Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

Summary

Este é um protocolo para preparar e manter uma preparação fatia neocortical na cultura organotípicas com a finalidade de fazer gravações elétrica de neurônios piramidais.

Abstract

Temos vindo a estudar os papéis expressão e funcional de voltagem dependentes canais de potássio em neurônios piramidais do neocórtex de ratos. Devido à falta de agentes farmacológicos específicos para estes canais, temos uma abordagem genética para manipular a expressão do canal. Nós usamos uma preparação cultura organotípicas (16) a fim de manter a morfologia das células eo padrão laminar do córtex. Normalmente, isolar aguda fatias neocortical menos 8-10 dias pós-parto e manter as fatias em cultura por 3-7 dias. Isto permite-nos estudar neurônios em uma idade semelhantes aos de nosso trabalho com fatias aguda e minimiza o desenvolvimento de exuberante conexões excitatórias nos fatia. Nós gravar a partir de visualmente identificados neurônios piramidais em camadas II / III ou V com uma iluminação de infravermelho (IR) e microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) com grampo toda célula patch em corrente ou tensão-clamp. Usamos transfecção (arma Gene) biobalística do tipo selvagem ou mutante DNA canal de potássio para manipular a expressão dos canais para estudar sua função. As células transfectadas são facilmente identificados por microscopia de epifluorescência, após a co-transfecção com cDNA para a proteína verde fluorescente (GFP). Nós comparamos as gravações de células transfectadas com adjacentes, os neurônios untransfected na mesma camada da mesma fatia.

Protocol

1. Preparativos Antes do dia da Slicing

Acharmos que é mais eficiente para autoclave os instrumentos cirúrgicos e preparar soluções antes do dia de cortar.

1. Instrumentos autoclave. (A cirurgia eo corte são realizados sob condições semi-estéril). Autoclave os seguintes pacotes, embalados individualmente em papel autoclave:
   • Pacote de cirurgia: espátula, # 22 lidar com lâmina de bisturi, tesouras, pinças
   • Pacote de corte: 3 botões (lâmina de retenção de botão e 2 banho de garantir knobs) e lâmina de guarda (mantém lâmina de barbear de slicer: Campden Vibroslice, # MA572), embalados individualmente (porque ele vai ser colocado em freezer) feitos câmara de metal ( espécime de banho) para slicer (plexiglass do fabricante não irá suportar autoclave repetida), hemostat, tesouras, pinças.
   • Copos pacote: dois copos de 50 ml e um copo de 25 mL
2. Alíquota de soro de cavalo (equinos Hyclone doador # 30074 SH: Thermoscientic). Alíquota ~ 11 ml de soro de cavalo em 15 mL tubos cônicos. (10 ml de soro é necessária. Porque bolhas se formam quando soro é descongelado, você precisa de 11 mL de que para aspirar o de 10 mL necessário). Loja alíquotas de soro em um freezer -20 C °.
3. Alíquota de mídia. Depois de as garrafas de mídia são abertos, eles são apenas estável para a 4 semanas (devido a mudanças de pH). As fatias sobrevivem melhor com a mídia fresco.
   • Usamos três tipos de mídias disponíveis comercialmente (comprado em garrafas de 500 mL), além de soro de cavalo. Os meios de comunicação são: HMEM (Lonza BioWhittaker Minimal Essential Media mais HBSS e HEPES, sem glutamina: Catalog # 12-137F), HBSS (Hanks GIBCO solução salina, # 24020-117) e MEM (GIBCO meio mínimo essencial, # 12360 - 038). Consulte a Tabela 2.
   • Para cada um dos três tipos de mídia (HMEM, HBSS e MEM), alíquota ~ 50 mL de uma garrafa de 500 ml de mídia em cada um dos quatro tubos cônicos de 50 mL. Parafilm todos os tubos após alíquotas. Loja do MAM na geladeira, e armazenar HMEM HBSS e à temperatura ambiente.
   • A cultura da mídia consiste em uma mistura de soro de cavalo, HMEM e HBSS (veja abaixo, Tabela 2). MEM é usado como meio de lavagem.
4. Fazer corte Solution (Tabela 3). A solução de corte é composto de (em mM): NaCl 125, KCl 3, NaH ₂ PO ₄ 1,25, NaHCO ₃ 26, 2 mM CaCl _2, 2 mM MgCl _2, e 20 mM de glicose. Nós normalmente fazem 250 mL (volume em trazer para balão volumétrico). Verificação da pressão osmótica (deve ser ~ 310) e pH (7,2-7,3).

