Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll, das Bildgebung von Mitochondrien ermöglicht in lebenden Nervenzellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie über einen längeren Zeitraum. Imaging über längere Zeiträume durch Lentivirus-vermittelte Expression von mitochondrial gezielte fluoreszierendes Protein und Verwendung eines kostengünstigen Bühne-Top-Inkubator, entworfen und gebaut wurde in unserem Labor durchgeführt.

Abstract

Um zu verstehen, die Beziehung zwischen mitochondrialen Transport und neuronale Funktion, ist es entscheidend, mitochondriale Verhalten in lebenden kultivierten Neuronen für längere Laufzeiten ^1-3 beobachten. Dies ist nun durch den Einsatz von vitaler Farbstoffe und fluoreszierende Proteine, mit denen Zytoskelett-Komponenten, Organellen und anderen Strukturen in lebenden Zellen markiert und dann visualisiert werden können durch dynamische Fluoreszenz-Mikroskopie möglich. Zum Beispiel, in embryonalen Huhn sympathischen Neuronen wurde mitochondrialen Bewegung charakterisiert die vitalen Farbstoff Rhodamin 123 ^4. In einer anderen Studie wurden Mitochondrien visualisiert in Rattenvorderhirn Neuronen durch Transfektion von mitochondrial gezielte EYFP ^5. Jedoch stellt Bildgebung von primären Neuronen über Minuten, Stunden oder sogar Tage eine Reihe von Fragen. An erster Stelle sind: 1) Pflege der Kultur, wie Temperatur, Feuchtigkeit und pH-Wert während langer Imaging-Sitzungen, 2) eine starke, stabile Fluoreszenz-Signal, um sowohl die Qualität der aufgenommenen Bilder und genaue Messung der Signalintensität während der Bildanalyse zu gewährleisten; und 3) die Begrenzung der Exposition Mal während der Bildaufnahme zu minimieren Bleichen und zur Vermeidung von Phototoxizität.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Beobachtung, Visualisierung und Analyse der mitochondrialen Bewegung in kultivierten Hippocampus-Neuronen mit hoher zeitlicher Auflösung und unter optimalen Lebens unterstützen Bedingungen erlaubt. Wir haben eine erschwingliche Bühne-Top-Inkubator, dass eine gute Temperaturregelung und atmosphärischen Gasstrom bietet gebaut, und schränkt auch den Grad der Medien Verdunstung, versicherte stabilen pH-Wert und Osmolarität. Dieser Inkubator ist über Ein-und Auslass-Schläuche, um eine Standard-Gewebekultur-Inkubator, der konstante Luftfeuchtigkeit und eine Atmosphäre von 5-10% CO ₂ / Luft bietet. Diese Konstruktion bietet eine kostengünstige Alternative zu wesentlich teureren Mikroskop Inkubatoren, die nicht unbedingt versichern die Lebensfähigkeit der Zellen über viele Stunden oder sogar Tage. Zur Visualisierung Mitochondrien, infizieren wir Zellen mit einem Lentivirus kodierend für ein rot fluoreszierendes Protein, das an den Mitochondrien abzielt. Dies sichert eine starke und anhaltende Signal, das in Verbindung mit dem Einsatz eines stabilen Xenon-Lichtquelle, ermöglicht es uns, Belichtungszeiten während der Bildaufnahme zu begrenzen und alle, aber schließt Bleichen und Phototoxizität. Zwei Einspritzöffnungen am oberen Rand der Bühne-Top-Inkubator ermöglicht die akute Verabreichung von Neurotransmittern und anderen Reagenzien bestimmt zu modulieren mitochondrialen Bewegung. In der Summe Lentivirus-vermittelte Expression von einer Organelle gezielte rot fluoreszierendes Protein und die Kombination unserer Bühne-Top-Inkubator, eine konventionelle invertierten Fluoreszenzmikroskop, CCD-Kamera und Xenon-Lichtquelle ermöglichen es uns, Zeitraffer-Bilder der mitochondrialen Transport in erwerben lebenden Neuronen über lange Zeiträume als möglich in Studien den Einsatz konventioneller Vitalfarbstoffen und off-the-shelf lebenserhaltenden Systemen.

Protocol

1. Beschreibung der Lab-built Stage-top Incubator

Die Aufrechterhaltung lebender Zellen auf einem Mikroskop-Bühne für längere Laufzeiten bietet drei großen Herausforderungen: 1) Umgebungstemperatur Steuerung und Regelung, 2) Feuchteregelung, dh die Aufrechterhaltung Feuchtigkeitsgehalt der Umgebungsatmosphäre und 3) Einhaltung eines angemessenen pH-Wert im Kulturmedium. Diese "Life Support" Fragen sind entscheidend für die Versuche mit der langfristigen Beobachtung von kultivierten Neuronen, Zellen, die besonders empfindlich auf Veränderungen von Temperatur und pH-Wert sind. Im Folgenden beschreiben wir eine einfache Labor Baustufe-Top-Inkubator, dass wir so konstruiert und gebaut für die Live-Darstellung von Neuronen über lange Zeiträume. Dieser Inkubator verbunden ist, über einen geschlossenen Kreislauf, um ein Standard-Gewebekultur-Inkubator (Thermo Scientific, Asheville, NC), die eine stabile beheizt (37 ° C), feuchten Atmosphäre von 10% CO ₂ / 90% Luft bietet.

