototoxicitet. Två injektion portar på toppen av scenen-top inkubator låta akut administrering av signalsubstanser och som är avsedda andra reagenser att modulera mitokondriella rörelse. Sammanfattningsvis lentivirus-medierad uttryck för en organell riktade rött fluorescerande protein och kombinationen av vår scen-top inkubator, en konventionell inverterat fluorescensmikroskop, CCD-kamera och xenon ljuskälla ger oss möjlighet att förvärva tidsförlopp bilder av mitokondriell transporter i levande nervceller över längre löptider än vad som är möjligt i studier driftsätta konventionella vitala färgämnen och off-the-shelf livsuppehållande system.

Protocol

1. Beskrivning av Lab inbyggda Stage-top Incubator

Att upprätthålla levande celler i mikroskop scen för förlängd erbjuder tre stora utmaningar: 1) omgivningstemperatur styrning och reglering, 2) fuktstyrning, dvs bibehålla fukthalten i miljö-atmosfären, och 3) underhåll av korrekt pH i odlingsmedium. Dessa "livsuppehållande" frågor är kritiska för försök med den långsiktiga observationer av odlade nervceller, celler som är särskilt känsliga för förändringar i temperatur och pH. Nedan beskriver vi en enkel lab byggda etappen-topp inkubator som vi konstruerat och tillverkat för live avbildning av nervceller under längre löptider. Detta inkubator är ansluten via en sluten krets, till en vanlig vävnadsodling inkubator (Thermo Scientific, Asheville, NC), vilket ger en stabil uppvärmd (37 ° C), fuktas atmosfär av 10% CO ₂ / 90% luft.

