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Neuroscience

Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

Published: June 3, 2011 doi: 10.3791/2600

Summary

C'est un protocole pour préparer et maintenir une préparation de tranches de néocortex culture organotypique dans le but de réaliser des enregistrements électriques des neurones pyramidaux.

Abstract

Nous avons étudié les rôles d'expression et fonctionnelles des canaux voltage-dépendants de potassium dans les neurones pyramidaux du néocortex de rat. En raison de l'absence d'agents pharmacologiques spécifiques pour ces canaux, nous avons pris une approche génétique de la manipulation de l'expression des canaux. Nous utilisons une préparation culture organotypique (16) afin de maintenir la morphologie cellulaire et le modèle laminaire du cortex. En général, nous isoler aiguë tranches néocorticales à 8-10 jours post-natal et de maintenir les tranches en culture pendant 3-7 jours. Cela nous permet d'étudier les neurones à un âge similaire à ceux de notre travail avec des tranches aiguës et minimise le développement des connexions excitatrices exubérante dans la tranche. Nous enregistrons d'identifier visuellement les neurones pyramidaux des couches II / III ou V à l'aide d'éclairage infrarouge (IR-) et microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) avec pince de cellules de patch tout en courant ou voltage-clamp. Nous utilisons biolistique (canon à gènes) transfection de type sauvage ou mutante ADN canal potassique de manipuler l'expression des canaux d'étudier leur fonction. Les cellules transfectées sont facilement identifiables par microscopie à épifluorescence après co-transfection avec l'ADNc pour la protéine fluorescente verte (GFP). Nous comparons les enregistrements de cellules transfectées à proximité, les neurones non transfectées dans la même couche de la même tranche.

Protocol

1. Préparatifs avant le Jour de tranchage

Nous trouvons qu'il est plus efficace de l'autoclave des instruments chirurgicaux et préparer des solutions avant le jour de trancher.

  1. Instruments autoclave. (La chirurgie et le tranchage sont réalisées sous des conditions semi-stériles). Autoclaver les paquets suivants, emballés individuellement dans du papier autoclave:
    • Forfait Chirurgie: spatule, n ° 22 porte-lame de scalpel, ciseaux, pinces
    • Forfait tranchage: 3 boutons (lame en empoignant la molette et 2 boutons de bain sécurisation) et protège-lame (lame de rasoir, tient à partir trancheuse: Campden Vibroslice, # MA572), enveloppées individuellement (car il sera mis dans le congélateur) fait sur ​​mesure chambre métallique ( spécimen de bain) pour la trancheuse (plexiglas du fabricant on ne va pas résister à l'autoclavage répété), hémostatique, ciseaux, pinces.
    • Forfait Verrerie: deux béchers de 50 mL et un bécher 25 mL
  2. Cheval Aliquoter sérum (Hyclone donateurs équine # SH 30074: Thermoscientic). Aliquoter ~ 11 ml de sérum de cheval en 15 ml tubes coniques. (10 ml de sérum est nécessaire. Parce que des bulles se forment lorsque le sérum est décongelé, il vous faut 11 ml à partir de laquelle doit aspirer le 10 ml). Boutique aliquotés sérum dans un congélateur à -20 ° C.
  3. Les médias Aliquot. Après les bouteilles sont ouvertes les médias, ils ne sont stables que pour ~ 4 semaines (en raison de changements de pH). Les tranches survivent mieux aux milieux frais.
    • Nous utilisons trois types de médias disponibles dans le commerce (achetée en bouteilles de 500 ml), ainsi que du sérum de cheval. Les médias sont les suivants: HMEM (Lonza Biowhittaker Minimal Médias Essentiel Plus HBSS et HEPES, sans glutamine: Catalogue # 12-137f), HBSS (GIBCO Hanks saline tamponnée, # 24020-117) et MEM (Gibco milieu minimal essentiel, # 12360 - 038). Voir le tableau 2.
    • Pour chacun des trois types de médias (HMEM, HBSS, et MEM), partie aliquote ~ 50 ml d'une bouteille de 500 ml de support dans chacun des quatre tubes de 50 ml conique. Parafilm tous les tubes après aliquotage. Magasin de MEM dans le réfrigérateur, et de stocker et de HMEM HBSS à température ambiante.
    • Les milieux de culture se compose d'un mélange de sérum de cheval, HMEM et HBSS (voir ci-dessous, le tableau 2). MEM est utilisé comme support de lavage.
  4. Faire solution de découpe (tableau 3). La solution de coupe est composée de (en mM): NaCl 125, KCl 3, NaH 2 PO 4 1,25, NaHCO 3 26, 2 mM de CaCl2, MgCl2 2 mM, et 20 mM de glucose. Nous font généralement 250 ml (apporter au volume dans fiole jaugée). Vérifiez osmolalité (devrait être ~ 310) et le pH (7.2 à 7.3).