Etapas subseqüentes (# 2 e # 3) são executadas no dia da corte.

2. Cirurgia, Slicing e Cultura organotípicas

É importante realizar a cirurgia em um local separado contra todos os outros procedimentos. Usamos um vácuo capô (fumos) para a cirurgia para a remoção do cérebro. A capela de fluxo laminar é utilizado para procedimentos realizados sob condições semi-estéreis, como o corte ea manipulação de fatias e soluções.

1. Preparar soluções. (Estes procedimentos não precisam ser realizados em condições estéreis, as soluções serão filtradas em uma etapa posterior.).
   1. Preparar a solução de corte (Tabela 3). Solução de bolha com uma mistura de 95% O ₂ / 5% CO ₂ por pelo menos 20 minutos (para estabilizar o pH e certifique-se todos os sais estão em solução). Adicione 1 mM de ácido pirúvico (inibidor metabólico) and0.6 mM ascorbato (antioxidante).
   2. Alíquota descongelar 1 de soro de cavalo (11 mL).
2. Prepare capela de fluxo laminar (usar luvas para todos os procedimentos, saturado luvas com EtOH). Nesta seção, nós preparamos a área de trabalho para proporcionar um ambiente limpo, espaço de trabalho semi-estéril. Nós também irá filtrar as soluções para esterilizá-los.
   1. Use a luz UV para ~ 1 hora para esterilizar o espaço de trabalho dentro da capela de fluxo laminar (luz UV pode danificar peças de plástico para que cobrem theCampden Vibroslice que usamos para corte, veja abaixo). Limpe todas as superfícies com EtOH 70% (exceto botões de plástico de slicer: EtOH irá danificar). Também tipicamente presentes sob a capela de fluxo laminar são os pipeta e pipetas, frasco EtOH, cola e tubos ligados a 95% O ₂ / 5% CO ₂ e O ₂ 100.
   2. Coloque o seguinte sob capela de fluxo laminar:
      • Pacote de corte autoclavado
      • 250 mL da solução de corte
      • Millipore Express Plus filtro: 250 mL [0,2 m de filtro (# SC6PU02RE) para filtrar solução de corte]:
      • Componentes da cultura de mídia:
        • 20 mL HMEM
        • 10 mL HBSS
        • 10 mL soro de cavalo
      • Copos pacote: O copos autoclavado
      • 50 mL de MEM lavar media
      • Pipeta (Drummondpipeta ajuda)
      • Sete plástico pipetas de transferência (Fisher # 13-711-20). Estes são usados ​​para transferir fatias e soluções, bem como para servir como canal para soluções de gases (O ₂ 95% O ₂ / 5% CO ₂₎ para borbulhar soluções e meios de comunicação.
      • Cola de cianoacrilato
      • Lâmina de barbear ou tesoura (para cortar plástico).
      • Lâmina de bisturi estéril # 22
      • Célula Millicell insere a cultura (0,4 mM, 30 mM de diâmetro, # PICM 03.050) 3 inserções para cada placa de 6 poços
      • 6-bem placa de cultura (s) (Corning: Costar # 3516)
   3. Filtrar o preparado 250 mL da solução de corte usando um filtro Millipore 250 mL (veja acima).
      ML alíquota 40 de Solução de corte para um copo de 50 mL. Coloque a alíquota de 40 mL de solução de corte e 210 mL da solução restante corte em freezer (-20 ° C). O objetivo é utilizar estas soluções como uma mistura lamacenta em ~ 4 ° C para o recebimento do cérebro após a remoção do crânio (40 mL no copo) e para o corte (210 mL).
   4. Câmara local de metal corte (coberto com papel autoclave) em -20 ° C freezer. Isso ajuda a manter a solução de corte e frio cérebro durante o corte.
   5. Prepare Meios de Cultura e colocados em poços (Não Meios de Cultura bolha - vai espumar).
      • Prepare 40 mL Meios de Cultura em 50 mL de tubo plástico de centrífuga:
        • Misture 20 mL HMEM HBSS + 10 mL + 10 mL de alíquota soro de cavalo (Tabela 2)
        • Meios de Cultura filtro (para esterilizar), utilizando 50 mL Millipore 0,22 mM steriflip filtro (# SCGP00525).
      • Coloque 1,1 mL Meios de Cultura em 3 poços na diagonal espaçadas de uma placa de 6 poços (Corning: Costar 3516 # 6 aglomerado cultura também). 6 lugar bem-plate / Meios de Cultura em 37 ° C incubadora de pelo menos uma hora.
