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Neuroscience

Neuromodulation और Mitochondrial परिवहन: लंबे durations पर hippocampal न्यूरॉन्स में लाइव इमेजिंग

Published: June 17, 2011 doi: 10.3791/2599
* These authors contributed equally

Summary

हम एक प्रोटोकॉल है कि समय durations पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से न्यूरॉन्स में रहने वाले mitochondria की अनुमति देता है इमेजिंग का वर्णन. विस्तारित अवधि में इमेजिंग lentivirus एक mitochondrially लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एक सस्ती मंच टॉप इनक्यूबेटर कि बनाया गया था और हमारी प्रयोगशाला में बनाया का उपयोग की अभिव्यक्ति की मध्यस्थता के माध्यम से पूरा किया है.

Protocol

1. लैब बनाया चरण शीर्ष इनक्यूबेटर का विवरण

, 2) आर्द्रता नियंत्रण, यानी, पर्यावरण वातावरण की नमी सामग्री को बनाए रखने, और 3) संस्कृति के माध्यम में उचित पीएच के रखरखाव 1) परिवेश तापमान नियंत्रण और विनियमन: विस्तारित durations के लिए एक खुर्दबीन के मंच पर जीवित कोशिकाओं को बनाए रखने तीन प्रमुख चुनौतियों प्रदान करता है. ये 'जीवन समर्थन' के मुद्दों सभ्य न्यूरॉन्स, कोशिकाओं है कि विशेष रूप से तापमान और pH में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील कर रहे हैं की लंबी अवधि के अवलोकन से जुड़े प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं. नीचे, हम एक सरल मंच शीर्ष इनक्यूबेटर कि हम डिजाइन और निर्माण विस्तारित durations के अधिक न्यूरॉन्स के रहते इमेजिंग के लिए प्रयोगशाला बनाया का वर्णन करता है. इस मशीन, एक क्लोज सर्किट के माध्यम से जुड़ा हुआ है एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (थर्मो वैज्ञानिक, Asheville, नेकां), जो एक स्थिर गर्म (37 डिग्री सेल्सियस), 10% CO 2 / 90% हवा की humidified वातावरण प्रदान करता है.