Les étapes subséquentes (# 2 et # 3) sont effectués le jour de trancher.

2. Chirurgie, tranchage, et de la culture organotypique

Il est important d'effectuer la chirurgie dans un endroit séparé vs toutes les autres procédures. Nous utilisons un vide (fumées) capot pour la chirurgie pour enlever le cerveau. Une hotte à flux laminaire est utilisée pour des opérations effectuées dans des conditions semi-stériles, telles que le tranchage et les manipulations des tranches et des solutions.

  1. Préparer des solutions. (Ces procédures ne doivent pas être effectuées dans des conditions stériles que les solutions seront filtrés dans une étape ultérieure.).
    1. Préparer la solution de découpe (tableau 3). Bubble la solution avec un mélange de 95% d'O 2 / 5% CO 2 pendant au moins 20 minutes (pour stabiliser le pH et s'assurer que tous les sels sont en solution). Ajouter 1 mM d'acide pyruvique (inhibiteur métabolique) and0.6 ascorbate mM (antioxydant).
    2. Dégeler une aliquote de sérum de cheval (11 ml).
  2. Préparer hotte à flux laminaire (porter des gants pour toutes les procédures, saturer les gants avec de l'EtOH). Dans cette section, nous préparons la zone de travail pour fournir un environnement propre, l'espace de travail semi-stérile. Nous allons également filtrer les solutions pour les stériliser.
    1. Utiliser la lumière UV pour ~ 1 heure pour stériliser l'espace de travail au sein de la hotte à flux laminaire (lumière UV peut endommager les pièces en plastique de sorte que nous couvrons theCampden Vibroslice nous utilisons pour le tranchage, voir ci-dessous). Nettoyez toutes les surfaces avec 70% EtOH (sauf les boutons en plastique de trancheuse: EtOH sera dommage). Aussi généralement présents sous la hotte à flux laminaire sont les pipetteur et pipettes, bouteilles EtOH, colle, et le tube relié à 95% O 2 / 5% de CO 2 et O 2 100.
    2. Placez ce qui suit sous hotte à flux laminaire:
      • Autoclavés forfait tranchage
      • 250 ml de solution de découpe
      • Millipore Express Plus de filtre: 250 ml [filtre de 0,2 um (# SC6PU02RE) pour filtrer la solution de coupe]:
      • Culture Media Components:
        • 20 ml HMEM
        • 10 ml de HBSS
        • 10 ml de sérum de cheval
      • Forfait Verrerie: Les béchers autoclavé
      • 50 ml de MEM lavez les médias
      • Pipetteur (DrummondPipet-Aid)
      • Sept pipettes de transfert en plastique (Fisher # 13-711-20). Ils sont utilisés pour le transfert des tranches et des solutions, ainsi que pour servir de conduit pour des solutions de gaz (O 2, 95% d'O 2 / 5% CO 2) pour bouillonnement des solutions et des médias.
      • Colle cyanoacrylate
      • Lame de rasoir ou des ciseaux (pour couper les plastiques).
      • Stérile lame de bistouri n ° 22
      • Inserts Millicell culture cellulaire (0,4 um, un diamètre de 30 um, # 03050 PICM) 3 inserts pour chaque plaque à 6 puits
      • 6-même plaque de culture (s) (Corning: Costar # 3516)
    3. Filtrez la solution de coupe préparée 250 ml en utilisant un filtre Millipore de 250 mL (voir ci-dessus).
      Aliquoter 40 ml de solution de découpe dans un bécher de 50 ml. Placez la partie aliquote de 40 ml de solution de découpe et de 210 mL de solution restante de coupe au congélateur (-20 ° C). L'objectif est d'utiliser ces solutions comme un mélange barbotine à ~ 4 ° C pour la réception du cerveau après l'enlèvement du crâne (40 ml dans le bécher) et pour la coupe (210 ml).
    4. Chambre métallique Placez le tranchage (recouverte de papier autoclave) de -20 ° C au congélateur. Cela aide à garder la solution de découpe et le froid du cerveau pendant le tranchage.
    5. Préparer les médias de la culture et de mettre en puits (Ne pas Médias Culture bulle - il mousse).
      • Préparer 40 ml de culture des médias dans 50 ml tube en plastique centrifugeuse:
        • Mélanger 20 ml HMEM + 10 ml de HBSS + 10 ml aliquote de sérum de cheval (tableau 2)
        • Milieux de culture de filtre (à stériliser) en utilisant 50 ml Millipore 0,22 um steriflip (# SCGP00525) filtre.
      • Placer 1,1 ml de culture dans les médias 3 puits diagonale espacées d'une plaque à 6 puits (Corning: Costar # 3516 6 pôle culture bien). Placer la plaque de 6 puits / Culture Médias en 37 ° C incubateur pour au moins une heure.