   6. Com tesoura esterilizada ou lâmina de barbear, encurtar 4 do pipetas de transferência (use para a transferência de fatias). As extremidades do tubo de corte são usados ​​sem modificações adicionais para dispersar os gases de soluções borbulhando. Estes tubos conectam as linhas de tanques de 95% O ₂ / 5% CO ₂ ou 100% O ₂ para as soluções.
   7. Lavar filtro de Media (50 mL), utilizando 50 mL Millipore 0,22 mM steriflip filtro (# SCGP00525). Mídia local Lave em geladeira.
3. Preparação para a cirurgia. As soluções devem estar prontos para aceitar o cérebro após a cirurgia (capa vácuo) e permitir uma rápida corte e preparação para a cultura (capela de fluxo laminar). Nós executamos a cirurgia sob uma capa de vácuo. É importante que a cirurgia ser realizada em uma área separada para manter os fluidos do corpo e do cabelo de distância da capela de fluxo laminar semi-estéril.
   1. Prepare a mídia e soluções.
      • Retirar o copo 50 mL com 40 mL da solução de corte do freezer e colocar sob o capô de vácuo para receber cérebro após a remoção do crânio. Despeje ~ 10 mL desta solução de corte a frio num copo de 25 mL. Isso será usado para o transporte de cérebro para capela de fluxo laminar.
      • Remover Solução de corte 210 mL do freezer e colocar na capela de fluxo laminar (para fatiar e coleta de fatia).
      • Remover câmara metálica corte do freezer e colocados sob capela de fluxo laminar.
      • Bolha tanto corte soluções com 95% O ₂ / 5% de CO ₂ (use pipetas de plástico cortadas transferência para conectar a tubulação de solução).
   2. Coloque os seguintes itens sob a capa de vácuo (30 mL de solução de corte já está presente e borbulhando com 95% O ₂ / 5% CO _2):
      • autoclavado 25 copo mL
      • Autoclavado instrumentos cirúrgicos, luvas, pinças
   3. Retire da geladeira Lavar Mídia e bolha com 100% de O ₂ (utilização final de pipeta de plástico cortadas transferência para conectar a tubulação de solução).
4. A cirurgia (realizada sob capela de fluxo de vácuo). Esta etapa é necessária para remover o cérebro para posterior corte. É importante para minimizar o tempo entre a sacrificar o animal e colocar o cérebro no frio, solução oxigenada de corte. Também é importante para minimizar o trauma ao cérebro. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use, University of Tennessee, Health Science Center.
   1. Usamos Sprague-Dawley, de P6-P17 (nós preferimos P8-P10). Rato em lugar coberto recipiente plástico 2-4 L. Para anestesia, ~ 1 mL isofluorano é aplicada a um pedaço de gaze localizado sob uma malha de plástico (de modo que não entra em contato anestésico animal). Anestesiar ratos com isoflurano até que o animal é areflexive. Saturar luvas com EtOH.
   2. Depois de rato é anestesiado, decapitar o animal com bisturi de grande porte, e remover cérebro. Coloque o cérebro embéquer contendo 30 mL de frio (~ 4 ° C) Solução de corte para ~ 30 seg. Transferir cuidadosamente cérebro a 25 mL copo para minimizar a transferência de cabelo ou sangue para capela de fluxo laminar.
   3. Luvas de mudança (saturar com EtOH).
   4. Cérebro de transferência em solução de corte a frio (25 copo mL) para laminar de fluxo.
5. Fatia do cérebro e se preparar para a cultura. Nesta etapa, que orientam o cérebro, remover tecido cerebral desnecessários, e cortar e recolher fatias de cérebro. Em seguida, lave as fatias, coloque cada fatia em uma inserção de rede, coloque as pastilhas de malha em placas de 6 poços, cultura e transferir as placas (com fatias) à incubadora para a cultura.
   1. Orientar e bloco cérebro (cerebelo e remover pólo frontal, fazer corte de médios-sagital parcial ~ a meio caminho do fim córtex frontal Isto permite o corte simultâneo de duas fatias -. Um de cada hemisfério - mas ainda mantém dois hemsipheres juntos no final de um caudal base estável para cola para estágio). Cola cérebro bloqueado no palco com cianoacrilato. Lugar com cérebro córtex frontal e corte fatias de córtex frontoparietal coronal. Fazer cortes adicionais, conforme necessário bisturi para restringir o tamanho da fatia.