1. Incubator Gehäuse: Der Körper des Inkubators (Abbildung 1 (I, II); A) wurde auf einer computergesteuerten C & C-Fräsmaschine aus einem massiven Stück aus schwarzem Delrin Kunststoff gefertigt. Er misst 97.74mm (L) x 73.60mm (W) x 28.58mm (H), (Innenmaße 96.74mm x 72.60mm x 27.58mm) Bereitstellen einer geschlossenen Volumen von etwa 19.370 cm ^3. Zwei Löcher wurden an beiden Enden des Gehäuses gebohrt und mit Gewinde Messing Widerhaken an Ein-und Auslass-Schläuche von / zum Gewebekultur-Inkubator unterzubringen. Eine rechteckige Öffnung von 70.0mm x 43.0mm wurde an der Oberseite des Gehäuses gemahlen werden, um die Platzierung eines Polycarbonat-Kunststoff-Fenster (Abbildung 1 (I, II); B) zu ermöglichen. Die Basis des Inkubators (Abbildung 1 (I, II, III); C; Draufsicht und Profil im Detail oben links dargestellt), von 3 / 16 "Alu-Lager gefräst, Maßnahmen 159.77mm (L) x 109.86mm (W ) x 3,175 mm (D), und ist so konzipiert, in den Einsatz Ausnehmung einer Leica motorisierten 3-Platten-Bühne (Modell 11-522-068, Leica GmbH, Leipzig, Deutschland). Four Stahlpfosten mit Innengewinde fit wurden befestigt . den Ecken derUnterseite von Unterputz-Flachkopfschrauben Diese bilden eine solide Befestigungspunkte für den Inkubator-Gehäuse, welches worden ist an jeder Ecke gebohrt, um die Beiträge (Abbildung 1 (II, III); D) zu akzeptieren. A Sorbothane Dichtung (McMaster Carr, Inc., Elmhurst, IL) wurde geschnitten und ausgestattet, um die Basis, um eine Dichtung am Gehäuse / base-Schnittstelle bereitstellen. Four Messing Rändelschrauben mit Gewinde passend, dass der Pfosten werden verwendet, um das Gehäuse an der Basis (Abbildung sichern 1 (II, III);. D) A 35.1mm Durchmesser Loch mit einer dünnen vertiefte Lippe stand im Mittelpunkt des Inkubators Basis abgeschnitten zu 35mm GBM (Abbildung 1 (III) aufzunehmen; E; Detail links oben); zusätzliche Basen wurden entwickelt, um andere Kulturschale Größen aufzunehmen.
2. Heizelemente: Zwei 10 Kohm Kühlkörper Widerstände (Digi-Key Corporation, Thief River Falls, MN) sind an den Innenwänden des Inkubators Gehäuse angebracht. Diese werden an eine 9V DC, 500mA Transformator eingesteckt in eine Alife 1000W Terrarium Temperaturregler (Carolina Heimtierbedarf, Irmo, SC) verdrahtet ist. Eine drahtgebundene Sonde durch eine Dichtung in der Polycarbonat-Fenster des Inkubators Gehäuse platziert erkennt interne Umgebungstemperatur und ermittelt Stromfluss zu den Widerständen. In Verbindung mit der Gewebekultur-Inkubator, bieten die Widerstände in einem höheren Maß von der Umgebungstemperatur zu kontrollieren.
3. Geschlossener Kreislauf Atmosphäre-System: Um eine konstante befeuchtet und aufgeheizten Atmosphäre von 10% CO ₂ / 90% Luft zu versorgen, ist die Bühne-Top-Inkubator verbunden, über Ein-und Auslass-Schläuche (Abbildung 1 (I); F, G), eine Standard-, Wasser-ummantelten Gewebekultur-Inkubator (Abbildung 1 (I); H); Forma Scientific Modell 3154, Thermo Scientific, Inc., Asheville, NC). Kurz vor der Verbindung mit dem Bühnen-Top-Inkubator, der Zulaufschlauch (Abbildung 1 (I); F) läuft in einem Standard-Aquarium-Pumpe (Abbildung 1 (I); I; Lifegard QuietOne Modell 1200, Pentair Aquatics, El Monte, CA) (; J; Abbildung 1 (I) Modell 1150, Pelican Products, Inc., Torrance, CA), das in einem geschlossenen ABS-Kunststoff-Box eingeschlossen worden, um einen geschlossenen Kreislauf aufrecht zu erhalten. Diese Pumpe fördert kontinuierlichen Luftstrom aus der Gewebekultur-Inkubator auf die Bühne-Top-Inkubator. Nachdem die Pumpe Bühne, läuft der Zulaufschlauch eine 1500ml Erlenmeyerkolben (Abbildung 1 (I); K), die als Schalldämpfer, um die Übertragung von Vibrationen der Pumpe auf die Bühne-Top-Inkubator minimieren wirkt. Ein Ablaufschlauch (Abbildung 1 (I); G), die von der Bühne-Top-Inkubator der Gewebekultur-Inkubator (Abbildung 1 (I); H) ist mit einem geschlossenen Lüfter des Computers (Abbildung 1 (I); L) ausgestattet, die, wie die Pumpe, soll auch kontinuierlichen Luftstrom zu fördern.
4. PFTE Foliendeckel für 35mm GBM: Vor Inbetriebnahme des neuronalen Kultur in der Phase-Top-Inkubator für die Bildgebung, die 35mm GBM ist mit einem speziellen mir ausgestattetmbrane Deckel (Abbildung 1 (II, IV); M; Detail rechts oben dargestellt), damit der Gasaustausch und zur gleichen Zeit zu minimieren Verdunstung von Kulturmedium. Dieser Deckel besteht aus einem Delrin Kunststoff-Felge und einem Pre-Cut Blatt PFTE-Membran (Teflon, American Durafilm Co., Inc., Holliston MA), die über den Rand gestreckt worden ist und an der Stelle mit einer Viton-Dichtung, die in einem rutscht ausgesparten Kanal entlang der Seite des Delrin Kunststoff-Felge.
5. Injection-Ports: Zwei Löcher wurden in die Polycarbonat-Fenster (Abbildung 1 (II), in der Mitte Detail, gelbe Pfeile in der Nähe B) von der Bühne-Top-Inkubator gebohrt. Diese waren ausgestattet mit Edelstahl-Hamilton-Spritze Enden Einspritzöffnungen für die Verwaltung von 5-HT, DA, verschiedene Rezeptor-Agonisten und Antagonisten, und andere Reagenzien in einem gegebenen Experiment liefern.