    6. Avec des ciseaux stériles ou lame de rasoir, de raccourcir 4 de la pipette de transfert (utilisation pour le transfert des tranches). Les extrémités des tubes coupés sont utilisés sans autre modification pour disperser les gaz pour des solutions bouillonnant. Ces tubes de connecter les lignes à partir des réservoirs de 95% d'O 2 / 5% CO 2 ou 100% d'O 2 à des solutions.
    7. Filtre Laver les médias (50 ml) en utilisant 50 ml Millipore 0,22 um steriflip (# SCGP00525) filtre. Placer au réfrigérateur Laver les médias.
  3. Préparation pour la chirurgie. Les solutions doivent être prêts à accepter le cerveau après la chirurgie (hotte à vide) et de permettre rapidement le tranchage et la préparation de la culture (hotte à flux laminaire). Nous effectuons la chirurgie sous une hotte vide. Il est important que la chirurgie soit réalisée dans une zone séparée pour garder les cheveux et les fluides du corps loin de la capote semi-stériles à flux laminaire.
    1. Préparer des médias et des solutions.
      • Retirer le bécher de 50 ml avec 40 ml de solution de découpe du congélateur et mettre sous le capot de vide pour recevoir le cerveau après l'enlèvement du crâne. Verser environ 10 mL de cette solution de découpe à froid dans un bécher de 25 ml. Il sera utilisé pour le transport de cerveau pour hotte à flux laminaire.
      • Retirer 210 ml de solution de découpe du congélateur et mettre en hotte à flux laminaire (pour le tranchage et la collecte de tranche).
      • Retirer chambre métallique tranchage du congélateur et mettre sous hotte à flux laminaire.
      • Bubble deux solutions de coupe avec 95% O 2 / 5% de CO 2 (utilisation des pipettes en plastique coupé le transfert se connecter à la solution de tube).
    2. Placez les éléments suivants sous le capot vide (30 ml solution de coupe est déjà présent et bouillonnant avec 95% d'O 2 / 5% CO 2):
      • autoclavé 25 bécher
      • Autoclave des instruments chirurgicaux, des gants, des pinces
    3. Retirer Laver les médias du réfrigérateur et la bulle avec 100% d'O 2 (utilisation finale du transfert de pipette en plastique coupées pour connecter tube à la solution).
  4. La chirurgie (réalisée sous hotte à flux vide). Cette étape est nécessaire pour enlever le cerveau d'ultérieures tranchage. Il est important de minimiser le temps entre sacrifier l'animal et de placer le cerveau dans le froid, la solution de découpe oxygénée. Il est également important pour minimiser les traumatismes au cerveau. Toutes les procédures ont été approuvées par les soins des animaux et du Comité utilisation, Université du Tennessee, Health Science Center.
    1. Nous utilisons des rats Sprague-Dawley, de P6-P17 (nous préférons P8-P10). Placer dans le rat couverte 2-4 récipient en plastique L. Pour l'anesthésie, ~ 1 mL isofluorane est appliquée à un morceau de gaze situées sous un treillis de plastique (de sorte que l'anesthésie ne fait pas contact avec les animaux). Anesthetize rat avec l'isoflurane jusqu'à ce que l'animal est areflexive. Saturer les gants avec de l'EtOH.
    2. Après rat est anesthésié, décapiter l'animal avec de grandes scalpel, et enlever le cerveau. Mettez dans le cerveaubécher contenant 30 ml de froid (~ 4 ° C) Solution de coupe pour ~ 30 sec. Soigneusement le transfert du cerveau à 25 bécher de minimiser le transfert de poils ou de sang pour hotte à flux laminaire.
    3. Gants changement (saturer avec EtOH).
    4. Transfert du cerveau dans la solution de coupe à froid (25 bécher ml) pour hotte à flux laminaire.
  5. Trancher le cerveau et se préparer pour la culture. Dans cette étape, nous nous orientons le cerveau, enlever le tissu cérébral inutiles, et couper et ramasser des tranches de cerveau. Nous avons ensuite laver les tranches, chaque tranche lieu sur un tamis, placez les inserts mesh dans des plaques de culture 6 puits, et le transfert des plaques (avec des tranches) dans l'incubateur pour la culture.
    1. Orient et le cerveau de bloc (enlever le cervelet et mât de façade, assurez partiel à mi-sagittal coupé à mi-chemin ~ du cortex frontal fin ce qui permet de coupe simultanée des deux tranches -. Un de chaque hémisphère - mais conserve deux hemsipheres ensemble à l'extrémité caudale d'un base stable pour coller à la scène). Collez le cerveau bloqués sur scène avec cyanoacrylate. Placez le cerveau avec le cortex frontal et couper des tranches de cortex fronto-pariétal frontal. Faire de nouvelles réductions de scalpel que nécessaire pour limiter la taille de la tranche.