   2. Coloque o palco com o cérebro para a câmara de metal esterilizados corte (que é ligado ao tecido slicer vibrando) e preencher banho com gelado, borbulhante solução de corte. Despeje ~ 30 mL de solução de corte restante para um copo de 50 mL (para coletar fatias in) e bolha com 95% O ₂ / 5% CO _2.
   3. Cortar fatias 250-300 mM com um cortador de tecido vibratório (Campden Vibroslice # MA572: Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota, FL, EUA). Fatias coloque em recipiente que contém 30 mL da solução de corte. Coletar o número de fatias que você deseja para a cultura (geralmente 3-6), além de um acréscimo poucos.
   4. Lavar Slices: Coloque ~ 2 Mídia Wash mL em um 35 milímetros prato de plástico Petri. Transferência de todas as fatias da solução de corte para a placa de Petri de plástico com o Media Wash. Lave as fatias 3 vezes, usando o Media Wash fresco de cada vez. Use pipetas de transferência separada para transferir fatias, adicionar mídia, e aspirar soluções de resíduos.
   5. Transferência de fatias de Meios de Cultura (em um prato de 35 milímetros diferentes Petri de plástico; pipeta nova). Remover as tampas da embalagem para as inserções de malha, mas deixar o insere na embalagem.
   6. Fatias de transferência de Meios de Cultura para inserções de malha (com cuttransfer pipeta): fatias de posição no meio da inserção (Figura 1A). Um pequeno pedaço de Meios de Cultura virá junto com a fatia. Usando uma pipeta de transferência intacta, remova o excesso de Meios de Cultura imediatamente após a colocação de fatia para baixo no insert. Tente posicionar fatia no centro de inserção (o que facilita transfecção biobalística e torna mais fácil para remover a fatia para a gravação mais tarde).
   7. Inserir local malha / fatia em meios de cultura em placa de 6 poços (Figura 1B). Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas de ar sob a mesh.When três inserções / fatias estão no prato 6-bem, coloque 6-bem para trás da placa na incubadora. Incubar fatias em 37 ° C incubadora de ~ 1 hora.
6. Fatias de transfecção usando Gun Gene (Bio-Rad Helios). Isto pode ser feito imediatamente após o corte e colocação de malha em chapa de 6-bem, no entanto, normalmente incubar por 1 hora a 37 ° C para estabilizar as fatias e depois transfecção as células. Para protocolos detalhados para a tomada de cDNA "balas" e usando a arma Gene, ver Refs. 17-22.
   1. Carga de plástico "cartidges" contendo "balas". (Referimo-nos a partículas cDNA revestido de ouro como balas. Assim, muitas balas estão contidas em um "cartucho" de plástico.). Deixe a primeira posição livre (sem "cartucho"). Carregar todas as outras posições com cartucho contendo cDNA revestido balas. Titular lugar cartucho na arma gene.
   2. Claro arma disparando barril sem cartucho.
   3. Antecedência barril para uma com cartucho. Remove 6 bem-placa da incubadora e lugar sob a capela de fluxo laminar. Segure a pistola um pouco acima de 6 top bem-chapa. Segure vertical. Atirar em ~ 100 psi.
   4. Barril antecedência, claro, repita. Um tiro por fatia.
   5. Após o disparo, o retorno de 6 bem pratos com fatias / insere a incubadora.
7. Fatias de cultura (semi-estéril Sob condições). Todas as manipulações das fatias e 6 bem-placas deve ser feita com luvas saturado com EtOH e sob a capela de fluxo laminar, após a limpeza da área com EtOH. Nós cultura as fatias de vários períodos de tempo (geralmente 2-7 dias) para permitir a recuperação do procedimento aguda corte e para dar tempo para a transfecção de levar a nova proteína.
   1. Cultura para 2-7 dias (37 ° C, 5% CO ₂₎ em incubadora (Forma modelo Scientific # 3110).
   2. Substituirá a mídia todos os dias: Adicionar nova mídia para os três poços desocupado, substituir em incubadora para pelo menos 1 hora. Mova fatia / membrana para novo poço com EtOH-limpos pinças curvas. Aspiradomedia de idade. Retorno placa para incubadora.