2. Herstellung von primären hippokampalen Kulturen

Alle Arbeit ist entweder in einer BSL2 Laminarströmungshaube oder in einer laminaren Strömung Bank durchgeführt. Primäre Neuronen im Hippocampus sind von E18 Rattenembryonen gemäß Standardverfahren ^6-7 isoliert und sind in serum-freiem Medium, die von primären kortikalen Astrozyten konditioniert worden ist gewachsen. Gliazellen sind nach publizierten Methoden ⁷ vorbereitet. Das konditionierte Medium besteht aus niedrigen Glucose DMEM mit Prolin ergänzt (1,76 ug / ml), Asparagin (0,83 ug / ml), Vitamin B12 (0,34 ug / ml), Glucose (20mm), lipidreichen BSA (0,5 mg / ml ) und 2% der B27 ^8-10. Keine Antibiotika zum Medium gegeben, wie sie mit neuronalen Gen-Transkription stören können.

1. Decken Sie die zentrale Deckglas Teil einer 35-mm-Glas-bottom Kulturschale (GBM) mit Poly-D-Lysin (0,05 mg / ml in PBS) und stehen lassen, für zwei Stunden bei 37 ° C. Saugen Sie die Poly-D-Lysin-Lösung, lassen Sie es 20 Minuten in einem BSL2 Laminarströmungshaube trocken. Decken Sie die Poly-D-Lysin-beschichtete Deckglas Teil der GBM mit Laminin (0,01 mg / ml in PBS), und lassen Sie für mindestens 40 Minuten vor dem Entfernen des überschüssigen Laminin-Lösung. Beiseite für 20 Minuten.
2. Dissect hippocampi aus den Gehirnen von E18 Rattenembryonen und distanzieren sie wie beschrieben in Current Protocols in Neuroscience ^6.
3. Verdünnen dissoziierten Zellen in Wachstumsmedium für eine Dichte von 110.000 Zellen pro GBM zu ermöglichen. Berechnen Sie die notwendige Konzentration der Zellen in Ihrem Master-Mix nach der Anzahl der GBM Sie vorbereiten wird.
4. Ort ausgesät GBM in einem Inkubator gesetzt ata Temperatur von 37 ° C und einer Atmosphäre Gemisch aus 10% CO ₂ / 90% Luft.
5. Drei bis fünf Tage später, je nach Anbaubedingungen der Neuronen, fügen Arabinosid C (0,14 ng / ml) zu den Kulturen zu Gliawucherung zu unterdrücken.
6. Lassen Sie den Kulturen, für zwei Wochen vor Infektion mit dem Lentivirus wachsen. Während dieser Zeit ersetzt ein Drittel des Volumens des Mediums in jeder GBM mit frischem Medium alle drei Tage. Nicht mehr als diese Menge an Medien, da dies zu osmotischen Schock und Zelltod führen kann.

3. Herstellung von rekombinanten Lentivirus Encoding Red Fluorescent Protein

Für Forscher, die keinen Zugang zu den Anlagen zur Herstellung von rekombinanten Lentiviren ist Auftragsproduktion von Gewerbebetrieben zB System Biosciences (Mountain View, CA) eine Option.

Ein mitochondrial gezielte rot fluoreszierende Protein-Gen (MitoTurboRFP; Axxora LLC, San Diego, CA) wird in eine Selbst-inaktivierende rekombinante Feline Immunodeficiency Virus unter der transkriptionellen Kontrolle des Verstärkers aus dem Cytomegalovirus großen immediate early-Promotor ¹¹ eingesetzt. Rekombinante Lentiviren sind durch transiente Transfektion von 293T-Zellen produziert.