    2. Placez la scène avec le cerveau dans la chambre de métal stérilisés tranchage (qui est rattaché à la trancheuse tissus vibrant) et remplir bain avec de la glace froide, bouillonnant solution de coupe. Verser environ 30 ml de solution de coupe reste dans un bécher de 50 mL (pour recueillir les tranches de) et la bulle avec 95% d'O 2 / 5% CO 2.
    3. Couper les tranches de 250 à 300 um avec une trancheuse tissus vibrant (Campden Vibroslice # MA572: Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride, USA). Placer les tranches dans un bécher contenant 30 ml de solution de découpe. Collecter le nombre de tranches que vous souhaitez à la culture (généralement 3-6), plus un peu plus.
    4. Laver les tranches: Placez ~ 2 médias Laver ml dans un récipient de plastique de Pétri de 35 mm. Transférer toutes les tranches de la solution de coupe à l'antenne en plastique de Petri avec les médias de lavage. Laver les tranches 3 fois, en utilisant les médias Laver frais à chaque fois. N'utiliser que des pipettes de transfert séparé pour transférer des tranches, ajouter les médias, et aspirer les solutions de déchets.
    5. Transfert tranches aux milieux de culture (dans un autre de 35 mm boîte de Petri en plastique; pipette de transfert de nouvelles). Enlevez les sommets de l'emballage pour les inserts en maille, mais laissez les insère dans l'emballage.
    6. Tranches de transfert du milieu de culture d'inserts mesh (avec cuttransfer pipette): tranches de position au milieu de l'insert (figure 1A). Un petit peu de milieux de culture viendront avec la tranche. En utilisant une pipette de transfert intacte, retirez le support de la culture excès immédiatement après le dépôt tranche vers le bas sur l'insert. Essayez de placer les tranches dans le centre de l'insert (cela facilite la transfection biolistique et le rend plus facile à enlever la tranche pour l'enregistrement plus tard).
    7. Tamis Lieu / tranche en milieux de culture en plaque de 6 puits (figure 1B). Soyez prudent pour éviter la formation de bulles d'air sous les 3 mesh.When insertions / tranches sont dans la plaque de 6 puits, placer la plaque arrière de 6 puits dans l'incubateur. Incuber tranches de 37 ° C pour les incubateurs ~ 1 heure.
  6. Tranches Transfecter utilisant pistolet à gènes (Bio-Rad Helios). Cela peut être fait immédiatement après le tranchage et le placement sur le maillage de la plaque de 6 puits, cependant nous avons généralement incuber pendant 1 heure à 37 ° C pour stabiliser les tranches puis transfecter des cellules. Pour des protocoles détaillés pour faire d'ADNc "balles" et en utilisant le pistolet à gènes, voir réf. 17-22.
    1. Charge plastique "cartouches de" contenant "balles". (Nous nous référons à des particules d'or d'ADNc enduits comme des balles. Ainsi, beaucoup de balles sont contenues dans un plastique "cartouche".). Laisser la première position libre (pas de "cartouche"). Charger toutes les autres positions avec cartouche contenant de l'ADNc enduits balles. Support de la cartouche dans le pistolet à gènes place.
    2. Effacer arme en tirant le baril sans cartouche.
    3. Advance baril à un avec cartouche. Retirer la plaque de 6 puits d'incubateur et de placer sous hotte à flux laminaire. Tenir le pistolet juste au-dessus du haut de 6 puits assiette. Tenez verticale. Tirez à ~ 100 psi.
    4. Le baril Advance, claire, répéter. Un tir par tranche.
    5. Après le tournage, le retour des plaques 6 puits avec des tranches / inserts d'incubateur.
  7. Tranches de la culture (sous conditions semi-stériles). Toutes les manipulations des tranches et des plaques de 6 puits devrait être effectué avec des gants saturées avec de l'EtOH et sous la hotte à flux laminaire, après le nettoyage zone avec EtOH. Nous la culture des tranches pour des périodes de temps différentes (généralement 2-7 jours) pour permettre la récupération de la procédure aiguë de tranchage et de laisser le temps pour la transfection de mener à de nouvelles protéines.
    1. Culture pour 2-7 jours (37 ° C, 5% CO 2) dans l'incubateur (modèle Forma Scientific # 3110).
    2. Remplacer les médias tous les autres jours: Ajouter de nouveaux médias pour les trois puits inoccupé, remplacera dans l'incubateur pendant au moins 1 heure. Déplacer slice / membrane pour un nouveau puits avec de l'EtOH nettoyés pince courbe. Aspireranciens médias. Retour à la plaque de l'incubateur.