3. Gravar a partir de Células Piramidais em Fatias

Está além do escopo deste protocolo para fornecer instruções detalhadas sobre técnicas de gravação de células inteiras. Nós fornecemos informações sobre como transferir fatias para a câmara de gravação e fornecer detalhes de nossa gravação de set-up, especialmente quando diz respeito à identificação de células transfectadas para a gravação.

1. Puxamos eletrodos de Harvard vidro GC150TF-10 usando um Sutter P-87 puxador horizontal. Eletrodos são 2-6 mohms na solução extracelular. Eletrodos são preenchidos com um ₄ KMeSO interno (ver Tabela 3).
2. Usar luvas. Remove 6 bem-placa da incubadora. Sob a capela de fluxo laminar, remova cuidadosamente uma fatia de inserção / mesh com EtOH-limpos, pinças curvas. Substituir seis bem-placa na incubadora ea transferência da fatia a ser gravado a partir para a área de gravação. No nosso caso, isto é, em um laboratório diferente. Nós carregamos o insert / fatia de 35 milímetros cobertos de plástico placa de Petri. Após esta etapa, as luvas não precisam ser usados ​​(há possibilidade de contaminação de culturas ou incubadora).
3. Cortar membrana com # 11 bisturi. Corte contra a tensão fornecida por fórceps ou barra de metal flexível. (Pode ser necessário para terminar a cortes finais com uma tesoura). Utilizando uma pinça, a transferência da fatia com malha anexado à câmara de gravação no palco de um microscópio Olympus BX50 WI vertical.
4. Usamos uma Axon Instruments amplificador Multiclamp 700B e protocolos de aquisição de dados em PClamp 10. Posição do eletrodo é controlada com Sutter ROE-200 manipuladores e PC-200 do controlador. Nós usamos um microscópio Olympus BX-50WI vertical com IR-DIC óptica para visualizar neurônios piramidais em camadas II / III ou V. Nós usamos uma câmera IR sensível único (Olympus OLY-150 ou DAGE-MTI) e ProVideo monitorar 1201B para visualizar as células da fatia. Fatias são banhadas em carbogenated líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF: Tabela 3) entregue em 2-3 mL / min a 33 ± 1 ° C.
   Normalmente, encontramos 10-50 células transfectadas por fatia. Células estão localizados por lookingthrough a ocular do microscópio e utilizando de epifluorescência, com um filtro FITC (montado em uma roda de filtros em uma montagem da torre localizado acima e abaixo dos objectivos a ocular do microscópio). Isso nos permite alternar facilmente entre IR-DIC e epifluorescência para determinar o tipo de célula, que a célula está transfectadas (célula aparece verde sob epifluorescência e contém uma bala), e que a célula seja saudável (celular é 3-dimensional e tem superfície lisa , núcleo não inchados, inchados ou não de células encolhido).