1. Inkubator kapsling: Kroppen av inkubatorn (figur 1 (I, II), A) var monterad på ett datoriserat C & C fräsmaskin från en solid bit svart Delrin plast. Den mäter 97.74mm (L) x 73.60mm (B) x 28.58mm (H), (inre dimensioner 96.74mm x 72.60mm x 27.58mm) som ger en sluten volym av cirka 19.370 cm ^3. Två hål borrades i vardera änden av kammaren och försedd med gängade mässing hullingar för att rymma in-och utlopp slangar från / till vävnadskultur inkubatorn. En rektangulär öppning som mäter 70.0mm x 43.0mm har fräst ut längst upp i skåpet för att möjliggöra placering av polykarbonatplast fönstret (Figur 1 (I, II), B). Basen i inkubatorn (figur 1 (I, II, III), C, ovanifrån och profil visas i detalj uppe till vänster), fräst ur 3 / 16 "aluminium lager, åtgärder 159.77mm (L) x 109.86mm (W ) x 3.175mm (D), och är utformad för att passa in insatsen fördjupningen av Leica motordriven 3-platta steg (Modell 11-522-068, Leica Gmbh, Leipzig, Tyskland). Fyra stålstolpar med invändiga gängor var knutna till . hörn thebase med infälld platt-skruvar Dessa ger solid fästpunkter för inkubatorn låda, som har borrats ut i varje hörn för att acceptera inlägg (figur 1 (II, III), D). En Sorbothane packning (McMaster Carr, Inc., Elmhurst, IL) skars och monterade på basen för att ge en tätning vid hölje / bas-gränssnitt. Fyra mässing skruvar med gäng som matchar av de tjänster som används för att säkra höljet till basen (Figur 1 (II, III),. D) En 35.1mm diameter på hål med en tunn infälld läpp klipptes i mitten av kuvösen bas för att rymma 35 mm sandblästrat stål (figur 1 (III), E, detalj uppe till vänster), extra baser har utformats för att rymma andra storlekar kultur maträtt.
2. Värmeelement: Två 10 kohm kylfläns motstånd (Digi-Key Corp, Thief River Falls, MN) är fastsatta på de inre väggarna i inkubatorn skåpet. Dessa är kopplade till en 9V DC, 500 mA transformator som är ansluten till en Alife 1000W terrarium temperaturregulator (Carolina Pet Supply, Irmo, SC). En trådbunden sond placeras genom en packning i polykarbonat fönster inkubatorn höljet känner av intern temperatur och bestämmer strömmen till motstånden. I samband med vävnadsodling inkubatorn, motstånden ger ett extra mått av omgivande temperatur kontroll.
3. Sluten atmosfär systemet: Att ge ett konstant fuktad och uppvärmd atmosfär av 10% CO ₂ / 90% luft, är scenen-top inkubator ansluten via in-och slangar utlopp (Figur 1 (I), F, G), till en standard, vattenmantlad vävnadsodling inkubator (figur 1 (I), H), Forma vetenskaplig modell 3154, Thermo Scientific, Inc., Asheville, NC). Strax innan du ansluter till det stadium-top inkubator, tilloppsslangen (figur 1 (I), F) kör in i ett standard akvarium pump (figur 1 (I), I, Lifegard QuietOne Modell 1200, Pentair Aquatics, El Monte, CA) som har varit i en sluten ABS plastlåda (figur 1 (I), J, Modell 1150, Pelican Products, Inc., Torrance, CA) för att upprätthålla en sluten krets. Denna pump arbetar kontinuerligt luftflöde från vävnadskultur inkubatorn till scenen-top inkubator. Efter pumpen scenen körs tilloppsslangen till en 1500 ml E-kolv (figur 1 (I), K) som fungerar som en ljuddämpare för att minimera överföringen av vibrationer från pumpen till scenen-top inkubator. En avloppsslang (Figur 1 (I), G) som leder från scenen-top inkubator för vävnadsodling inkubatorn (figur 1 (I), H) är utrustade med en komplett dator fläkt (figur 1 (I), L), som liksom pumpen, är också avsett att främja kontinuerlig ventilation.
4. PFTE membran lock för 35mm GBM: Före placera neuronala kultur i scenen-top inkubator för avbildning, är 35mm GBM utrustade med en speciell migmbrane lock (Figur 1 (II, IV), M, detaljer som ska visas uppe till höger) för att möjliggöra gasutbyte och samtidigt minimera avdunstning av odlingsmedium. Denna locket består av en Delrin plast fälg och en pre-cut ark PFTE membran (Teflon, amerikanska Durafilm Co, Inc., Holliston MA) som har sträckt över kanten och hålls på plats med en Viton packning som glider in i en infälld kanal längs sidan av Delrin plast fälgen.
5. Injektion portar: Två hål borrades in i polykarbonat fönstret (Figur 1 (II), centrum detalj, gula pilar i närheten av B) på scenen-top inkubator. Dessa var utrustade med rostfritt stål Hamilton sprutan slutar ge injektionen portar för att administrera 5-HT, DA, olika receptor agonister och antagonister, och andra reagenser under ett givet experiment.

2. Beredning av primär hippocampus kulturer

Allt arbete utförs i antingen en BSL2 laminärt flöde huva eller i ett laminärt flöde bänk. Primära hippocampus nervceller är isolerade från E18 råtta embryon enligt standardrutiner ^6-7, och odlas i serum-fri medium som har betingats av primär kortikal astrocyter. Gliaceller är upprättad enligt publicerade metoder ^7. Den betingade medel består av lågt glukos DMEM, kompletterat med Proline (1,76 ug / ml), asparagin (0,83 ug / ml), vitamin B12 (0,34 ug / ml), glukos (20mm), fettrika BSA (0,5 mg / ml ) och 2% av B27 ^8-10. Inga antibiotika tillsättas medium eftersom de kan störa neuronala gentranskription.