3. Enregistrement à partir de cellules pyramidales en tranches

Il est au-delà de la portée de ce protocole pour fournir des instructions détaillées sur l'ensemble des techniques d'enregistrement cellule. Nous fournissons des informations sur la façon de transférer des tranches à la chambre d'enregistrement et de fournir des détails sur notre enregistrement mis en place, d'autant que se rapporte à l'identification des cellules transfectées pour l'enregistrement.

  1. Nous tirons des électrodes de Harvard GC150TF-10 de verre en utilisant une Sutter P-87 Extracteur horizontal. Les électrodes sont 2-6 MQ dans la solution extracellulaire. Les électrodes sont remplies avec un KMeSO 4 internes (voir tableau 3).
  2. Porter des gants. Enlever 6-même la plaque de l'incubateur. Sous la hotte à flux laminaire, retirez soigneusement une tranche / maille insert avec EtOH nettoyés, des pinces courbes. Remplacer la plaque de 6 puits dans l'incubateur et le transfert de la tranche à être enregistrés à partir de la zone d'enregistrement. Dans notre cas, c'est dans un laboratoire différent. Nous réalisons l'insert / tranche dans un endroit couvert en plastique 35 mm boîte de Petri. Après cette étape, les gants ne doivent pas être usés (pas de possibilité de contamination de cultures ou de l'incubateur).
  3. Coupez la membrane du # 11 de scalpel. Couper la tension fournie par contre une pince ou une barre de métal flexible. (Il peut être nécessaire pour terminer les coupes finales avec une paire de ciseaux). Utilisant des pinces, transférer la tranche avec filet attaché à la chambre d'enregistrement sur la platine d'un microscope Olympus BX50 WI debout.
  4. Nous utilisons un amplificateur de Axon Instruments Multiclamp 700B et des protocoles d'acquisition de données en pClamp 10. Position des électrodes est contrôlé avec Sutter RE-200 manipulateurs et PC-200. Nous utilisons un Olympus BX-50WI microscope droit avec l'IR-DIC optique pour visualiser les neurones pyramidaux des couches II / III ou V. Nous utilisons un seul IR-sensibles caméra (Olympus OLY-150 ou BDÉS-MTI) et ProVideo 1201B écran pour visualiser les cellules de la tranche. Les tranches sont baignées de carbogenated artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF: Tableau 3) livrées à 2-3 ml / min à 33 ± 1 ° C.
    Typiquement, on trouve 10 à 50 cellules transfectées par tranche. Les cellules sont localisées par lookingthrough l'oculaire du microscope et l'aide à épifluorescence muni d'un filtre FITC (monté sur une roue de filtre dans une monture tourelle située au-dessus des objectifs et en dessous de l'oculaire du microscope). Cela nous permet de basculer facilement entre IR-DIC et épifluorescence pour déterminer le type de cellules, que la cellule est transfectées (cellules apparaît vert sous épifluorescence et contient une puce), et que la cellule est en bonne santé (la cellule est en 3 dimensions et a une surface lisse , le noyau n'est pas gonflée, la cellule n'est pas gonflé ou rétrécies).
    Nous ciblons les neurones pyramidaux des couches II / III ou V (voir figure 1). Les cellules pyramidales sont identifiés par la présence d'une dendrite apicale ascendante vers la couche I, de nombreuses épines dendritiques, et en forme de poire soma. Couche est déterminée par la densité des cellules et l'emplacement par rapport à la pie-mère. Cellules transfectées général à la surface de la tranche ne sera pas saine. Bien qu'il soit plus difficile de visualiser les cellules profondément dans organotypique qu'avec tranches aiguës, nous pouvons visualiser généralement sain, les cellules transfectées de 20 à 50 um en dessous de la surface de tranche. Nous utilisons des méthodes d'enregistrement standard de l'ensemble des cellules. Nous approchons de la cellule sous guidage visuel et à pression positive dans voltage-clamp. Les phoques sont acquis avec une aspiration douce (en utilisant une seringue ml) sous voltage-clamp. Après la réalisation d'un joint GQ, aspiration supplémentaire est appliquée pour s'introduire dans la cellule. Nous effectuons ensuite des enregistrements dans les deux courants ou voltage-clamp.
    A la fin de l'enregistrement, on vérifie que la cellule enregistrée est verte, contient une balle, et répond visiblement à une pression négative ou positive. Pour contrôler les variations entre les tranches, les couches de cellules, l'âge au moment de la chirurgie, et de temps dans la culture, nous avons toujours nos enregistrements paire de cellules transfectées avec des enregistrements à partir des cellules de contrôle non transfectées de la même couche et situé à 50 um de la cellule transfectée.