   Nós alvo neurônios piramidais em camadas II / III ou V (ver Figura 1). Células piramidais são identificados pela presença de um dendrito apical ascendente para a camada I, inúmeras espinhas dendríticas, e em forma de pêra soma. Camada é determinada pela densidade celular e localização em relação à pia. Células transfectadas geralmente na superfície da fatia não será saudável. Embora seja mais difícil de visualizar células profundamente dentro fatia organotípicas do que com fatias aguda, que geralmente pode visualizar saudável, as células transfectadas 20-50 M abaixo da superfície da fatia. Usamos métodos padrão de gravação de células íntegras. Nos aproximamos do celular sob a orientação visual e com pressão positiva na tensão clamp. Os selos são adquiridos com uma sucção suave (usando seringa de 1 mL), sob tensão de clamp. Após a obtenção de um selo GÊ, sucção adicional é aplicado a entrar nas células. Em seguida, realizar gravações em qualquer corrente ou tensão-clamp.
   No final da gravação, verificamos que a célula gravado é verde, contém uma bala, e visivelmente responde à pressão negativa ou positiva. Para controlar a variação entre fatias, camadas de células, a idade no momento da cirurgia, eo tempo na cultura, sempre par nossas gravações de células transfectadas com gravações a partir de células controle untransfected da mesma camada e localizado com 50 mm da célula transfectadas.

4. Resultados representativos:

Figura 1A mostra uma fatia aguda preparado sentado na membrana para inserção em uma placa de seis poços para cultura. Esta fatia inclui córtex motor e somatossensorial de um rato P10 filhote. A pia está à direita da figura, com a matéria branca e striatum para a esquerda. A Figura 1B mostra a fatia / membrana no poço, imerso em ~ 1,1 mL Meios de Cultura. Nossa meta para a cultura organotípicas é manter o padrão normal do córtex laminar, impedem de secagem da superfície durante a cultura, e, finalmente, para produzir uma alta proporção de células vivas na fatia depois de vários dias na cultura que podem ser gravados a partir de (células não atrofiados ou inchado, núcleos de células mínima inchada, brilhante e três dimensional aparência de células em IR-DIC óptica). Figura 1C mostra imagens IR-DIC e epifluorescência de uma III camada piramidal neurônio em uma fatia de organotípicas córtex somatosensorial após 3 diascultura (a partir de animais P10). Figura 1D é uma imagem de uma fatia de epifluorescência diferentes, mostrando várias células da camada V transfectadas com cDNA de GFP (células verdes).

A Figura 2 mostra os traços de representação em corrente e voltagem clamp-gravações de um celular V camada piramidal após cultura fatia organotípicas durante 3 dias (P10 animal). Figura 2A mostra um potencial de ação overshooting (AP). Figura 2B mostra disparo repetitivo em resposta a uma 2 s 400 pA, a injeção de corrente constante. Esses traços indicam propriedades eletrofisiológicas normais de um regular spiking camada de neurônio V (ver também Tabela 1). Figura 1C é uma gravação de tensão grampo de um neurônio da camada piramidal V, na presença de uma tetrodotoxina mM (TTX) para bloquear voltagem-dependentes de Na ⁺ correntes. Os traços são uma família de correntes em resposta a 500 passos tensão ms a partir de um potencial de realização de -70 mV para vários potenciais entre -90 mV e 70 mV (a 10 mV entre as etapas).