  1. इनक्यूबेटर संलग्नक, एक कम्प्यूटरीकृत सी और सी मिलिंग मशीन पर काले delrin प्लास्टिक की एक ठोस टुकड़ा से निर्मित किया गया था इनक्यूबेटर शरीर (चित्र 1 (मैं, द्वितीय)) :. यह उपाय 97.74mm (एल) x 73.60mm (डब्ल्यू) x (एच) 28.58mm, (96.74mm की आंतरिक आयाम x 72.60mm एक्स 27.58mm) 19,370 लगभग 3 सेमी की एक बंद मात्रा प्रदान बाड़े के दोनों छोर पर दो छेद drilled थे और लड़ी पिरोया पीतल अकड़ के साथ फिट करने के लिए / से टिशू कल्चर इनक्यूबेटर Inlet और आउटलेट hoses को समायोजित. एक आयताकार खोलने 70.0mm x 43.0mm मापने बाहर बाड़े के शीर्ष पर milled एक polycarbonate प्लास्टिक की खिड़की (चित्रा 1 (मैं, द्वितीय), बी) की नियुक्ति की अनुमति . (सी, चित्रा 1 (मैं, द्वितीय, तृतीय) शीर्ष देखने और प्रोफ़ाइल ऊपर छोड़ दिया पर विस्तार में दिखाया गया है) इनक्यूबेटर के आधार, 3 / 16 "एल्यूमीनियम स्टॉक से milled, 159.77mm (एल) x (109.86mm डब्ल्यू उपायों ) x (डी) 3.175mm, और एक Leica 3 थाली चरण चार (11-522-068 मॉडल, Leica GmbH, लाइपजि + ग, जर्मनी). आंतरिक धागे के साथ इस्पात प्रविष्टियाँ motorized के अवकाश डालने में फिट करने के लिए डिज़ाइन करने के लिए संलग्न थे एक sorbothane गैसकेट, फ्लश घुड़सवार फ्लैट सिर शिकंजा द्वारा thebase के कोनों इनक्यूबेटर संलग्नक, जो प्रत्येक कोने में drilled किया गया है पदों (डी चित्रा 1 (द्वितीय, तृतीय)) को स्वीकार करने के लिए ठोस लगाव अंक प्रदान करते हैं. (McMaster Carr, Inc, Elmhurst, आईएल) में कटौती करने के लिए और आधार करने के लिए फिट करने के लिए इंटरफ़ेस / बाड़े के आधार पर एक मुहर प्रदान सूत्रण के साथ चार पीतल thumbscrews मिलान पदों के आधार (चित्रा बाड़े को सुरक्षित करने के लिए उपयोग किया जाता है. 1 (द्वितीय, तृतीय), डी) एक पतली recessed होंठ के साथ एक 35.1mm व्यास छेद इनक्यूबेटर आधार के केंद्र में कटौती को समायोजित करने के लिए 35 मिमी GBMs (चित्रा 1 (तृतीय), ई, ऊपर छोड़ दिया पर विस्तार), अतिरिक्त कुर्सियां अन्य संस्कृति डिश आकार को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है.
  2. ताप तत्वों: दो 10 Kohm गर्मी सिंक प्रतिरोधों (Digi-कुंजी कार्पोरेशन, चोर River Falls, MN) इनक्यूबेटर बाड़े के भीतर की दीवारों से चिपका कर रहे हैं. ये एक 9V डीसी, 500mA ट्रांसफॉर्मर है कि एक Alife 1000W टेरारियम तापमान नियंत्रक (कैरोलिना पालतू आपूर्ति, Irmo, अनुसूचित जाति) में plugged है तार कर रहे हैं. एक वायर्ड इनक्यूबेटर बाड़े के polycarbonate विंडो में एक गैसकेट के माध्यम से रखा जांच आंतरिक परिवेश के तापमान का पता लगाता है और प्रतिरोधों के लिए वर्तमान प्रवाह को निर्धारित करता है. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर के साथ संयोजन के रूप में, प्रतिरोधों परिवेश तापमान नियंत्रण का एक जोड़ा उपाय प्रदान करते हैं.
  3. बंद सर्किट माहौल सिस्टम: 10% CO 2 / 90% हवा की एक निरंतर humidified और गर्म वातावरण प्रदान करने, इनक्यूबेटर मंच टॉप, Inlet और आउटलेट hoses (चित्रा 1 (मैं), एफ, जी) के माध्यम से जुड़ा हुआ है एक के लिए, मानक, पानी - तख्ताबंदीवाला टिशू कल्चर (; एच चित्रा 1 (मैं)); इनक्यूबेटर Forma वैज्ञानिक मॉडल 3154, थर्मो वैज्ञानिक, Inc, Asheville, नेकां). (चित्रा 1 मैं (); एफ) चरण शीर्ष इनक्यूबेटर, इनलेट नली को जोड़ने से पहले बस एक मानक मछलीघर पंप (, मैं, चित्रा 1 (मैं) Lifegard QuietOne मॉडल 1200, तैराकी Pentair, एल मोंटे, सीए) में चलाता है (, जम्मू, मैं चित्रा 1 () मॉडल 1150, Pelican उत्पाद, Inc, Torrance, सीए) है कि एक मोहरबंद ABS प्लास्टिक बॉक्स में संलग्न है के लिए एक बंद सर्किट बनाए रखने . इस पंप से टिशू कल्चर इनक्यूबेटर चरण टॉप इनक्यूबेटर के लिए सतत airflow को बढ़ावा देता है. कि पंप से चरण - शीर्ष इनक्यूबेटर कंपन के संचरण को कम करने का मफलर के रूप में कार्य करता है, पंप चरण के बाद, इनलेट नली 1500ml Erlenmeyer (कश्मीर चित्रा 1 (मैं )) फ्लास्क को चलाता है. एक आउटलेट नली (चित्र 1 (मैं); जी) मंच शीर्ष इनक्यूबेटर से टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (चित्रा 1 (मैं); एच) के लिए अग्रणी एक संलग्न कंप्यूटर प्रशंसक (चित्र 1 (मैं); एल) के साथ फिट है , है, जो पंप की तरह, यह भी निरंतर airflow को बढ़ावा देने के लिए इरादा है.
  4. PFTE 35 मिमी जीबीएम के लिए झिल्ली ढक्कन: पहले चरण इमेजिंग के लिए शीर्ष इनक्यूबेटर में neuronal संस्कृति रखने के लिए, 35 मिमी जीबीएम मुझे विशेष के साथ फिट हैmbrane ढक्कन (चित्रा 1 (द्वितीय, चतुर्थ), एम, शीर्ष सही में दिखाया विस्तार) गैस विनिमय की अनुमति के लिए और एक ही समय में मध्यम संस्कृति के वाष्पीकरण कम से कम. है कि एक में चले जाते हैं कि रिम पर बढ़ाया गया है और एक VITON गैसकेट के साथ जगह में आयोजित, इस ढक्कन delrin प्लास्टिक रिम और पूर्व में कटौती PFTE झिल्ली (अमेरिकी Durafilm कं, इंक, Holliston एमए Teflon) के एक पत्रक के होते हैं delrin प्लास्टिक रिम के पक्ष के साथ recessed चैनल.
  5. इंजेक्शन बंदरगाहों: इनक्यूबेटर मंच टॉप के polycarbonate विंडो (चित्रा 1 (द्वितीय), केन्द्र विस्तार, बी के पास पीले तीर) में दो छेद drilled थे. ये लगे थे के साथ स्टेनलेस स्टील हैमिल्टन सिरिंज दिए गए एक प्रयोग के दौरान 5-HT, डीए, विभिन्न रिसेप्टर agonists और गरम, और अन्य अभिकर्मकों प्रशासन के लिए इंजेक्शन बंदरगाहों प्रदान समाप्त होता है.

2. प्राथमिक hippocampal संस्कृति की तैयारी

काम के सभी या तो एक BSL2 लामिना का प्रवाह हुड में या एक लामिना का प्रवाह बेंच में किया जाता है. प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स मानक 6-7 प्रक्रियाओं के अनुसार E18 चूहा भ्रूण से अलग हैं, और सीरम मुक्त माध्यम है कि प्राथमिक cortical astrocytes द्वारा वातानुकूलित किया गया है में हो. Glial कोशिकाओं प्रकाशित 7 तरीकों के अनुसार तैयार हैं. वातानुकूलित मध्यम कम ग्लूकोज DMEM, प्रोलाइन के साथ पूरक (1.76 स्नातकीय / एमएल), asparagine (0.83 स्नातकीय / एमएल), विटामिन बी 12 (0.34 स्नातकीय / एमएल), ग्लूकोज (20mm), लिपिड युक्त BSA (0.5 मिलीग्राम / एमएल की होते हैं ) और B27 8-10 के 2% है . कोई एंटीबायोटिक दवाओं के माध्यम से जोड़ रहे हैं के रूप में वे neuronal जीन प्रतिलेखन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.