4. Les résultats représentatifs:

La figure 1A montre une tranche aiguë préparés assis sur la membrane pour une insertion dans une plaque de 6 puits de culture. Cette tranche comprend cortex moteur et somatosensoriel à partir d'un P10 raton. La pie-mère est à la droite de la figure, avec de la matière blanche et le striatum vers la gauche. Figure 1B montre la tranche / membrane dans le puits, immergé dans la culture des médias ~ 1,1 ml. Notre objectif pour la culture organotypique est de conserver le modèle laminaire normale du cortex, de prévenir la surface sécher pendant la culture, et finalement à produire une forte proportion de cellules vivantes dans la tranche après plusieurs jours dans la culture qui peuvent être enregistrées à partir de (cellules non ratatinés ou gonflées, les noyaux de cellules gonflées minimale, brillant et trois dimensions l'aspect des cellules dans IR-DIC optique). Figure 1C montre des images IR-DIC et épifluorescence d'un neurone couche III pyramidale dans une tranche organotypique de cortex somatosensoriel après 3 jours deculture (de l'animal P10). La figure 1D est une image d'une tranche épifluorescence différentes, montrant plusieurs cellules transfectées avec la couche V ADNc pour la GFP (cellules vertes).

La figure 2 montre des traces représentatives de courant et de voltage-clamp des enregistrements à partir d'une cellule pyramidale V couche après culture organotypique pendant 3 jours (P10 animaux). La figure 2A montre un potentiel d'action dépassement (AP). La figure 2B montre tirs répétitifs en réponse à une 2 s, 400 pA injection de courant constant. Ces traces indiquent la normale des propriétés électrophysiologiques d'une couche de dopage réguliers V neurone (voir aussi tableau 1). Figure 1C est un enregistrement voltage-clamp à partir d'un neurone pyramidal couche V, en présence de 1 uM de tétrodotoxine (TTX) pour bloquer voltage-dépendants Na + courants. Les traces sont une famille de courants, en réponse à 500 ms pas de tension à partir d'un potentiel de maintien de -70 mV à différents potentiels entre -90 mV et 70 mV (à 10 mV entre les étapes).