1. Täck den centrala delen glaset täckglas av en 35mm glasbottnade kultur skål (GBM) med poly-D-lysin (0,05 mg / ml i PBS), och låt stå i två timmar vid 37 ° C. Aspirera poly-D-lysin lösning, låt torka i 20 minuter i en BSL2 laminärt flöde huva. Täck poly-D-lysin-belagda täckglas delen av GBM med laminin (0,01 mg / ml i PBS), och låt stå i minst 40 minuter innan du tar bort överskottet laminin lösningen. Ställ åt sidan i 20 minuter.
2. Dissekera hippocampi från hjärnan hos E18 råtta embryon, och separera dem som beskrivs i Aktuella protokoll i neurovetenskap ^6.
3. Späd dissocierade celler till grogrund för att möjliggöra en densitet på 110 tusen celler per GBM. Beräkna nödvändiga koncentrationen av celler i Master Mix beroende på antalet sandblästrat stål kommer du att förbereda.
4. Placera seedad sandblästrat stål i en inkubator som ATA temperatur på 37 ° C och en atmosfär blandning av 10% CO ₂ / 90% luft.
5. Tre till fem dagar senare, beroende på odlingsförhållanden av nervceller, till kulturer lägga arabinoside C (0,14 ng / ml) för att undertrycka glial spridning.
6. Låt kulturerna att växa i två veckor innan infekterar med lentivirus. Under denna tid ersätta en tredjedel av volymen av mediet i varje GBM med färska medelstora var tredje dag. Inte överstiger detta belopp av media, eftersom detta kan leda till osmotisk chock och celldöd.

3. Beredning av Rekombinant lentivirus Kodning röda fluorescerande protein

För utredare som inte har tillgång till anläggningar för produktion av rekombinanta lentiviruses är anpassad produktion av ett kommersiellt företag, t.ex. System Biosciences (Mountain View, CA) ett alternativ.

En mitochondrially riktade rött fluorescerande protein genen (MitoTurboRFP, Axxora LLC, San Diego, CA) sätts in i en själv-inaktivering rekombinant felint immunbristvirus under transkriptionella kontroll av förstärkare från cytomegalovirus större omedelbara tidigt genen ^11. Rekombinant lentiviruses tillverkas av övergående transfecting 293T celler.

1. Tavla 293T celler vid en densitet på ~ 75 tusen celler / cm ^2, följande dag, co-transfektera cellerna med plasmider som kodar för rekombinanta, virala vektorer, FIV gag och gener pol, och vesikulär stomatit viruset G glykoproteingenen, med PolyJet (SignaGen Laboratorier, Gaithersburg, MD). Totalt 12 ug av DNA (4,8 mikrogram virala vektorer, 4,8 mikrogram gagpol plasmiden, och 2,4 mikrogram VSV G plasmid) används för varje 10cm kultur fat med 293T celler.
2. Efter 24 timmar, aspirera odlingsmedium och celler tvätta med fenolrött utan Hanks balanserade saltlösning för att avlägsna rester av DNA. Tillsätt 10 ml av serum-fri neurala bassubstratets kompletteras med 50μg/ml fettrika BSA och Glutamax.
3. Följande dag, skörd supernatanten, filtrera genom ett 0,2 mikron låg proteinbindning och lägga till en Vivaspin 20 polyetersulfon ultrafiltrering enhet (Sartorius, Concord, USA). Förbehandla Vivaspin enheten genom att sekventiellt tvättning med 70% etanol, vävnadskulturer kvalitet vatten och fosfatbuffrad saltlösning. Koncentrera viruset innehåller supernatant ~ 50 gånger genom centrifugering vid 1500xg i 30 minuter. Alikvotera viruset förberedelser och förvara i flytande N ₂.
4. Uppskatta mängden virus genom att infektera råtta B104 celler med en delmängd av koncentrerad virus och mäta fluorescerande protein uttryck med flödescytometri 72 timmar senare. Andelen positiva celler ger en uppskattning av mängden virus, dvs del koncentrerad viruset krävs för att få fluorescerande protein uttryck i ett visst antal primära nervceller.