  1. (0.05 मिलीग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर) पाली-D-lysine, के साथ कवर एक 35 मिमी संस्कृति गिलास नीचे पकवान की केंद्रीय कांच coverslip भाग (जीबीएम) और 37 पर छोड़ दो घंटे के लिए खड़े डिग्री सेल्सियस पाली - डी lysine समाधान Aspirate, एक BSL2 लामिना का प्रवाह हुड में 20 मिनट के लिए सूखी अनुमति देते हैं. पाली - डी lysine-लेपित laminin (0.01 मिलीग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर) के साथ जीबीएम की coverslip हिस्से को कवर, और अतिरिक्त laminin समाधान को हटाने से पहले 40 मिनट की एक न्यूनतम के लिए छोड़ दें. 20 मिनट के लिए अलग निर्धारित करें.
  2. E18 चूहा भ्रूण के दिमाग से hippocampi टुकड़े करना, और के रूप में उन्हें 6 न्यूरोसाइंस में वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित अलग कर देना.
  3. जीबीएम प्रति 110.000 कोशिकाओं के घनत्व के लिए अनुमति देने के लिए मध्यम विकास में dissociated कोशिकाओं का पतला. GBMs तुम तैयारी हो जाएगा की संख्या के अनुसार अपने मास्टर मिश्रण में कोशिकाओं के लिए आवश्यक एकाग्रता की गणना.
  4. प्लेस 37 डिग्री सेल्सियस और 10% CO 2 / 90% हवा का माहौल मिश्रण के एक मशीन सेट अता तापमान में वरीय GBMs.
  5. तीन से पाँच दिनों के बाद, न्यूरॉन्स की बढ़ती शर्तों पर निर्भर करता है, जोड़ने के arabinoside सी (0.14 एनजी / एमएल) संस्कृतियों glial प्रसार को दबाने के लिए.
  6. संस्कृतियों lentivirus के साथ संक्रमण के पहले दो हफ्तों के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें. इस समय के दौरान, प्रत्येक जीबीएम में मध्यम की मात्रा का एक तिहाई हर तीन दिनों की जगह ताजा माध्यम के साथ. मीडिया की इस राशि से अधिक है, के रूप में इस आसमाटिक सदमे और कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं मत करो.

3. पुनः संयोजक lentivirus इनकोडिंग लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तैयारी

जांचकर्ताओं जो रीकॉम्बीनैंट lentiviruses के उत्पादन के लिए सुविधाओं तक पहुँच नहीं है के लिए, एक वाणिज्यिक इकाई जैसे सिस्टम बायोसाइंसेज (माउंटेन व्यू, सीए) द्वारा कस्टम उत्पादन एक विकल्प है.

एक mitochondrially - लक्षित लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन (MitoTurboRFP; Axxora LLC, सैन डिएगो, CA) cytomegalovirus प्रमुख तत्काल जल्दी जीन प्रमोटर 11 से बढ़ाने के transcriptional नियंत्रण के अधीन एक स्वयं निष्क्रिय रीकॉम्बीनैंट बिल्ली के समान इम्यूनो वायरस में डाला जाता है. पुनः संयोजक lentiviruses transiently 293T कोशिकाओं transfecting द्वारा उत्पादित कर रहे हैं.

  1. प्लेट ~ ७५००० कोशिकाओं / 2 सेमी, अगले दिन, सह transfect पुनः संयोजक वायरल सदिश, FIV झूठ बोलना और नीति जीन, और vesicular stomatitis वायरस जी ग्लाइकोप्रोटीन जीन एन्कोडिंग plasmids के साथ कोशिकाओं, के घनत्व 293T कोशिकाओं PolyJet (SignaGen का उपयोग प्रयोगशालाओं, Gaithersburg, एमडी). डीएनए (4.8 μg वायरल वेक्टर, 4.8 μg प्लाज्मिड gagpol, और 2.4 μg VSV प्लाज्मिड जी) के 12 स्नातकीय की कुल 293T कोशिकाओं के हर 10cm पकवान संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है.
  2. 24 घंटे के बाद, फिनोल लाल मुक्त हैंक्स संतुलित नमक समाधान के साथ संस्कृति मध्यम और धोने कोशिकाओं aspirate अवशिष्ट डीएनए निकालने के लिए. सीरम मुक्त तंत्रिका बेसल 50μg/ml लिपिड युक्त BSA और Glutamax के साथ पूरक मध्यम 10ml जोड़ें.
  3. अगले दिन, एक 0.2 माइक्रोन कम प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला फिल्टर, फसल और Vivaspin 20 polyethersulfone ultrafiltration इकाई (Sartorius, Concord, संयुक्त राज्य अमेरिका) को जोड़ने. क्रमिक रूप से 70% इथेनॉल, टिशू कल्चर ग्रेड पानी, और फॉस्फेट buffered खारा के साथ धोने Vivaspin इकाई द्वारा पूर्व का इलाज. ध्यान वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला ~ 1500xg पर 30 मिनट के लिए centrifugation द्वारा 50 गुना है. विभाज्य वायरस और तरल 2 एन में तैयारी की दुकान.
  4. केंद्रित वायरस के एक विभाज्य के साथ चूहे B104 कोशिकाओं को संक्रमित, और प्रवाह cytometry से 72 घंटे बाद फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा वायरस की राशि का अनुमान है. सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत प्राथमिक न्यूरॉन्स की एक निश्चित संख्या में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए की जरूरत केंद्रित वायरस के वायरस यानी मात्रा की राशि का एक अनुमान प्रदान करता है.

4. सभ्य न्यूरॉन्स के संक्रमण

Hippocampal न्यूरॉन संस्कृतियों इन विट्रो में 14 दिनों में बस वायरस की राशि सभी प्रवाह cytometry डेटा पर आधारित न्यूरॉन्स की 50% अप करने के लिए संक्रमित अनुमान जोड़कर संक्रमित हैं. नहीं polybrene प्रयोग किया जाता है. संस्कृतियों फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए जाँच से पहले 3 दिनों के लिए रखा जाता है. यदि संकेत भी कमजोर है, तो संस्कृति टिशू कल्चर इनक्यूबेटर और retested करने के लिए कई दिनों के बाद लौट रहा है.