Figure 1
Figure 1. La culture organotypique. A. Tranche de rat cortex sensorimoteur du rat P10 sur l'insert Millicell filtre maille. Pia est à la droite, la substance blanche profonde et du striatum vers la gauche. La ligne médiane est au bord supérieur. B. Trois inserts tranche et treillis immergé dans la culture des médias ~ 1 ml et placés dans des puits non adjacentes de 6-même assiette (même animal comme dans A). C. IR-DIC (supérieur) et epifluoresent (inférieur) des images de la couche de cellules pyramidales du néocortex III dans la culture organotypiques (P10 animaux, 3 jours de culture). Remarque "balle" visible dans l'image DIC (sphère noire). D. image fluorescente de plusieurs neurones V couche après transfection biolistique avec l'ADNc de la GFP.

Figure 2
Figure 2. Les enregistrements de cellules pyramidales du néocortex dans la culture organotypique. A. Potentiel d'action dans la couche III pyramidale cellule (de l'animal P10, après 3 jours de culture) en réponse à supraliminaire 10 ms injection de courant. B. tirs répétitifs provenant d'une autre, la couche V neurone pyramidal (P10 chez le rat, 3 jours de culture) en réponse à une 2 s, 400 pA injection de courant. Ce fut un neurone réguliers de dopage. C. voltage-clamp enregistrer à partir d'un autre neurone pyramidal couche V (P10 chez le rat, 3 jours de culture). 1 TTX uM était présent pour bloquer voltage-dépendants courant Na +. Vers l'extérieur, les courants K + en réponse à une famille de 500 marches de tension ms à partir d'un potentiel de maintien de -70 mV (protocole à droite). Tensions ont été corrigées pour un potentiel de jonction 10 mV liquide. Résistance d'accès a été ~ 9 MQ. Aucune compensation pour la résistance série ou capacitance membranaire a été employée.

Tableau 1. Similaires propriétés électriques de contrôle vs GFP transfectées cellules pyramidales (tranches de rat p10; organotypique: 3-4 jours in vitro). Moyenne + erreur standard de la moyenne (nombre de cellules). RMP = potentiel de repos membranaire, Rn = résistance d'entrée, AP = potentiel d'action; seuil de tension Vth = pour AP; HW = largeur à la moitié de l'amplitude AP.

Traitement RMP (mV) Rn (MQ) AP amplitude Ve (mV) HW (ms)
Contrôle -72 ± 1 (21) 119 ± 17 (11) 84 ± 2 (24) -45 ± 1 (21) 1,7 ± 0,1 (19)
GFP seule -77 ± 1 (9) 123 ± 7 (5) 87 ± 2 (24) -45 ± 2 (9) 2,1 ± 0,2 (7)

Tableau 2. Médias commerciaux. Ces médias sont achetés et utilisés tels quels (Leurs compositions sont disponibles en ligne par le fabricant).

1 Lavez les médias: MEM (Gibco # 12360)
Milieux de culture: 20 ml HMEM 1 (Lonza Biowhittaker), + 10 ml HBSS1 (Gibco, 24020-117) + 10 ml de chevaux serum1 (Hyclone # SH 30074.03)

Tableau 3. Solutions (concentrations en mM).

Solution de découpe: 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20 de glucose (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Liquide céphalo-rachidien artificiel ACSF (enregistrement externe): 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20 de glucose (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Enregistrement interne (courant-clamp): 130,5 KMeSO4, 10 KCl, 7,5 NaCl, MgCl 2 2, 10 HEPES, 2 ATP, GTP 0,2, 0,1 EGTA (pH 7,2, 285 à 295 mOsm / L).
Enregistrement interne (voltage-clamp): 55 KMeSO 4, 55 KOH, MgCl 2 2, 20 HEPES, 6 créatine phosphate, 4 ATP, GTP 0,5, 10 BAPTA, 0,1 leupeptine (pH 7,2, 285 à 295 mOsm / L).