1. Platte 293T-Zellen bei einer Dichte von ~ 75.000 Zellen / cm ^2, am folgenden Tag, Co-Transfektion von Zellen mit Plasmiden des rekombinanten viralen Vektor, FIV gag und pol-Gene und der vesikulären Stomatitis-Virus G-Glykoprotein-Gen, mit PolyJet (SignaGen Laboratories, Gaithersburg, MD). Insgesamt 12 ug DNA (4,8 pg viralen Vektor, 4,8 pg gagpol Plasmid und 2,4 ug VSV G-Plasmid) ist für jeden 10cm Kulturschale von 293T-Zellen verwendet.
2. Nach 24 Stunden absaugen Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit Phenolrot-freiem Hanks balanced salt solution, um restliche DNA zu entfernen. Fügen Sie 10 ml serumfreiem neuronalen Basalmedium mit 50μg/ml lipidreichen BSA und Glutamax ergänzt.
3. Der folgende Tag, der Ernte der Überstand, filtriert durch ein 0,2-Mikrometer-Filter mit niedriger Proteinbindung und fügen eine Vivaspin 20 Polyethersulfon Ultrafiltrationsanlage (Sartorius, Concord, USA). Vorbehandlung des Vivaspin Einheit durch sequentielles Waschen mit 70% Ethanol, Gewebekultur-Wasser, und Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Konzentrieren Sie sich das Virus-haltige Überstand ~ 50-fach durch Zentrifugation bei 1500xg für 30 Minuten. Aliquot des Virus Vorbereitung und speichern in flüssigem N ₂.
4. Schätzen Sie die Anzahl der Viren durch Infektion Ratte B104-Zellen mit einem Aliquot von konzentrierter Virus und Mess-fluoreszierende Protein-Expression mittels Durchflusszytometrie 72 Stunden später. Der Anteil der positiven Zellen liefert eine Schätzung der Menge des Virus, dh Volumen konzentrierter Virus benötigt, um fluoreszierende Protein-Expression in einer bestimmten Anzahl von primären Neuronen zu erhalten.

4. Die Infektion von kultivierten Neuronen

Hippokampalen Neuronen Kulturen werden bei 14 Tagen in vitro durch einfaches Hinzufügen der Virusmenge geschätzt zu infizieren bis zu 50% aller Neuronen auf Durchflusszytometrie Daten infiziert. Keine Polybren verwendet wird. Kulturen werden 3 Tage vor dem Check für fluoreszierende Protein-Expression erhalten. Wenn das Signal zu schwach ist, dann wird die Kultur der Gewebekultur-Inkubator und erneut nach einigen Tagen zurück.

5. Allgemeine Wartung von Closed Circuit Life Support System

1. Zur Aufrechterhaltung richtige Luftfeuchtigkeit, stellen Sie sicher, dass der Inkubator der Wassermantel in regelmäßigen Abständen überprüft und bei Bedarf aufgefüllt. Achten Sie darauf, ein Edelstahl-oder Aluminium-Fach im Inneren des Inkubators Ort mit einer kleinen Menge Wasser (25mm tief) und Algizid.
2. Wenn nötig, klare Ein-und Auslass-Schläuche des Inkubators Atmosphäre Schaltung durch Entleeren gesammelte Wasser aus dem Einzugsgebiet Röhren. In regelmäßigen Abständen bündig die Schläuche mit 70% Ethanol.

6. Die Anwendung Foliendeckel zu GBM und Placement in Stage-top Incubator

1. Vor Platzierung der GBM in der Phase-Top-Inkubator, ersetzen Sie den Kunststoff-Deckel mit der Membran-bedeckten Deckel in einer Gewebekultur Kapuze. Sobald dies erledigt ist, können Sie die überdachte GBM, das Mikroskop zu bewegen.
2. Stecken Sie die GBM mit der Membran-bedeckten Deckel in die ausgesparte Öffnung auf der Unterseite der Bühne-Top-Inkubator. Um zu vermeiden, drängeln die GBM, stellen Sie sicher, dass die Basis bereits vorhanden ist auf dem Mikroskoptisch; da die Basis-Clips in der Bühne mit einigen Schwierigkeiten ist es am besten, die GBM statt, nachdem die Basis ist in Position.
3. Richten Sie den Inkubator-Gehäuse mit der Stahl-Thema des Inkubators und niedrigere das Gehäuse auf den Boden. Ziehen Sie die Schrauben, bis eine gute Abdichtung zwischen Gehäuse und Boden erreicht wird.

7. Image Acquisition

Beachten Sie, dass die Mehrheit der verfügbaren Bildbearbeitungsprogrammen Plattformen vergleichbarer Funktionalität sind in einem breiten Spektrum von Mikroskopen und der dazugehörigen Hardware. Eine Vielzahl von Bild-Akquisition und Analyse-Software-Plattformen zur Verfügung, einschließlich MetaMorph und Programme für bestimmte Marken-Mikroskop entwickelt, wie Leica Application Suite, Nikons NIS-Elements, und Carl Zeiss AxioVision. In diesem Protokoll, beschreiben wir die Bildaufnahme und-analyse Verfahren, die wir unter Verwendung von Slidebook 5 (Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO). Allerdings kann die konstituierende Schritte jeder Operation in diesem Protokoll beschriebenen ohne weiteres auf die Verwendung einer Vielzahl von anderen Programmen angepasst werden.