5. बंद सर्किट लाइफ सपोर्ट सिस्टम के जनरल रखरखाव

  1. उचित नमी बनाए रखने के लिए, सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर पानी जैकेट समय - समय पर जाँच की है और भरा जब आवश्यक बनाने के. (गहरी 25mm) पानी और algicide की एक छोटी मात्रा युक्त इनक्यूबेटर अंदर एक स्टेनलेस स्टील या एल्यूमीनियम ट्रे जगह सुनिश्चित करें.
  2. जब आवश्यक हो, जलग्रहण ट्यूब से एकत्र पानी खाली करके स्पष्ट Inlet और इनक्यूबेटर माहौल सर्किट के आउटलेट hoses. समय समय पर, 70% इथेनॉल के साथ hoses फ्लश.

6. जीबीएम और स्टेज टॉप इनक्यूबेटर में नियुक्ति के लिए झिल्ली ढक्कन लागू

  1. चरण शीर्ष इनक्यूबेटर अंदर जीबीएम की नियुक्ति से पहले करने के लिए, झिल्ली से ढके एक टिशू कल्चर हुड में ढक्कन के साथ प्लास्टिक के ढक्कन की जगह. एक बार यह किया है, तो आप माइक्रोस्कोप को कवर जीबीएम स्थानांतरित कर सकते हैं.
  2. ध्यान सीट झिल्ली ढके इनक्यूबेटर मंच टॉप के आधार पर recessed खोलने में ढक्कन के साथ जीबीएम. जीबीएम jostling से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि आधार खुर्दबीन मंच पर जगह में पहले से ही है, चरण में कुछ कठिनाई के साथ आधार क्लिप के बाद से, यह सबसे अच्छा है जीबीएम जगह के बाद आधार स्थिति में है.
  3. इनक्यूबेटर बाड़े इनक्यूबेटर आधार पर स्टील पदों के साथ संरेखित करें और आधार पर बाड़े कम. Thumbscrews कस जब तक एक अच्छा सील बाड़े और बेस के बीच हासिल की है.

7. छवि अधिग्रहण

ध्यान दें कि उपलब्ध इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों के बहुमत सूक्ष्मदर्शी और संबंधित हार्डवेयर की एक विस्तृत श्रृंखला के पार तुलनीय कार्यक्षमता है. छवि के अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों की एक किस्म उपलब्ध हैं MetaMorph और माइक्रोस्कोप की विशिष्ट बनावट के लिए डिजाइन Leica अनुप्रयोग सूट, Nikon एनआईएस - तत्वों, और कार्ल Zeiss AxioVision जैसे कार्यक्रमों सहित. इस प्रोटोकॉल में, हम छवि अधिग्रहण और विश्लेषण प्रक्रियाओं हम Slidebook 5 (इंटेलिजेंट इमेजिंग नवाचार, डेनवर, सीओ) का उपयोग कर प्रदर्शन का वर्णन. हालांकि, इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रत्येक आपरेशन के घटक कदम आसानी से अन्य कार्यक्रमों की एक किस्म का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी, फिल्टर विन्यास, सीसीडी कैमरा, क्सीनन प्रकाश स्रोत, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का विवरण:

Hippocampal न्यूरॉन्स में mitochondrial परिवहन के गतिशील इमेजिंग के लिए, हम एक Leica DMI-6000B औंधा प्रतिदीप्ति खुर्दबीन और मॉडल 11-522-068 motorized मंच (Leica माइक्रोसिस्टम्स सीएमएस GmbH, Wetzlar, जर्मनी) एक कुक Sensicam EQ सीसीडी (कैमरा कुक के साथ फिट का उपयोग करें निगम, Romulus एमआई), Sutter Lambda 10-2 फिल्टर पहिया और नियंत्रक (Sutter साधन कंपनी, Novato, सीए), और एक Sutter महानिदेशक 4-300W क्सीनन प्रकाश स्रोत. Sedat चौकोर beamsplitter मॉडल 86100bs Leica डीएम श्रृंखला फिल्टर क्यूब, Chroma प्रौद्योगिकी के लिए फिट, कल्पना mitochondria MitoTurbo लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल, हम उत्तेजना और 600nm फिल्टर के लिए महानिदेशक चार प्रकाश स्रोत (चोटी पर एक 555nm फिल्टर के संयोजन का उपयोग करें कार्पोरेशन, खुर्दबीन और फिल्टर पहिया Falls, VT) और 617nm धौंकनी, क्रमशः उत्सर्जन के लिए.

छवि के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए, हम डिजिटल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सॉफ्टवेयर पैकेज 5 Slidebook उपयोग. यह एक व्यापक पैकेज है कि माइक्रोस्कोप, मंच, फिल्टर पहिया, कैमरा, और छवि के अधिग्रहण के दौरान प्रकाश स्रोत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण मॉड्यूल की एक किस्म के लिए पूरी तरह से स्वचालित नियंत्रण की अनुमति देता है.

नीचे, हम विशिष्ट, fluorescently लेबल 5 Slidebook का उपयोग न्यूरॉन्स में चलती mitochondria के समय चूक छवियों को प्राप्त करने के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करते हैं.