4. Infektion av odlade neuron

Hippocampus neuron kulturer är smittade i 14 dagar in vitro genom att helt enkelt lägga till mängden virus uppskattas att smitta upp till 50% av alla nervceller baserad på data flödescytometri. Ingen polybrene används. Kulturer bevaras i 3 dagar innan du kontrollerar för fluorescerande protein uttryck. Om signalen är för svag, då kulturen är tillbaka till vävnadsodling inkubatorn och testas igen efter flera dagar.

5. Allmänt underhåll av Closed Circuit livsuppehållande system

1. För att bibehålla rätt fuktighet, se till att inkubatorn är vattnet jacka regelbundet kontrolleras och fyllas vid behov. Se till att placera ett rostfritt stål eller aluminium fack inuti kuvösen som innehåller en liten mängd vatten (25mm djupt) och algicide.
2. Vid behov, rensa inlopp och slangar utlopp inkubatorn atmosfären kretsen genom att tömma samlas vatten från avrinningsområdet rör. Periodiskt spola slangarna med 70% etanol.

6. Tillämpa Membrane Lock till GBM och placering i Stage-top Incubator

1. Innan placering av GBM inne i scenen-top inkubator, ersätta plast locket med membran täckt lock i en vävnadsodling huva. När detta är gjort kan du flytta den täckta GBM i mikroskop.
2. Försiktigt stolen GBM med membran täckt-lock i infällda öppningen på basen av scenen-top inkubator. För att undvika att knuffas i GBM, se till att basen är redan på plats i mikroskop skede, eftersom basen klipp till scenen med viss svårighet är det bäst att placera GBM efter att basen är på plats.
3. Rikta in inkubatorn kapsling med stålet inläggen på inkubatorn och de lägre höljet på basen. Dra åt tumskruvarna tills en bra tätning uppnås mellan kapsling och bas.

7. Image Acquisition

Observera att majoriteten av tillgängliga plattformar bildbehandlingsprogram har jämförbara funktioner inom ett brett spektrum av mikroskop och tillhörande hårdvara. En mängd olika bild insamling och analys mjukvaruplattformar finns tillgängliga, inklusive metamorfa och program som är avsedda för specifika fabrikat av mikroskop, såsom Leica Application Suite, Nikons NIS-element, och Carl Zeiss "AxioVision. I detta protokoll, beskriver vi den bild förvärv och förfaranden analys vi utförs med hjälp av Slidebook 5 (Intelligent Imaging Innovationer, Denver, CO). Däremot kan de ingående stegen för varje operation som beskrivs i detta protokoll vara lätt anpassas till användning av en rad andra program.

Beskrivning av inverterat fluorescensmikroskop, filtrera konfigurationer, CCD-kamera, xenon ljuskälla, och bildprogram:

För dynamisk avbildning av mitokondriell transporter i hippocampus neuroner använder vi en Leica DMI-6000B inverterat fluorescensmikroskop och modell 11-522-068 motoriserade stadium (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Tyskland) utrustad med en Cooke Sensicam EQ CCD-kamera (Den Cooke Corporation, Detroit, MI), en Sutter Lambda 10-2 filterhjul och controller (Sutter Instrument Company, Novato, CA), och en Sutter GD-4 300W xenon ljuskälla. Att visualisera mitokondrier märkta med MitoTurbo röda fluorescerande proteinet, använder vi en kombination av en 555nm filter på GD-4 ljuskälla för excitation och filter för 600 Nm (topp, Sedat Quad Beamsplitter Modell 86100bs monteras på Leica DM-serien filter kub, Chroma Teknik Corp, Bellows Falls, VT) och 617nm vid mikroskopet och filter hjul, respektive för utsläpp.

För bild och analys använder vi den digitala mikroskopi bildprogram paket Slidebook 5. Detta är ett omfattande paket som låter helt automatiserad kontroll över mikroskopet, scen, filterhjul, kamera och ljuskälla under bilden förvärvet, samt en variation av bildbehandling och moduler analys.

Nedan ger vi specifika, steg-för-steg-instruktioner för att hämta bilder gången förfaller flytta mitokondrier i fluorescerande nervceller med hjälp av Slidebook 5.