Beschreibung des invertierten Fluoreszenzmikroskop, Filter-Konfigurationen, CCD-Kamera, Xenon-Lichtquelle und Imaging-Software:

Für dynamische Bildgebung der mitochondrialen Transport in Hippocampus-Neuronen, verwenden wir eine Leica DMI-6000B invertierten Fluoreszenzmikroskop und Modell 11-522-068 Motortisch (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Deutschland) mit einem Cooke Sensicam EQ-CCD-Kamera (The Cooke ausgestattet Corporation, Ann Arbor, MI), einem Sutter Lambda 10-2 Filterrad und Controller (Sutter Instrument Company, Novato, CA) und eine Sutter DG-4 300W Xenon-Lichtquelle. Zur Visualisierung Mitochondrien gekennzeichnet mit dem MitoTurbo rot fluoreszierendes Protein, verwenden wir die Kombination aus einer 555nm-Filter an der DG-4 Lichtquelle für die Anregung und Filter von 600nm (Peak; Sedat Quad Strahlteiler Modell 86100bs ausgestattet, Leica DM-Serie Filter Würfel, Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT) und 617nm am Mikroskop und Filterrad jeweils für die Emission.

Für die Bildaufnahme und-analyse, verwenden wir die digitale Mikroskopie-Software-Paket Slidebook 5. Dies ist ein umfassendes Paket, das vollautomatische Steuerung des Mikroskops, Bühne, Filterrad, Kamera und Lichtquelle während der Bildaufnahme, sowie eine Vielzahl von Bildverarbeitungs-und Analyse-Module ermöglicht.

Im Folgenden bieten wir spezielle, Schritt-für-Schritt-Anleitungen für den Erwerb von Zeitreihen-Aufnahmen von bewegten Mitochondrien in fluoreszenzmarkierten Neuronen mit Slidebook 5.

1. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop, Filterrad-Controller, Lichtquelle, und CCD-Kamera wurden auf vor dem Öffnen Slidebook 5 ausgeschaltet.
2. Für die Live-Darstellung von Mitochondrien, ein 63X Ölimmersionsobjektiv Schalter, senken Sie den Objektivrevolver ausreichend, um den Zugriff auf das Ziel, unter dem Mikroskop Bühne bieten (und Bühne-Top-Inkubator) und sorgfältig ölen direkt auf die Oberfläche des Objektivs. Öffnen Sie das Fokus-Fenster durch Anklicken des 'Focus Window' Symbol auf dem Slidebook Symbolleiste. In der Fokus-Fenster, auf dem Hellfeld Lampe, indem Sie einen Schieberegler mit 'Lampe' to Hell Intensität auf ein geeignetes Niveau anzupassen. Erwerben Fokus auf ein Feld von Zellen und finden Sie eine Zelle von Interesse.
3. Unter dem "Scope", wählen Sie das "CY3" fluor. Mit den Okularen, unter fluoreszierendem Licht finden die Fokusebene für Mitochondrien in den Zellen, die mit dem Mito TurbRed Protein markiert worden sind. Sobald Sie konzentrieren durch die Okulare erworben haben, auf die CCD-Kamera wechseln und wieder erwerben konzentrieren, wenn nötig.
4. Öffnen Sie das Bild Capture-Fenster, indem Sie auf "Image Capture"-Symbol auf dem Slidebook Symbolleiste. Beginnend mit einer ersten Belichtungszeit von 100 ms, die optimale Belichtungszeit mit dem 'Test' und 'Find Best' Buttons, alternativ können Sie die 'Once' Taste zu verwenden. Beachten Sie, dass Belichtungszeit sollte genügend Intensität über das gesamte Bildfeld verteilt erbringen (zB, 0-2500; gekennzeichnet durch Histogramm im unteren Bereich der Bilderfassung Fenster) innerhalb einer Mindestdauer (zB 200-800ms).
5. Vor Beginn der Zeitraffer-Bildaufnahme, öffnen Sie das 'Advanced' Fenster, indem Sie die Registerkarte "Erweitert" noch innerhalb der Bilderfassung Fenster. Finden Sie die 'Focus' tab, überprüfen Sie die "Autofous 'während time-lapse/multipoint erfasst"-Option, und stellen Sie die Autofokus-Einstellungen für Zeitraffer-Bildaufnahme. Generell verwenden wir die folgenden Parameter für Autofokus: update Fokus alle 2-3 Frames, wählen Sie die Autofokus-Kanal der Fluor für die Bildgebung verwendet markierten Mitochondrien, also CY3; insgesamt Suchbereich 2 um für 63x Vergrößerung.
6. In der 'Capture' Fenster unter 'Capture Type "-Feld, überprüfen Sie die" Timelapse "-Option, und wählen Sie die gewünschte Bildgebung Intervall und Dauer der Imaging-Sitzung unter" Timelapse Capture' Optionen. In unseren Studien über die Auswirkungen von Neuromodulatoren auf die mitochondriale Transport wurde Zeitraffer-Imaging in 1 Stunde Sitzungen, in denen insgesamt 360 Bilder in Intervallen von 10 Sekunden zwischen den Bildern erworben wurden, durchgeführt.
7. Starten Sie Zeitraffer-Bildaufnahme, indem Sie auf "Start"-Button am unteren, rechten Seite, der 'Capture' Fenster.
8. Nach der ersten, oder Kontrolle, Imaging-Sitzung, zu verwalten Neurotransmittern und anderen Reagenzien über Kopf-Ports auf der Bühne-Top-Inkubator und beginnen ein neues bildgebendes Sitzung.