  1. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप, फिल्टर पहिया नियंत्रक, प्रकाश स्रोत, और सीसीडी कैमरा 5 Slidebook खोलने से पहले चालू किया गया है.
  2. Mitochondria के रहते इमेजिंग के लिए, एक 63X उद्देश्य तेल विसर्जन पर स्विच करने के उद्देश्य बुर्ज पर्याप्त कम खुर्दबीन मंच से नीचे उद्देश्य के लिए पहुँच प्रदान (और मंचइनक्यूबेटर ऊपर), और ध्यान से तेल का उद्देश्य सतह पर सीधे लागू है. Slidebook उपकरण पट्टी पर 'फोकस विंडो' आइकन पर क्लिक करके ध्यान विंडो खोलें. ध्यान केंद्रित विंडो में, एक उपयुक्त स्तर brightfield तीव्रता को समायोजित करने के लिए एक स्लाइडर 'दीपक' लेबल फिसलने द्वारा brightfield दीपक पर बारी. कक्षों की एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित मोल और ब्याज की एक सेल लगता है.
  3. 'घेरा' टैब के अंतर्गत, 'CY3 fluor' का चयन करें. Oculars फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत, का उपयोग कोशिकाओं है कि Mito TurbRed प्रोटीन के साथ चिह्नित किया गया है में mitochondria के लिए ध्यान केंद्रित करने के विमान को खोजने के. एक बार जब आप oculars के माध्यम से ध्यान केंद्रित प्राप्त कर लिया है, सीसीडी कैमरा स्विच और यदि आवश्यक हो तो फिर अधिग्रहण ध्यान केंद्रित.
  4. Slidebook उपकरण पट्टी पर 'छवि कैप्चर' आइकन पर क्लिक करके छवि पर कब्जा विंडो खोलें. 100ms के एक प्रारंभिक जोखिम समय के साथ शुरू, इष्टतम जोखिम समय लगता है 'टेस्ट' और बटन 'के लिए सर्वश्रेष्ठ खोजें' का उपयोग कर, वैकल्पिक रूप से, आप 'एक बार' बटन का उपयोग कर सकते हैं. याद रखें कि जोखिम के समय पर्याप्त पूरी छवि क्षेत्र भर में फैल तीव्रता प्रदान करना चाहिए (जैसे, 0-2500, छवि पर कब्जा खिड़की के नीचे पर हिस्टोग्राम द्वारा इंगित) एक न्यूनतम अवधि के भीतर (उदाहरण के लिए, 200-800ms).
  5. इससे पहले कि समय चूक छवि अधिग्रहण शुरू, अभी भी छवि पर कब्जा खिड़की के भीतर 'उन्नत' टैब पर क्लिक करके 'उन्नत' विंडो खोलने. 'फोकस' टैब का पता लगाएं, time-lapse/multipoint कब्जा 'विकल्प के दौरान' Autofous 'की जांच, और समय चूक की छवि अधिग्रहण के लिए autofocus सेटिंग समायोजित. आम तौर पर, हम autofocus के लिए निम्न पैरामीटर का उपयोग करें: अद्यतन हर 2-3 फ्रेम ध्यान केंद्रित; चयन autofocus चैनल इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता fluor mitochondria, यानी, CY3 लेबल, कुल खोज रेंज 63x बढ़ाई के लिए 2 उम.
  6. 'कैद' विंडो में, 'कैद प्रकार' बॉक्स के अंतर्गत, 'timelapse' विकल्प की जाँच करें और 'timelapse कैद' विकल्प के तहत वांछित इमेजिंग और इमेजिंग सत्र के अंतराल की अवधि का चयन करें. हमारे mitochondrial परिवहन पर neuromodulators के प्रभाव के अध्ययन में समय व्यतीत इमेजिंग एक घंटे के सत्र में कुल 360 छवियों का एक छवियों के बीच 10 सेकंड अंतराल पर हासिल किया गया में प्रदर्शन किया गया था.
  7. नीचे, सही पक्ष में 'कैद' विंडो के 'प्रारंभ' बटन पर क्लिक करके समय चूक छवि अधिग्रहण शुरू करो.
  8. प्रारंभिक, या नियंत्रण, इमेजिंग सत्र के बाद, चरण टॉप इनक्यूबेटर के शीर्ष बंदरगाहों के माध्यम से न्यूरोट्रांसमीटर और अन्य अभिकर्मकों प्रशासन और एक नया इमेजिंग सत्र शुरू.