Figura 1. Cultura fatia organotípicas. A. Fatia de rato córtex sensório-motor a partir de P10 rato sobre Millicell inserir filtro de rede. Pia é para a direita, substância branca profunda e striatum para a esquerda. A linha média está na borda superior. B. Três inserções de corte e submerso em malha ~ 1 Meios de Cultura mL e colocados em poços não adjacentes de 6 bem-placa (mesmo animal como em A). C. IR-DIC (superior) e epifluoresent (inferior) imagens da camada III de células piramidais neocortical na cultura organotípicas (P10 animal, 3 dias em cultura). Nota "bala" visível na imagem DIC (esfera negra). D. imagem fluorescente de neurônios da camada várias V após transfecção biobalística com cDNA da GFP.

Figura 2. Gravações de neocortical células piramidais na cultura fatia organotípicas. A. Potencial de ação na camada de células piramidais III (de animais P10, após 3 dias em cultura) em resposta à injeção suprathreshold ms atuais 10. B. disparo repetitivo de uma diferente, V camada piramidal neurônio (P10 rato, 3 dias em cultura) em resposta a uma 2 s, a injeção de 400 pA atual. Este foi um neurônio normal spiking. C. registro Voltage grampo de uma camada de diferentes V neurônio piramidal (P10 rato, 3 dias em cultura). 1 TTX M estava presente para bloquear voltagem-dependentes de Na ⁺ atual. Exterior, K ⁺ correntes em resposta a uma família de 500 degraus de tensão ms a partir de um potencial de realização de -70 mV (protocolo à direita). Tensões foram corrigidos para um potencial de junção 10 mV líquido. Resistência de acesso foi a 9 mohms. Qualquer compensação por resistência em série ou capacitância de membrana foi empregado.

Tabela 1. Similar propriedades elétricas de controle vs GFP-transfectadas células piramidais (fatias de rato p10; fatia organotípicas: 3-4 dias in vitro). Média + erro padrão da média (número de células). RMP = potencial de repouso da membrana, Rn = resistência de entrada, AP = potencial de ação; V = limiar de tensão para a AP; HW = largura a meia amplitude AP.

Tratamento	PGR (mV)	Rn (mohms)	AP amplitude	V (mV)	HW (ms)
Controle	-72 ± 1 (21)	119 ± 17 (11)	84 ± 2 (24)	-45 ± 1 (21)	1,7 ± 0,1 (19)
GFP apenas	-77 ± 1 (9)	123 ± 7 (5)	87 ± 2 (24)	-45 ± 2 (9)	2,1 ± 0,2 (7)

Tabela 2. Mídia comercial. Estes meios são comprados e usados ​​sem modificações (Suas composições estão disponíveis on-line do fabricante).

¹ Lave Media: MEM (GIBCO # 12360)
Meios de Cultura: 20 mL HMEM ¹ (Lonza BioWhittaker), + 10 mL HBSS1 (Gibco, 24020-117) + 10 mL cavalo serum1 (Hyclone # SH 30.074,03)

Tabela 3. Soluções (concentrações em mM).

Solução de corte: 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl _2, MgCl 2 _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 glicose (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Artificial Líquido Cefalorraquidiano ACSF (gravação externa): 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl _2, MgCl 2 _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 20 glicose (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Gravação interna (current-clamp): 130,5 KMeSO4, 10 KCl, 7,5 NaCl, MgCl 2 _2, 10 HEPES, 2 ATP, GTP 0,2, 0,1 EGTA (pH 7,2, 285-295 mOsm / L).
Gravação interna (tensão-clamp): 55 KMeSO _4, 55 KOH, 2 MgCl _2, 20 HEPES, 6-fosfato de creatina, 4 ATP, GTP 0,5, 10 BAPTA, 0,1 leupeptin (pH 7,2, 285-295 mOsm / L).