1. Se till att mikroskop, filterhjul controller, ljuskälla, och CCD-kameran har slagits på innan du öppnar Slidebook 5.
2. För levande avbildning av mitokondrier, byta till en 63x olje-nedsänkning mål, lägre målet turreten tillräckligt för att ge tillgång till målet under mikroskop scenen (och fas-Top inkubator), och noggrant gäller olja direkt på ytan av målet. Öppna fokus fönstret genom att klicka på "Focus Window-ikonen till Slidebook verktygsfältet. I fokus fönstret, slå på brightfield lampa genom att skjuta ett reglage märkt "lampa" för att justera brightfield intensitet till en lämplig nivå. Förvärva fokusera på ett område av celler och hitta en cell av intresse.
3. Under "Räckvidd" fliken, välj "CY3" fluor. Med hjälp av okularen, enligt fluorescensbelysning hitta planet i fokus för mitokondrier i cellerna som har märkt med Mito TurbRed protein. När du har fått fokus genom okularen, byt till CCD-kameran och åter få fokus om det behövs.
4. Öppna fönstret Bildinsamling genom att klicka på "Bildinsamling" ikonen på Slidebook verktygsfältet. Börjar med en inledande exponeringstid på 100 ms, hitta den optimala exponeringen tiden med "Test" och "Hitta bästa" knappar, alternativt kan du använda "En gång"-knappen. Kom ihåg att exponeringstiden bör ge gott om intensitet spridda över hela bildfältet (t.ex. 0-2500, angiven med histogram i botten av bilden capture fönstret) på kortast tid (t.ex. 200-800ms).
5. Innan du börjar tidsförlopp bild förvärv, öppna "Avancerat"-fönstret genom att klicka på fliken "Avancerat" fortfarande i bilden capture-fönstret. Hitta de "Focus"-fliken, markera "Autofous" under time-lapse/multipoint fångar "alternativ, och justera autofokus inställningarna för time-lapse bild förvärvet. Generellt använder vi följande parametrar för autofokus: uppdatering fokus var 2-3 bilder, välj den autofokus kanal Fluor används för avbildning märkt mitokondrier, dvs CY3, totalt sökning urval 2 um för 63x förstoring.
6. I "Capture"-fönstret, under "Capture Typ"-rutan, kolla "Timelapse" alternativet och väljer en avbildning intervall och varaktighet bildhantering session under "Timelapse Capture" alternativ. I våra studier av effekterna av neuromodulators på mitokondriella transporter, var tidsförlopp bildbehandling utförs i en timme sessioner där totalt 360 bilder förvärvades till 10 sekunders intervall mellan bilderna.
7. Start tidsförlopp bild förvärv genom att klicka på knappen "Start" längst ner, höger sida, av "Capture"-fönstret.
8. Efter den första, eller kontroll, bildhantering session, administrera signalsubstanser och andra reagenser via toppen hamnar i fas-top inkubator och starta en ny bildbehandling session.