8. छवि विश्लेषण

  1. छवि पिछले इमेजिंग सत्र के बाद सहेजी गई फ़ाइल खोलें.
  2. व्यक्तिगत mitochondria समय चूक छवि श्रृंखला में लेबल किया जा सकता है या तो स्वत: या मैन्युअल मास्किंग 5 Slidebook में प्रदान कार्यों को रोजगार.
  3. 'मास्क' मेनू के तहत, मेनू पट्टी से 'खंड' का चयन करें. 'हिस्टोग्राम उपकरण के निम्न और उच्च दहलीज लाइन फिसलने, पूरी छवि में नीले रंग में सभी कणों मास्किंग, सभी प्रक्रिया में निहित mitochondria कवर, लेकिन असतत कणों के रूप में संभव के रूप में छोड़ने के. पूरी छवि श्रृंखला के लिए मुखौटा लागू.
  4. एक दूसरे ('मास्क' मेनू के तहत, चुनें 'बनाएँ') मुखौटा है कि ब्याज की प्रक्रिया में जो कण पिछले मुखौटा द्वारा डाला गया है के लिए छोड़कर पूरी छवि को शामिल किया गया बनाएँ. इस निपुण, बड़ी से बड़ी 'पेंसिल' उपकरण का उपयोग प्रक्रिया के बाहर क्षेत्रों की सीमाओं का पता लगाने, और तब, 'पेंट बाल्टी' घिरा क्षेत्रों में भरने के उपकरण का उपयोग करके पहला, है. पूरी छवि श्रृंखला के लिए इस मुखौटा लागू.
  5. के तहत 'मास्क' चुनें 'मास्क संचालन' और 'शून्य' आपरेशन, अर्थात् प्रदर्शन, दूसरा मुखौटा मुट्ठी मुखौटा (प्रक्रिया को छोड़कर पूरे छवि) से subtracted है. एक तीसरा मुखौटा उत्पन्न हो सकता है जिसमें केवल ब्याज की प्रक्रिया पर प्रकाश डाला है. ध्यान दें कि इस नया मुखौटा पूरी छवि श्रृंखला को लागू किया जाएगा.
  6. के तहत 'एनोटेशन,' चुनें 'ऑब्जेक्ट आईडी.'
  7. सत्यापित करें निरंतरता और व्यक्ति की संख्यात्मक कार्य मैन्युअल रूप से छवि श्रृंखला की समीक्षा द्वारा mitochondria नकाबपोश (5 Slidebook, खेलते हैं, 'आगे फ्रेम में,' और 'रिवर्स फ्रेम,' बटन छवि खिड़की के नीचे इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है).
  8. मेनू पट्टी पर 'मास्क' टैब का चयन करें. के तहत चुनें 'के कण ट्रैकिंग' और 'चलाने के मूल कण ट्रैकिंग' मास्क '' पथ सांख्यिकी, 'प्रत्येक नकाबपोश mitochondrion के लिए केन्द्रक के निर्देशांक सहित उत्पन्न करने के लिए.
  9. दो आसन्न छवि फ्रेम के बीच प्रत्येक mitochondrion द्वारा कूच दूरी प्रत्येक फ्रेम में प्रत्येक कण के निर्देशांक से गणना की है.
  10. Mitochondrial आंदोलन पर neuromodulators के प्रभाव के हमारे पिछले अध्ययनों में, हम mitochondria की तीन अलग आबादियों की पहचान की: 'स्थिर' oscillatory, 'और' directionally चलती यदि एक mitochondrion कम से कम 0.2 उम (या 2 पिक्सल 63X आवर्धन के तहत, 1 पिक्सेल = ०.१०,२३५ उम) यात्रा एक घंटे के भीतर, यह विशेषता के रूप में है 'स्थिर है.' यदि एक mitochondrion 0.2 कम से कम उम, लेकिन कम से कम 2 चालें.5 उम, एक अग्रगामी - प्रतिगामी चक्र में, यह के रूप में परिभाषित किया गया है 'oscillatory.' अंत में, यदि एक दिशा में अधिक से अधिक 2.5 उम के mitochondrion शुद्ध दूरी की यात्रा है, यह के रूप में directionally चलती वर्गीकृत है. चित्रा 2 में चित्रित एक प्रतिनिधि प्रयोग है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक पाई चार्ट दिखा mitochondria की तीन अलग - अलग आबादी के प्रतिशत वितरण में सभी लेबल mitochondria के आंदोलन दिखा हिस्टोग्राम है .
  11. प्रत्येक mitochondrion की औसत गति दी इमेजिंग सत्र के दौरान कुल कूच दूरी के अनुसार गणना की है. एक mitochondrial जनसंख्या का मतलब गति व्यक्तिगत गति जोड़ने और mitochondria ट्रैक किए गए की कुल संख्या से विभाजित करके गणना की है.
  12. Kymographs एक Slidebook 5 में प्रदान मॉड्यूल का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है. 'मास्क' समारोह का उपयोग करना, किसी दिये गये प्रक्रिया (जैसे अक्षतंतु) के पूरे हद तक भर में एक पतली रेखा खींचना, कई mitochondrial centroids के रूप में के माध्यम से संभव के रूप में पारित करने के लिए सुनिश्चित हो. मेनू पट्टी का चयन करें और 'मास्क' टैब पर जाओ और 'उन्नत संचालन,' तो 'चिकना वक्र विश्लेषण. चिकनी वक्र विश्लेषण के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग करें या अनुकूलित के रूप में वांछित. चिकनी वक्र विश्लेषण मॉड्यूल चलाएँ. विश्लेषण के अंत में, इमेजिंग सत्र के एक kymograph प्रदर्शित किया जाएगा.
  13. मेनू पट्टी पर जाएँ और चुनें 'देखें,' और फिर 'झगड़ा निर्यात.
  14. ग्रेस्केल बचाया tif फ़ोटोशॉप में kymograph युक्त फ़ाइल या एक तुलनीय छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम खोलें और औंधा के लिए छवि परिवर्तित.

9. प्रतिनिधि परिणाम

ट्रैकिंग और सुसंस्कृत hippocampal न्यूरॉन्स में mitochondrial आंदोलन का विश्लेषण करके, हम neuromodulation और mitochondrial तस्करी के बीच एक कड़ी का प्रदर्शन किया है. विशेष रूप से, हम है कि सेरोटोनिन (5-HT) या 5-HT1A रिसेप्टर agonist, 8-OH-DPAT पाया, mitochondrial आंदोलन (2A - सी चित्रा) 8, उत्तेजित करता है जबकि डोपामाइन (डीए) या ​​D2 रिसेप्टर agonist, bromocriptine, रोकता mitochondrial आंदोलन (चित्रा 2 डी जी) 9.

