Summary
Niet-fouling PEG silaan monolaag werd gedesorbeerd uit individueel adresseerbare ITO elektroden op glas door toepassing van een reductieve potentieel. Elektrochemische strippen van de PEG-silaan laag van ITO-micro-elektroden toegestaan voor celadhesie te laten plaatsvinden in een ruimtelijk bepaalde manier, met cellulaire patronen overeenkomt nauw aan bij elektrode patronen.
Abstract
De mogelijkheid om precieze ruimtelijke en temporele controle over de cel-oppervlakte interacties oefening is een belangrijke voorwaarde voor de montage van multi-cellulaire constructies dienen als in-vitro nabootst van inheemse weefsels. In deze studie werden de fotolithografie en nat etsen technieken die gebruikt worden om individueel adresseerbare indium tin oxide (ITO) elektroden fabriceren op glas substraten. De glazen substraten met ITO micro-elektroden werden gemodificeerd met poly (ethyleenglycol) (PEG) silaan om ze eiwitten en cellen weerstand. De aanwezigheid van isolerende PEG moleculen op het elektrode-oppervlak werd geverifieerd door cyclische voltammetrie gebruik kaliumferricyanide als een redox reporter molecuul. Belangrijk is dat de toepassing van de reductieve potentiële veroorzaakt desorptie van de PEG-laag, wat resulteert in de regeneratie van de geleidende elektrode-oppervlak en het uiterlijk van typische ferricyanide redox pieken. Toepassing van reductieve potentiële ook overeen met het schakelen van ITO elektrode eigenschappen van cel non-lijm aan op cel-lijm. Elektrochemische strippen van de PEG-silaan laag van ITO-micro-elektroden toegestaan voor celadhesie te laten plaatsvinden in een ruimtelijk bepaalde manier, met cellulaire patronen overeenkomt nauw aan bij elektrode patronen. Micropatterning van verschillende celtypen werd gedemonstreerd op deze substraten. In de toekomst zal de controle van de biointerfacial eigenschappen wordt geboden door deze methode toe om de cellulaire micromilieus ingenieur door de assemblage van drie of meer celtypen in een nauwkeurige geometrische configuratie op een optisch transparant substraat.
Protocol
Deel I: patroonvorming van de elektroden
- Schoon en uitgedroogd ITO gecoat glas dia's werden bekleed met positieve fotolak
- Het oppervlak werd gebakken bij 100 ° C om oplosmiddelen te verwijderen uit het weerstaan
- Na het bakken, was het oppervlak blootgesteld aan ultraviolet licht door een masker met behulp van de Canon Mask Aligner
- De blootgestelde regio's werden verwijderd in een ontwikkelaar oplossing
- Het oppervlak is hard gebakken om alle resterende ontwikkelaar oplossing te verwijderen
- Het ITO regio's die niet beschermd door fotolak patronen zijn geëtst weg in een zuur etsmiddel
- Resterende fotolak werd verwijderd door sonicating in aceton op de ITO elektroden formulier
Deel II: Oppervlakte wijziging
- Aangepaste elektroden worden gereinigd in een plasma kamer en gemodificeerd met 2% PEG silaan in tolueen. Incubatie wordt uitgevoerd voor 2 uur, gevolgd door 2 uur bakken.
Opmerking: Dit proces wordt uitgevoerd in een handschoen zak gevuld met stikstof om de aanwezigheid van vocht te vermijden, zoals PEG silaan is reactief naar toe.
Deel III: Elektrochemie
- Stalen draden zijn verbonden met elektroden.
- De PEG silaan gemodificeerde elektroden worden geplaatst in een elektrochemische cel voor elektrochemische experimenten uit te voeren.
- PEG silaan van geïnterconnecteerde regio's is ontdaan met behulp van een drie-elektrode systeem in PBS.
Deel IV: Cel patroon
- Fibroblasten worden geïncubeerd met de onlangs gestript substraten. Na incubatie, deze cellen hechten aan de PEG silaan gestripte regio's, maar de cellen nergens anders binden op het oppervlak.
- Patroon cellen zijn geïncubeerd in vers medium en gevisualiseerd met behulp van een microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video, hebben we aangetoond dat de cel patronen op de optisch transparante indium tin oxide elektrodes. Na het vervaardigen van het ITO-elektroden met behulp van fotolithografie, werden ze bewerkt met een cel-resistieve monolaag van PEG silaan. Deze monolaag werd gedesorbeerd met behulp van elektrochemie het inschakelen van de oppervlakte van cel tot cel-resistieve-lijm. Patroonvorming van de 3T3 muis fibroblasten is aangetoond in zijn video. We hebben ook patronen hepatocyten, primaire cellen en stellaatcellen gebruikmaking van dezelfde techniek. Daarnaast, door het maken van meerdere afzonderlijke elektroden, kunnen breiden we deze techniek om meerdere celtypen te monteren. Bovendien, door het beheersen van de geometrie van het ontwerp, kunnen de cellen ruimtelijk en tijdelijk geïsoleerd op het oppervlak.
Fotolithografie en natte etstechnieken zijn standaard microfabricage processen. Elektrochemie is vaak bestudeerd op goud oppervlakken, maar niet zo veel op ITO. Afgezien van de geleidbaarheid, ITO biedt ook voordeel van transparantie. Door het gebruik van ITO, kunnen de monsters worden gevisualiseerd met behulp van een eenvoudige omgekeerde microscoop. De techniek die in deze video kan worden gebruikt om elk celtype monteren op het oppervlak in een nauwkeurig geometrisch patroon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Indium Tin Oxide | Other | Delta Technologies | CB 40IN | |
| PEG silane | Reagent | Gelest Inc. | SIM6492.66 | |
| Hydrochloric Acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Nitric Acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 258121 | |
| Ethanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Acetone | Reagent | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Toluene | Reagent | Sigma-Aldrich | 34866 | |
| Media | Reagent | Invitrogen | ||
| Collagen | Reagent | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| 3T3 murine Fibroblasts | Cell Line | ATCC |
References
- Lee, J. Y., Jones, C., Zern, M. A., Revzin, A. Analysis of Local Tissue-Specific Gene Expression in Cellular Micropatterns. Analytical Chemistry. 78, 8305-8312 (2006).