8. Image Analysis

1. Öffnen Sie die Bilddatei nach dem letzten Imaging-Sitzung gespeichert.
2. Individuelle Mitochondrien können in einem Zeitraffer-Bildserien beschriftet entweder automatisch oder manuell durch den Einsatz der Maskierung Funktionen in Slidebook 5 vorgesehen.
3. Unter der "Maske" Wählen Sie im Menü "Segment" aus der Menüleiste. Durch Verschieben der niedrigen und hohen Schwelle Linie der "Histogramm"-Tool, Maskierung aller Teilchen in blau in das gesamte Bild, die alle den Mitochondrien im Prozess enthalten, sondern verlassen Partikel als diskrete wie möglich. Tragen Sie die Maske auf das gesamte Bild-Serie.
4. Erstellen Sie eine zweite Maske (unter der "Maske" Wählen Sie im Menü "Erstellen"), die das gesamte Bild erstreckt sich bis auf den Prozess von Interesse, in denen die Teilchen durch die vorherige Maske hervorgehoben wurde. Dies erfolgt zunächst durch den dicksten "Bleistift"-Tool, um die Grenzen der Gebiete außerhalb des Prozesses zu verfolgen und dann mit dem "Farbeimer"-Werkzeug, um in der begrenzten Regionen zu füllen. Wenden Sie diese Maske, um das gesamte Bild-Serie.
5. Unter "Mask" die Option "Maske Operations 'und führen' Minus 'Betrieb, dh die zweite Maske aus dem Faust-Maske (das gesamte Bild mit Ausnahme der Verfahren) subtrahiert. Eine dritte Maske erzeugt, in denen nur der Prozess von Interesse hervorgehoben werden. Beachten Sie, dass diese neue Maske auf das gesamte Bild-Serie angewendet werden.
6. Unter "Anmerkungen", "Object IDs." Wählen
7. Überprüfen Sie, ob die Kontinuität und die numerischen Werte der einzelnen maskierten Mitochondrien durch manuelle Überprüfung der Bild-Serie (in Slidebook 5, die "Play", "vorne Frame" und "Reverse Frame kann" Tasten unter dem Bildfenster für diesen Zweck verwendet werden).
8. Wählen Sie die "Maske" auf die Registerkarte Menüleiste. Unter "Mask" die Option "Particle Tracking" und führen Sie 'Basic Particle Tracking' zu generieren 'Path Statistik', einschließlich Koordinaten des Schwerpunktes für jeden maskierten Mitochondrium.
9. Wegstrecke von jedem Mitochondrium zwischen zwei benachbarten Einzelbildern aus den Koordinaten der einzelnen Teilchen in jedem Frame berechnet.
10. In unseren früheren Untersuchungen der Wirkung von Neuromodulatoren auf die mitochondriale Bewegung, haben wir drei unterschiedliche Populationen von Mitochondrien:. "Stationären", "schwingende" und "gerichtet bewegen" Wenn ein Mitochondrium reist weniger als 0,2 um (oder 2 Pixel, unter 63X Vergrößerung; 1 Pixel = 0,10235 um) innerhalb einer Stunde, wird es als charakterisiert "stationären". Wenn ein Mitochondrium bewegt mindestens 0,2 um, aber weniger als 2.5 um, in einem anterograde-retrograde Zyklus, ist es definiert als "schwingende". Wenn schließlich ein Mitochondrium reist eine Netto-Abstand von mehr als 2,5 um in eine Richtung, es ist kategorisiert als bewegte gerichtet. Dargestellt in Abbildung 2 ist ein Histogramm, die Bewegung aller markierten Mitochondrien in einem repräsentativen Experiment, sowie ein Tortendiagramm zeigt die prozentuale Verteilung der drei verschiedenen Populationen von Mitochondrien.
11. Durchschnittliche Geschwindigkeit jedes Mitochondrium ist nach Gesamtstrecke während eines bestimmten Imaging-Sitzung reiste berechnet. Die mittlere Geschwindigkeit eines mitochondrialen Bevölkerung wird durch Zugabe von einzelnen Geschwindigkeiten und dividiert durch die Gesamtzahl der Mitochondrien verfolgt berechnet.
12. Kymographs kann mit Hilfe eines Moduls in Slidebook 5 vorgesehen sein. Mit der "Maske"-Funktion, ziehen Sie eine dünne Linie über den gesamten Umfang eines bestimmten Prozesses (zB Axon); sicher sein, passieren so viele Mitochondrien Schwerpunkte wie möglich. Gehen Sie auf die "Maske" auf die Registerkarte Menüleiste und wählen Sie "Erweiterte Funktionen" und dann "Smooth Curve Analysis." Verwenden Sie die Standardeinstellung für die glatte Kurve Analyse oder anpassen, wie gewünscht. Führen Sie die glatte Kurve Analyse-Modul. Am Ende der Analyse wird ein Kymographion der Imaging-Sitzung angezeigt.
13. Gehen Sie auf die Menüleiste und wählen Sie "Ansicht" und dann "Export TIFF.
14. Öffnen Sie die gespeicherte. Tif-Datei mit dem Kymographion in Photoshop oder einem vergleichbaren Bildbearbeitungsprogramm und konvertieren Sie das Bild invertiert Graustufen.