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Discussion

Nous avons étudié les rôles d'expression et fonctionnelles des canaux voltage-dépendants de potassium dans les neurones pyramidaux du néocortex de rat (4, 9-11). En raison de l'absence d'agents pharmacologiques spécifiques pour ces canaux, nous utilisons une approche génétique pour manipuler l'expression de canal (1,14,15,17-19). Nous utilisons une préparation culture organotypique (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modifiée de l'approche de Stoppini et al (16), afin de maintenir la morphologie cellulaire et le modèle laminaire du cortex. Nous isolons aiguë tranches néocorticales au jour postnatal 6-17 et maintenir les tranches en culture pendant 2-7 jours. Cela nous permet d'étudier similaires à ceux âgés de neurones dans notre travail avec des tranches aiguës et minimise le développement des connexions excitatrices exubérante dans la tranche. Nous enregistrons d'identifier visuellement les neurones pyramidaux des couches II / III ou V à l'aide d'éclairage infrarouge (IR-) et microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) avec pince de cellules de patch tout en courant ou voltage-clamp. Biolistique (Gene gun) transfection de type sauvage ou mutante ADN canal potassium est utilisé pour manipuler l'expression des canaux d'étudier leur fonction (1,14,15,17). En co-transfection avec l'ADNc de la GFP, les cellules transfectées sont facilement identifiables en microscopie à épifluorescence. Nous comparons les enregistrements de cellules transfectées à proximité, les neurones non transfectées dans la même couche de la même tranche (1,17).

Aucune des procédures traitées ici sont difficiles, mais attention à quelques détails peuvent grandement améliorer les résultats. Dans nos mains, la viabilité cellulaire est meilleure lorsque les cultures sont faites à partir de tranches de ~ P8-P10 animaux. Il est important de maintenir des conditions semi-stériles lors de la découpe et la culture de tranches. Pour prévenir la contamination bactérienne, nous l'autoclave des instruments et nettoyer la zone chirurgicale à la lumière UV et EtOH, les solutions de filtrage, porter des gants, des gants et des changements entre la suppression des tranches de cerveau et de décision. Les conséquences de la contamination bactérienne comprennent la viabilité des tissus pauvres et la nécessité de décontaminer les incubateurs. Comme avec tous les tranches de cerveau, la viabilité est améliorée en minimisant le temps entre le sacrifice de l'animal et le tranchage. Le cerveau doit être placé et le tranchage doivent être fait avec le cerveau immergé dans une boue glacée de la solution de découpe. Trancher à vitesse lente, avec une faible amplitude de la vibration horizontale de la lame.

Un autre problème potentiel est l'assèchement des tranches tandis que dans l'incubateur. Le séchage peut être minimisé par la préparation des tranches qui sont petites: restreinte au cortex d'intérêt et d'un petit morceau de striatum (à des fins d'orientation). Grandes tranches ont tendance à sécher dans la couveuse et il est plus difficile d'obtenir des conditions d'enregistrement stables avec grosses tranches. Les tranches sont coupées à 250-300 um d'épaisseur. Nous constatons que plus minces tranches (nous préférons 250 um) résulte en moins de séchage. Lors du transfert des tranches de la solution de découpe à l'incubateur, nous nous lavons les tranches à plusieurs reprises, d'abord dans les médias Laver puis en milieu de culture. Il est important d'enlever l'excès de liquide après le transfert à la membrane (pour permettre d'attacher à la tranche de la maille). Pour plus épaisses tranches (par exemple, 300 um), une seule goutte de la culture médiatique rythme sur le dessus de la tranche (alors qu'il est assis sur la membrane) permet d'éviter le séchage. Cette procédure semble amorcer le mouvement des milieux humides à la surface supérieure de la tranche. Remplacement de la culture des médias chaque jour d'autres empêche également le séchage et favorise la viabilité.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Mayumi Sakuraba et Rebecca Foehring d'assistance technique exceptionnelle. En outre, nous tenons à remercier les Drs. Rodrigo Andrade pour l'aide à mettre en œuvre la culture organotypique et des protocoles de transfection biolistique et le Dr Jeanne Nerbonne pour nous fournir avec des constructions d'ADNc pour la transfection. Ce travail a été soutenu par le NIH Grant: NS044163 du NINDS (aux FCR).

Materials

Surgery / transfection / culture:

  1. Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
  2. Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
    • Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
    • Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
    • disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
      • 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
      • Tefzel Tubing: #165-2441
  3. Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766).

Media:

  1. Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
  2. HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  3. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  4. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  5. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
  6. Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
  7. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)

Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.

Recording:

  1. Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
  2. Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
  3. Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  4. PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  5. lectrode position is controlled with Sutter R–-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
  6. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
  7. IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).

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References

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Neurosciences Numéro 52 organotypiques le néocortex somato-sensoriel des cellules pyramidales préparation de tranches la transfection biolistique
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Foehring, R. C., Guan, D., Toleman, T., Cantrell, A. R. Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex. J. Vis. Exp. (52), e2600, doi:10.3791/2600 (2011).

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