चित्रा 1
चित्रा 1. क्लोज सर्किट मंच टॉप इनक्यूबेटर प्रणाली के डिजाइन इनक्यूबेटर प्रणाली के निम्नलिखित घटकों से पता चला रहे हैं: गर्मी प्रतिरोधी delrin प्लास्टिक संलग्नक (ए), आयताकार खोलने के लिए polycarbonate प्लास्टिक विंडो (बी); इनक्यूबेटर (सी) के एल्यूमीनियम आधार ; छेद. आधार (डी) के स्टील पोस्ट को स्वीकार करने के लिए, इनक्यूबेटर आधार के केंद्र में 35.1mm पतली recessed होंठ के साथ व्यास छेद करने के लिए 35 मिमी जीबीएम व्यंजन (ई) को समायोजित, Nalgene hoses (टिशू कल्चर और चरण - शीर्ष इन्क्यूबेटरों के बीच कनेक्शन, नमी जाल) ( एफ, जी, एन), टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (एच), मछलीघर पंप (मैं), हवा तंग ABS प्लास्टिक बॉक्स (मछलीघर पंप के लिए आवास) (जे), 2000ml Erlenmeyer (फ्लास्क पहले चरण शीर्ष नली में कंपन दमन के लिए मफलर इनक्यूबेटर) (कश्मीर), प्लास्टिक संलग्नक शीतलन प्रशंसक (एल) के लिए, 35 मिमी जीबीएम ढकने के लिए प्लास्टिक फ्रेम (एम), प्लास्टिक stopcocks की स्थिति (का.). अभिकर्मकों के प्रशासन के लिए बंदरगाहों का स्थान (द्वितीय) में पीले तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि परिणाम. Mitochondrial परिवहनके नियमन: एक विशिष्ट संस्कृति में चूहे hippocampal न्यूरॉन अक्षतंतु. एक lentivirus इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल Mitochondria हरे रंग में दिखाए जाते हैं, phospho - neurofilament एंटीबॉडी के साथ immunolabeled axons लाल रंग में दिखाया जाता है. अक्षतंतु का विस्तार पीले arrowheads ने संकेत दिया है. चार अतिव्यापी micrographs की छवि बना है. छवि समय चूक 5-HT के प्रशासन के बाद mitochondrial आंदोलन में परिवर्तन दिखा श्रृंखला बी उदाहरण. छवियाँ एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के माध्यम से हासिल किया गया और दृश्यों कि बाद में QuickTime चलचित्र के लिए बदल रहे थे के रूप में संग्रहीत. छवियाँ का एक प्रतिनिधि अनुक्रम से पता चलता है पहले अलग अलग समय अंक (बाएं पैनल) और 8-OH-DPAT, एक 5-HT1A रिसेप्टर agonist (सही पैनल) के बाद प्रशासन में mitochondria व्यक्तिगत. कार्यक्षेत्र लाल आयत एक स्थिर mitochondrion (बाएं) और एकाधिक समय अंक से अधिक एक oscillatory mitochondrion (दाएं) पर प्रकाश डाला गया. oscillatory संकेत (बाएं पैनल) mitochondrion 8-OH DPAT (, लाल bordered सफेद arrowheads को सही पैनल) के साथ उपचार के बाद अक्षतंतु टर्मिनल की ओर बढ़ रहा है. ऊर्ध्वाधर पीले लाइन (सही पैनल) चलती mitochondrion के शुरू करने की स्थिति को इंगित करता है. समय अंतराल प्रत्येक फ्रेम के निचले दाएँ हाथ के कोने में दिखाए जाते हैं. आवर्धन (63 ×) सही पैनल के निचले सही कोने में संकेत दिया है. सी, डी 5-HT के प्रशासन के बाद mitochondrial आंदोलन में परिवर्तन दिखा भूखंड. पहले mitochondrial आंदोलन में परिवर्तन (सी) और (डी) 5-HT के प्रशासन के वेग के भूखंडों (एक्स अक्ष) बनाम अक्षतंतु (y अक्ष) के साथ व्यक्तिगत mitochondria की प्रारंभिक पदों के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं के बाद. वेग और स्थिर (लाल), oscillatory (नीला), और directionally चलती मीटर (हरा) के अनुपातitochondria भूखंडों और पाइ चार्ट (भूखंडों ऊपर insets), क्रमशः में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. लाल बिंदीदार लाइनों कार्टून अक्षतंतु प्रकाश डाला क्षेत्रों से प्रत्येक प्लाट के Y-अक्ष के लिए पेश अनुमानित स्थान और अक्षतंतु खंड है कि imaged था हद से संकेत मिलता है. ई, एफ डीए के प्रशासन के बाद mitochondrial आंदोलन में परिवर्तन दिखा भूखंड. Mitochondrial आंदोलन में पहले परिवर्तन (ई) और (एफ) महंगाई भत्ते की प्रशासन वेग के भूखंडों (एक्स अक्ष) बनाम अक्षतंतु (y अक्ष) के साथ व्यक्तिगत mitochondria की प्रारंभिक पदों के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं के बाद. वेग और के अनुपात स्थिर (लाल), oscillatory (नीला), और directionally चलती है (हरा) भूखंडों और पाइ चार्ट (भूखंडों ऊपर insets) में mitochondria प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, क्रमशः. लाल बिंदीदार लाइनों कार्टून अक्षतंतु प्रकाश डाला क्षेत्रों से प्रत्येक प्लाट के Y-अक्ष के लिए पेश अनुमानित स्थान और अक्षतंतु खंड है कि imaged था हद से संकेत मिलता है. जी, एच. प्रतिनिधि एक सुसंस्कृत न्यूरॉन में पहले mitochondrial आंदोलन दिखा kymographs (जी) और बाद में (एच) D1R रिसेप्टर agonist, bromocriptine के प्रशासन. न्यूरॉन एक घंटे के लिए (जी) और bromocriptine के एक घंटे के बाद प्रशासन (एच) से पहले imaged किया गया था.