9. Repräsentative Ergebnisse

Durch die Verfolgung und Analyse der Mitochondrien-Bewegung in kultivierten Hippocampus-Neuronen, haben wir eine Verbindung zwischen Neuromodulation und mitochondriale Handel gezeigt. Insbesondere fanden wir, dass Serotonin (5-HT) oder die 5-HT 1A-Rezeptor-Agonist, 8-OH-DPAT, regt mitochondrialen Bewegung (Abbildung 2a-c) ^8, während Dopamin (DA) oder der D2-Rezeptor-Agonisten, Bromocriptin, hemmt mitochondrialen Bewegung (Abbildung 2D-G) ^9.

Abbildung 1. Design der geschlossenen Kreislauf Bühne-Top-Inkubator-System folgende Komponenten des Inkubators System angezeigt: Hitzebeständige delrin Kunststoffgehäuse (A); rechteckige Öffnung für Polycarbonat-Kunststoff-Fenster (B); Aluminium Basis des Inkubators (C); Löcher. zu akzeptieren, Stahlpfosten der Basis (D); 35.1mm Durchmesser Loch mit dünnen vertiefte Lippe in der Mitte des Inkubators Basis zu 35mm GBM Gerichte (E) aufnehmen; Nalgene Schläuche (Verbindungen zwischen Gewebekultur und Bühne-Top-Inkubatoren, Feuchtigkeit Fallen) ( F, G, N); Gewebekultur-Inkubator (H); Aquarium Pumpe (I); luftdicht ABS Kunststoff-Box (Gehäuse für Aquarium-Pumpe) (J); 2000ml Erlenmeyerkolben (Schalldämpfer für Schwingungsdämpfung im Schlauch vor der Stufe-top Inkubator) (K), Kunststoff-Gehäuse für Lüfter (L), Kunststoff-Rahmen für 35mm GBM Deckel (M); Position der Kunststoff-Hähne (O). Standorte der Häfen für die Verwaltung von Reagenzien sind durch gelbe Pfeile in (II) angegeben.

Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse: Regulierung der mitochondrialen Transport A.. Axon eines typischen Rattenhippocampus Neuron in der Kultur. Mitochondrien mit einem Lentivirus-kodierten fluoreszierenden Protein markiert sind in grün dargestellt; Axone mit phospho-Neurofilament Antikörper immunolabeled sind in rot dargestellt. Umfang der Axon ist durch gelbe Pfeilspitzen markiert. Bild besteht aus vier überlappenden Aufnahmen zusammengesetzt. B. Beispiel für einen Zeitraffer-Bildserien, die Veränderungen in der mitochondrialen Bewegung nach der Verabreichung von 5-HT. Die Bilder wurden über einen invertierten Fluoreszenzmikroskop erfasst und gespeichert als Sequenzen, die später in Quicktime-Filme umgewandelt wurden. Eine repräsentative Bildfolge zeigt einzelne Mitochondrien zu verschiedenen Zeitpunkten vor (links) und nach (rechts) Verabreichung von 8-OH-DPAT, ein 5-HT1A-Rezeptor-Agonist. Vertical rote Rechteck zeigt eine stationäre Mitochondrien (links) und eine oszillierende Mitochondrium (rechts) über mehrere Zeitpunkte. Die oszillierende Mitochondrium angegeben (linkes Bild) ist auf die Axonterminal nach der Behandlung bewegt sich mit 8-OH-DPAT (rechtes Bild; rot umrandete weiße Pfeilspitzen). Die vertikale gelbe Linie (rechts) zeigt die Startposition der Bewegung Mitochondrium. Zeitintervalle sind in der unteren rechten Ecke der einzelnen Frames angezeigt. Vergrößerung (63 ×) ist an der rechten unteren Ecke des rechten Fensterbereich angezeigt. C, D. Grundstücke, die Veränderungen in der mitochondrialen Bewegung nach der Verabreichung von 5-HT. Änderungen in der mitochondrialen Bewegung vor (C) und nach (D) Gabe von 5-HT sind als Grundstücke der Geschwindigkeit (X-Achse) vs Ausgangspositionen der einzelnen Mitochondrien entlang des Axons (Y-Achse) dargestellt. Velocity und der Anteil der stationären (rot), oszillierende (blau), und gerichtet bewegt (grün) mitochondria sind in Parzellen und Kreisdiagramme (Einschübe über Grundstücke), jeweils vertreten. Red gestrichelten Linien Projektion von markierten Bereiche der Comic-Axon auf die Y-Achse jedes Grundstück zeigen ungefähren Standort und Umfang der Axon-Segment, das war abgebildet. E, F. Grundstücke, die Veränderungen in der mitochondrialen Bewegung nach der Verabreichung von DA. Änderungen in der mitochondrialen Bewegung vor (E) und nach (F) Verabreichung von DA sind Grundstücke der Geschwindigkeit (X-Achse) vs Ausgangspositionen der einzelnen Mitochondrien entlang des Axons (Y-Achse) dargestellt. Velocity und der Anteil der stationären (rot), oszillierende (blau), und gerichtet bewegt (grün) Mitochondrien sind in Parzellen und Kreisdiagramme (Einschübe über Grundstücke) vertreten, bzw.. Red gestrichelten Linien Projektion von markierten Bereiche der Comic-Axon auf die Y-Achse jedes Grundstück zeigen ungefähren Standort und Umfang der Axon-Segment, das war abgebildet. G, H. Vertreter kymographs zeigt mitochondrialen Bewegung in einer kultivierten Neuronen vor (G) und nach (H) Verwaltung des D1R-Rezeptor-Agonisten, Bromocriptin. Das Neuron wurde für eine Stunde vor (G) und eine Stunde nach (H) Gabe von Bromocriptin abgebildet.