Discussion

Temos vindo a estudar os papéis expressão e funcional de voltagem dependentes canais de potássio em neurônios piramidais do neocórtex de ratos (4, 9-11). Devido à falta de agentes farmacológicos específicos para estes canais, usamos uma abordagem genética para manipular a expressão do canal (1,14,15,17-19). Nós utilizamos uma preparação organotípicas cultura (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificado a partir da abordagem de Stoppini et al (16), a fim de manter a morfologia das células eo padrão laminar do córtex. Nós isolar aguda fatias neocortical pós-natal em dia 17/06 e manter as fatias em cultura por 2-7 dias. Isso nos permite estudo semelhante com idades entre os neurônios para aqueles em nosso trabalho com fatias aguda e minimiza o desenvolvimento de exuberante conexões excitatórias nos fatia. Nós gravar a partir de visualmente identificados neurônios piramidais em camadas II / III ou V com uma iluminação de infravermelho (IR) e microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) com grampo toda célula patch em corrente ou tensão-clamp. Biobalística transfecção (Gene gun) do tipo selvagem ou mutante DNA canal de potássio é usado para manipular a expressão dos canais para estudar sua função (1,14,15,17). Por co-transfecção com cDNA de GFP, as células transfectadas são facilmente identificados em microscópio de epifluorescência. Nós comparamos as gravações de células transfectadas com adjacentes, os neurônios untransfected na mesma camada da mesma fatia (1,17).

Nenhum dos procedimentos cobertos aqui são difíceis, no entanto a atenção para alguns detalhes pode melhorar significativamente os resultados. Em nossas mãos, a viabilidade celular é melhor quando as culturas são feitas de fatias de ~ P8-P10 animais. É importante manter semi-estéril condições durante o corte e cultivo de fatias. Para evitar a contaminação bacteriana, nós autoclave os instrumentos e limpar a área cirúrgica com luz UV e EtOH, soluções de filtro, usar luvas e luvas mudança entre a remoção do cérebro e as fatias de fazer. As conseqüências da contaminação bacteriana incluem viabilidade tecidual pobres ea necessidade de descontaminar as incubadoras. Tal como acontece com todas as fatias do cérebro, a viabilidade é melhorada, minimizando o tempo entre o sacrifício do animal e corte. O cérebro deve ser colocado e corte deve ser feito com o cérebro submerso em uma pasta gelada da Solução de corte. Slice em marcha lenta, com a vibração de baixa amplitude horizontal da lâmina.

Outro problema potencial é a secagem de fatias de tempo na incubadora. Secagem pode ser minimizado através da preparação de fatias que são pequenas: restrita ao córtex de interesse e um pequeno pedaço de striatum (para fins de orientação). Fatias grandes tendem a secar na incubadora e é mais difícil a obtenção de condições de gravação estável com fatias grandes. Fatias são cortadas em 250-300 mm de espessura. Nós achamos que fatias mais finas (nós preferimos 250 mm) resultar em secagem menos. Ao transferir as fatias da solução de corte para a incubadora, lavamos fatias várias vezes, primeiro no Media Lavar e, em seguida, em meio de cultura. É importante para remover o excesso de fluido após a transferência para a membrana (para permitir a fatia para anexar ao mesh). Para cortes mais finos (por exemplo, 300 mm), uma única gota de Meios de Cultura passeado em cima da fatia (enquanto ele está sentado na membrana) ajuda a evitar a secagem. Este procedimento parece nobre o movimento de mídia úmida a superfície superior da fatia. Substituindo os meios de cultura todos os dias também impede a secagem e promove a viabilidade.

Materials

Surgery / transfection / culture: Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413) disposable supplies for Helios from Bio-Rad: 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264 Tefzel Tubing: #165-2441 Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766). Media: Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321) HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525) Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132. Recording: Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949 Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 lectrode position is controlled with Sutter R–-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).