Discussion

रोजगार संक्रमित सभ्य न्यूरॉन्स में mitochondria के लिए लक्षित एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति lentivirus की मध्यस्थता और एक सस्ती निर्मित प्रयोगशाला मंच शीर्ष इनक्यूबेटर कि विस्तारित durations के लिए जीवित कोशिकाओं के इमेजिंग की अनुमति देता है, हम mitochondrial आंदोलन और neuromodulatory संकेतों के बीच की कड़ी जांच करने में सक्षम किया गया है , (5 हिंदुस्तान टाइम्स) सेरोटोनिन, डोपामाइन (डीए), और (ACH) acetylcholine जैसे. कि तंत्रिका समारोह के दिल में हैं - हमारे अध्ययन के लिए एक संकेतन मार्ग है कि पहली बार के लिए, 5-HT और डीए जैसे न्यूरोट्रांसमीटर द्वारा न्यूरॉन्स संग्राहक की गतिविधि में परिवर्तन करने के लिए mitochondrial तस्करी लिंक को स्पष्ट करने में मदद मिली है. हम पाते हैं कि लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग mitochondria की विस्तारित अवधि है कि बहुत कम durations के कि संभव हो रहे हैं महत्वपूर्ण रंगों का उपयोग की तुलना में अधिक प्रासंगिक physiologically हो सकता है पर सभ्य न्यूरॉन्स में रहने वाले लेबल अवलोकन परमिट. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन संकेत की तीव्रता हमें जोखिम बार छवि अधिग्रहण के दौरान कम रखने के लिए अनुमति देता है, photobleaching या phototoxicity की संभावना कम है. अंत में, एक सरल और सस्ती मंच शीर्ष मशीन, परिवेश तापमान, नमी, और सीओ 2 के स्तर बनाए रखता है, जबकि मीडिया के वाष्पीकरण कम से कम हमें घंटे या दिन से अधिक रहने वाले न्यूरॉन्स में mitochondrial आंदोलन का पालन करने के लिए अनुमति देता है. शोधकर्ताओं ने mitochondria की लंबी अवधि टिप्पणियों के लिए जी न्यूरॉन्स में एक मंच टॉप इनक्यूबेटर बनाना चाहते हैं हमारे डिजाइन के सटीक विवरण प्रदान का पालन की जरूरत नहीं है कि (जैसे, गैस पारगम्य झिल्ली का इस्तेमाल मीडिया के वाष्पीकरण से बचने के सामग्री के गुणों ) और लागू (जैसे, तापमान और आर्द्रता नियंत्रण, osmolarity के पीएच रखरखाव, बफरन) सिद्धांतों को आम तौर पर क्या इस प्रोटोकॉल में वर्णित है के साथ संगत कर रहे हैं.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम और चरण - शीर्ष इनक्यूबेटर के डिजाइन और निर्माण के दौरान अपनी तकनीकी विशेषज्ञता और महान कौशल के योगदान के लिए डोनाल्ड Hutson धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Ayda Dashtaei के लिए आभारी हैं. सभी काम न्यूरोसाइंसेस रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(1) Tissue culture incubator (H)
(1) Heat-resistant plastic enclosure (A) (delrin or comparable)
(1) Plastic frame for 35mm GBM lid (M) (for affixing membrane to petri dish)
(1-2) linear ft. Clear PFTE (Teflon) membrane material
(4) Brass thumb screws
(2) Small 10kOhm heatsink resistors used as heating elements inside stage-top incubator enclosure
(1) Transformer supply of 9V current to resistors
(1) Terrarium temperature controller and probe thermostatic regulation of power to heatsink resistors via transformer
(1) 2000ml Erlenmeyer flask (K) muffler for vibration suppression in hose before stage-top incubator
(1) 1/8" sorbothane sheet gasket material for base of stage-top incubator
(1) Airtight ABS (or comparable) plastic box (J) housing for aquarium pump
(1) Aquarium pump (I)
(1) Small computer cooling fan
(1) Plastic enclosure for cooling fan (L)
(1) 9V transformer for computer cooling fan
(20-30ft) Nalgene or silicone hose (F,G,N) connections between tissue culture and stage-top incubators; moisture traps
(2) Plastic stopcocks (O) to open and close air flow before and after stage-top incubator
(4) Barbed brass hose connectors for hose connections to/from stage-top incubator and aquarium pump enclosure
(2) Brass quick couplers for hose connections to/from stage-top incubator
(2) Brass quick couplers for hose connections to/from stage-top incubator
Table 1. Stage-top incubator parts:
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P7280-5MG
laminin Roche Group 11243217001
35 mm glass-bottom dishes MatTek Corp. P35GC-0-14-C
DMEM Life Technologies 10567
B27 Life Technologies 17504-044
Glutamax Life Technologies 35050
Lipid-rich BSA Life Technologies 11020-021
L-Asparagine Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Proline Sigma-Aldrich A8381-100G
Vitamin B-12 Sigma-Aldrich V2876-100MG
5-HT Sigma-Aldrich H9523-25MG
8-OH-DPAT Sigma-Aldrich H8520-25MG
Dopamine Sigma-Aldrich H8502-5G
Bromocriptine Sigma-Aldrich B2134-25MG
SKF38393 Sigma-Aldrich D047-100MG

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References

  1. Ligon, L. A., Steward, O. Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons. J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).
  2. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria. J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).
  3. Macaskill, A. F. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  4. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).
  5. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  6. Crawley, J. N. Current protocols in neuroscience. , J. Wiley. (1999).
  7. Fedoroff, S., Richardson, A. Protocols for neural cell culture. , 3rd edn, Humana Press. (2001).
  8. Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons. Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).
  9. Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons. PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).
  10. Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. , e10848-e10848 (2010).
  11. Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors. Mol Ther. 1, 31-38 (2000).

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तंत्रिका विज्ञान 52 अंक Mitochondria परिवहन Neuromodulation hippocampal न्यूरॉन serotonin dopamine प्रतिदीप्ति समय व्यतीत हो लाइव इमेजिंग स्टेज टॉप इनक्यूबेटर
Neuromodulation और Mitochondrial परिवहन: लंबे durations पर hippocampal न्यूरॉन्स में लाइव इमेजिंग
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Edelman, D. B., Owens, G. C., Chen,More

Edelman, D. B., Owens, G. C., Chen, S. Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations. J. Vis. Exp. (52), e2599, doi:10.3791/2599 (2011).

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