Discussion

Der Einsatz Lentivirus-vermittelte Expression eines fluoreszierenden Proteins gezielt an die Mitochondrien in infizierten kultivierten Neuronen und eine preiswerte Labor Baustufe-Top-Inkubator, der Bildgebung an lebenden Zellen für längere Laufzeiten ermöglicht, haben wir in der Lage, die Verbindung zwischen mitochondrialen Bewegung und neuromodulatorischen Signale zu untersuchen wie Serotonin (5-HT), Dopamin (DA) und Acetylcholin (ACh). Unsere Studien haben dazu beigetragen, einen Signalweg, der zum ersten Mal, Links mitochondrialen Menschenhandel zu Veränderungen in der Aktivität von Neuronen moduliert durch Neurotransmitter wie 5-HT-und DA-Aufklärung -, dass im Herzen der neuronalen Funktion. Wir finden, dass die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen gezielt die Beobachtung der markierten Mitochondrien in lebenden kultivierten Neuronen über lange Zeiträume, die mehr physiologisch relevanter als die viel kürzere Laufzeiten möglich sind, mit vitalen Farbstoffe können zulässt. Darüber hinaus ermöglicht die Intensität der fluoreszierenden Proteins Signal uns zu halten Belichtungszeiten kurz während der Bildaufnahme, minimiert die Möglichkeit von Ausbleichen oder Phototoxizität. Schließlich ermöglicht eine einfache und kostengünstige Stufe-Top-Inkubator, der Umgebungstemperatur, Luftfeuchtigkeit und CO _2-Gehalt führt, bei gleichzeitiger Minimierung der Verdunstung von Medien, uns zu mitochondrialen Bewegung in lebenden Nervenzellen über Stunden oder sogar Tage zu folgen. Forscher, die auf einer Bühne-Top-Inkubator für die Langzeit-Beobachtungen von Mitochondrien Herstellung in lebenden Neuronen wollen, müssen sich nicht an die genauen Einzelheiten unserer Design, vorausgesetzt, die Eigenschaften der verwendeten Materialien (z. B. Gas-durchlässige Membran zur Verdampfung von Medien zu vermeiden ) und Grundsätze angewandt (zB Temperatur und Luftfeuchtigkeit, Pufferung des pH-Wertes, die Aufrechterhaltung der Osmolarität) sind in der Regel im Einklang mit dem, was in diesem Protokoll beschrieben.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1) Tissue culture incubator (H)
(1) Heat-resistant plastic enclosure (A)			(delrin or comparable)
(1) Plastic frame for 35mm GBM lid (M)			(for affixing membrane to petri dish)
(1-2) linear ft. Clear PFTE (Teflon)			membrane material
(4) Brass thumb screws
(2) Small 10kOhm heatsink resistors			used as heating elements inside stage-top incubator enclosure
(1) Transformer			supply of 9V current to resistors
(1) Terrarium temperature controller and probe			thermostatic regulation of power to heatsink resistors via transformer
(1) 2000ml Erlenmeyer flask (K)			muffler for vibration suppression in hose before stage-top incubator
(1) 1/8" sorbothane sheet			gasket material for base of stage-top incubator
(1) Airtight ABS (or comparable) plastic box (J)			housing for aquarium pump
(1) Aquarium pump (I)
(1) Small computer cooling fan
(1) Plastic enclosure for cooling fan (L)
(1) 9V transformer for computer cooling fan
(20-30ft) Nalgene or silicone hose (F,G,N)			connections between tissue culture and stage-top incubators; moisture traps
(2) Plastic stopcocks (O)			to open and close air flow before and after stage-top incubator
(4) Barbed brass hose connectors			for hose connections to/from stage-top incubator and aquarium pump enclosure
(2) Brass quick couplers			for hose connections to/from stage-top incubator
(2) Brass quick couplers			for hose connections to/from stage-top incubator
Table 1. Stage-top incubator parts:
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
laminin	Roche Group	11243217001
35 mm glass-bottom dishes	MatTek Corp.	P35GC-0-14-C
DMEM	Life Technologies	10567
B27	Life Technologies	17504-044
Glutamax	Life Technologies	35050
Lipid-rich BSA	Life Technologies	11020-021
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Proline	Sigma-Aldrich	A8381-100G
Vitamin B-12	Sigma-Aldrich	V2876-100MG
5-HT	Sigma-Aldrich	H9523-25MG
8-OH-DPAT	Sigma-Aldrich	H8520-25MG
Dopamine	Sigma-Aldrich	H8502-5G
Bromocriptine	Sigma-Aldrich	B2134-25MG
SKF38393	Sigma-Aldrich	D047-100MG