8. Bildanalys

1. Öppna bildfilen sparats efter den senaste imaging sessionen.
2. Individuella mitokondrierna kan märkas i ett tidsförlopp bildserie antingen automatiskt eller manuellt genom att använda maskeringen funktioner som tillhandahålls i Slidebook 5.
3. Under "Mask" menyn, välj "segment" från menyraden. Genom att skjuta de låga och höga tröskeln raden av "histogram" verktyg, maskering alla partiklar i blått i hela bilden, som täcker alla mitokondrier som finns i processen, men lämnar partiklar så diskret som möjligt. Applicera masken på hela bilden serien.
4. Skapa en andra mask (enligt "Mask" menyn, välj "Skapa") som täcker hela bilden med undantag för process intresse där partiklarna har lyfts fram av den tidigare masken. Detta sker dels genom den tjockaste "penna" verktyg för att spåra gränserna för de områden utanför processen, och sedan, med hjälp av "Paint Bucket" verktyg för att fylla i avgränsas regionerna. Applicera denna mask för att hela bilden serien.
5. Under "Mask", välj "Mask Drift och utföra" minus "drift, dvs är den andra masken subtraheras från knytnäve masken (hela bilden utom processen). En tredje masken kommer att skapas där endast den process av intresse markeras. Observera att detta nya masken kommer att tillämpas på hela bilden serien.
6. Under "Anteckningar" väljer du "Objekt-ID."
7. Kontrollera att kontinuitet och numeriska uppdrag av enskilda maskerade mitokondrier genom att manuellt granska bildserie (i Slidebook 5, "spela", "framåt frame" och "omvänd ram, kan" knapparna under bilden fönstret kan användas för detta ändamål).
8. Välj "Mask" fliken på menyraden. Under "Mask" väljer du "Partikel-Tracking" och kör "Grundläggande Partikel Spårning" för att generera "Path Statistik," inklusive koordinaterna för tyngdpunkten för varje maskerade mitokondrien.
9. Sträcka som i mitokondrien mellan två närliggande bildrutor beräknas från koordinaterna för varje partikel i varje bildruta.
10. I våra tidigare studier av effekten av neuromodulators på mitokondriella rörelse, identifierade vi tre distinkta populationer av mitokondrier:. "Stationära", "oscillerande" och "directionally flytta" Om en mitokondrien reser mindre än 0,2 um (eller 2 pixlar, under 63x förstoring, 1 pixel = 0,10235 um) inom en timme, är det karaktäriseras som "stationär". Om en mitokondrien går minst 0,2 um, men mindre än 2.5 um, i en anterograd-retrograd cykeln bör det definieras som "oscillerande". Slutligen, om en mitokondrien färdas ett netto avstånd av mer än 2,5 um i en riktning, är det kategoriseras som att flytta directionally. Visas i Figur 2 är ett histogram över utvecklingen av alla märkta mitokondrier i en representativ experiment, samt ett cirkeldiagram som visar procentuell fördelning av tre olika populationer av mitokondrier.
11. Medelhastighet i mitokondrien beräknas efter sammanlagda sträcka under en viss avbildning session. Den genomsnittliga hastigheten för en mitokondriell befolkning beräknas genom att lägga individuella hastigheter och dividera med det totala antalet mitokondrier spåras.
12. Kymographs kan genereras med en modul som i Slidebook 5. Med hjälp av "mask"-funktion, dra en tunn linje över hela omfattningen av en viss process (t.ex. axon), vara säker på att passera så många mitokondrie centroids som möjligt. Gå till "Mask" fliken i menyraden och välj "Avancerade funktioner" och sedan "mjuk kurva analys." Använd standardinställningen för mjuk kurva analys eller anpassa efter behov. Kör väl modulen kurvan analys. I slutet av analysen kommer en kymograph av imaging sessionen visas.
13. Gå till menyraden och välj "Visa" och sedan "Exportera TIFF."
14. Öppna den sparade. TIF-fil som innehåller kymograph i Photoshop eller liknande bildbehandlingsprogram och konvertera bilden till inverterad gråskala.

9. Representativa resultat

Genom att spåra och analysera mitokondrie-rörelsen i odlade hippocampus nervceller, vi har visat på ett samband mellan neuromodulering och mitokondriella människohandel. Specifikt fann vi att serotonin (5-HT) eller 5-HT1A receptoragonist, 8-OH-DPAT, stimulerar mitokondriella rörelse (Figur 2A-C) ^8, medan dopamin (DA) eller D2-receptoragonist, bromokriptin, hämmar mitokondriella rörelse (Figur 2D-G) ^9.

Figur 1. Design av sluten fas-top inkubator-system Följande komponenter i inkubatorn systemet visas: Värmeresistent Delrin plast hölje (A), rektangulär öppning för polykarbonatplast fönster (B), aluminium bas av inkubatorn (C), hål. att acceptera stålstolpar bas (D), 35.1mm diameter hålet med tunna infälld läpp i mitten av inkubatorn bas för att rymma 35 mm GBM rätter (E), Nalgene slangar (anslutningar mellan vävnadsodling och steg-top inkubatorer, fukt fällor) ( F, G, N), vävnadsodling inkubator (H), akvarium pump (I), lufttät ABS-plast låda (bostäder för akvarium pump) (J), 2000 ml E-kolv (ljuddämpare för vibrationer i slangen innan steg-top inkubator) (K), plast kapsling för kylfläkt (L), plastram för 35mm GBM lock (M), ställning av plast kranar (O). Placering av portar för administration av reagens markeras med gula pilar i (II).

Figur 2. Representativa resultat: reglering av mitokondriell transporter A.. Axon på en typisk råtta hippocampus neuron i kulturen. Mitokondrier märkta med en lentivirus-kodad fluorescerande proteinet visas i grönt, axoner immunolabeled med fosfor-neurofilament antikroppar visas i rött. Omfattning av Axon är markerad med gula pilar. Bilden består av fyra överlappande micrographs. B. Exempel på ett tidsförlopp bildserie visar förändringar i mitokondriernas rörelse efter administrering av 5-HT. Bilder förvärvades via ett inverterat fluorescensmikroskop och lagras som sekvenser som senare konverterades till Quicktime-filmer. En representant sekvens av bilder visar de enskilda mitokondrier vid olika tidpunkter före (till vänster) och efter (högra panelen) administrering av 8-OH-DPAT, en 5-HT1A receptoragonist. Vertikal röd rektangel visar en stationär mitokondrien (vänster) och en oscillerande mitokondrien (till höger) över flera tidpunkter. Den oscillerande mitokondrien anges (till vänster) går mot axonet terminalen efter behandling med 8-OH-DPAT (högra panelen, röd-kantade vita pilspetsar). Den vertikala gula linjen (högra panelen) indikerar utgångsläget för de rörliga mitokondrien. Tidsintervall visas i nedre högra hörnet av varje bildruta. Förstoring (63 ×) är indicerat vid nedre högra hörnet på höger panel. C, D. tomter som visar förändringar i mitokondriernas rörelse efter administrering av 5-HT. Förändringar i mitokondriella rörelsen före (C) och efter (D) administrering av 5-HT presenteras som tomter av hastighet (X-axeln) jämfört med första positionerna av enskilda mitokondrier längs axonet (Y-axeln). Hastighet och andel av stationära (röd), oscillerande (blå) och directionally rörelse (grön) mitochondria finns representerade i tomter och cirkeldiagram (inläggningar ovan tomter), respektive. Röda streckade linjer utskjutande från markerade områden i den tecknade axon till Y-axel på varje tomt visar ungefärliga position och omfattningen av axonet segment som var avbildade. E, F. tomter som visar förändringar i mitokondriernas rörelse efter administrering av DA. Förändringar i mitokondriella rörelsen före (E) och efter (F) administration av DA presenteras som tomter av hastighet (X-axeln) jämfört med första positionerna av enskilda mitokondrier längs axonet (Y-axeln). Hastighet och andel av stationära (röd), oscillerande (blå) och directionally rörelse (grön) mitokondrier finns representerade i tomter och cirkeldiagram (inläggningar ovan tomter), respektive. Röda streckade linjer utskjutande från markerade områden i den tecknade axon till Y-axel på varje tomt visar ungefärliga position och omfattningen av axonet segment som var avbildade. G, H. representant kymographs visar mitokondrie rörelse i ett odlade neuron före (G) och efter (H) administration av D1R receptoragonist, bromokriptin. Neuron avbildades i en timme innan (G) och en timme efter (H) administration av bromokriptin.

Discussion

Använda lentivirus-medierad uttryck av ett fluorescerande proteinet riktad till mitokondrierna i infekterade odlade nervceller och en billig lab byggda etappen-topp inkubator som tillåter avbildning av levande celler för längre löptider, har vi kunnat undersöka sambandet mellan mitokondriernas rörelse och signaler neuromodulatory , som serotonin (5-HT), dopamin (DA) och acetylkolin (ACh). Våra studier har bidragit till att belysa en signalväg som för första gången, länkar mitokondriella människohandel till förändringar i aktiviteten hos nervceller-moduleras av neurotransmittorer, såsom 5-HT och DA - som är kärnan i neural funktion. Vi finner att användning av riktade fluorescerande proteiner tillåter observation av märkta mitokondrierna i levande odlade nervceller under längre perioder som kan vara mer fysiologiskt relevant än mycket kortare löptider som möjligt med viktiga färgämnen. Dessutom tillåter intensitet fluorescerande proteinet signalen oss att hålla exponeringstider kort vid bildtagning, vilket minimerar risken för fotoblekning eller fototoxicitet. Slutligen ger en enkel och billig steg-top inkubator som håller omgivningstemperatur, luftfuktighet och CO _2-nivåer, och samtidigt minimera avdunstning av media, oss att följa mitokondrie-rörelsen i levande nervceller under timmar eller tom dagar. Forskare som vill tillverka en fas-top inkubator för den långsiktiga observationer av mitokondrierna i levande nervceller behöver inte följa de exakta detaljerna i vår design, förutsatt att egenskaperna hos de material som används (t.ex. gas membran för att undvika avdunstning av media ) och principer som tillämpas (t.ex. temperatur och luftfuktighet, buffring av pH, underhåll av osmolalitet) är generellt överensstämmande med vad som beskrivs i detta protokoll.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1) Tissue culture incubator (H)
(1) Heat-resistant plastic enclosure (A)			(delrin or comparable)
(1) Plastic frame for 35mm GBM lid (M)			(for affixing membrane to petri dish)
(1-2) linear ft. Clear PFTE (Teflon)			membrane material
(4) Brass thumb screws
(2) Small 10kOhm heatsink resistors			used as heating elements inside stage-top incubator enclosure
(1) Transformer			supply of 9V current to resistors
(1) Terrarium temperature controller and probe			thermostatic regulation of power to heatsink resistors via transformer
(1) 2000ml Erlenmeyer flask (K)			muffler for vibration suppression in hose before stage-top incubator
(1) 1/8" sorbothane sheet			gasket material for base of stage-top incubator
(1) Airtight ABS (or comparable) plastic box (J)			housing for aquarium pump
(1) Aquarium pump (I)
(1) Small computer cooling fan
(1) Plastic enclosure for cooling fan (L)
(1) 9V transformer for computer cooling fan
(20-30ft) Nalgene or silicone hose (F,G,N)			connections between tissue culture and stage-top incubators; moisture traps
(2) Plastic stopcocks (O)			to open and close air flow before and after stage-top incubator
(4) Barbed brass hose connectors			for hose connections to/from stage-top incubator and aquarium pump enclosure
(2) Brass quick couplers			for hose connections to/from stage-top incubator
(2) Brass quick couplers			for hose connections to/from stage-top incubator
Table 1. Stage-top incubator parts:
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
laminin	Roche Group	11243217001
35 mm glass-bottom dishes	MatTek Corp.	P35GC-0-14-C
DMEM	Life Technologies	10567
B27	Life Technologies	17504-044
Glutamax	Life Technologies	35050
Lipid-rich BSA	Life Technologies	11020-021
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Proline	Sigma-Aldrich	A8381-100G
Vitamin B-12	Sigma-Aldrich	V2876-100MG
5-HT	Sigma-Aldrich	H9523-25MG
8-OH-DPAT	Sigma-Aldrich	H8520-25MG
Dopamine	Sigma-Aldrich	H8502-5G
Bromocriptine	Sigma-Aldrich	B2134-25MG
SKF38393	Sigma-Aldrich	D047-100MG