Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hela Cell Spela in från en Organotypic Slice Beredning av neocortex

Published: June 3, 2011 doi: 10.3791/2600
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center

Summary

Detta är ett protokoll för att förbereda och upprätthålla en hjärnbarkens skiva beredning i organotypic kulturen för att göra elektriska inspelningar från pyramidala nervceller.

Abstract

Vi har studerat uttrycket och funktionella roller spänningskänsliga kaliumkanaler i pyramidala neuron från råtta neocortex. På grund av bristen på specifika farmakologiska medel för dessa kanaler har vi tagit en genetisk strategi för att manipulera kanal uttryck. Vi använder en organotypic kultur förberedelse (16) för att upprätthålla cellmorfologin och laminära mönster av cortex. Vi isolerar vanligtvis akut hjärnbarkens skivor på postnatal dagar 8-10 och underhålla skivor i kultur för 3-7 dagar. Detta ger oss möjlighet att studera nervceller vid samma ålder med dem i vårt arbete med akut skivor och minimerar utvecklingen av översvallande excitatoriska anslutningar i segmentet. Vi spela in från visuellt identifierade pyramidformade nervceller i lager II / III eller V med hjälp av IR-belysning (IR-) och differential interferens kontrast mikroskopi (DIC) med hela cell patch clamp i ström-eller spännings-klämma. Vi använder biolistic (Gene pistol) transfektion av vildtyp eller mutant kaliumkanal DNA att manipulera uttrycket för kanalerna för att studera deras funktion. De transfekterade cellerna är lätt identifieras av epifluorescence mikroskopi efter samtidigt transfektion med cDNA för grönt fluorescerande protein (GFP). Vi jämför inspelningar av transfekterade celler till angränsande, untransfected nervceller i samma lager från samma skiva.

Protocol

1. Förberedelser före den dag då Skivning

Vi tycker att det är mer effektivt att autoklaveras kirurgiska instrument och förbereda lösningar före dagen för skivning.

  1. Autoklav instrument. (Den kirurgi och skivning sker under semi-sterila förhållanden). Autoklav följande paket, individuellt förpackade i autoklav papper:
    • Kirurgi paket: spatel, # 22 skalpell blad handtag, sax, pincett
    • Skivning paket: 3 vred (blad-Holding ratten och 2 bad-säkra knoppar) och sprängskydd (rymmer rakblad från slicer: Campden Vibroslice, # MA572), individuellt förpackade (eftersom det kommer att placeras i frysen) måttbeställda metall kammare ( provet bad) för slicer (tillverkarens plexiglas man inte tål upprepad autoklavering), hemostat, sax, pincett.
    • Glas paket: två 50 ml bägare och en 25 ml bägare
  2. Alikvotera häst serum (Hyclone donator häst # SH 30.074: Thermoscientic). Alikvotera ~ 11 ml hästserum i 15 ml koniska rör. (10mL serum behövs. Därför att bubblor bildas när serum är tinat, du behöver 11 ml som vill aspirera kravet på 10 ml). Förvara alikvoteras serum i -20 ° C frys.
  3. Delmängd medier. Efter att media flaskor öppnas, de är bara stabil i ~ 4 veckor (på grund av pH-förändringar). Den skivor överlever bättre med färska medier.
    • Vi använder tre typer av kommersiellt tillgängliga media (köpt i 500 ml flaskor), plus häst serum. Medierna är: HMEM (Lonza Biowhittaker Minimal Essential Media plus HBSS och HEPES, ingen glutamin: Katalog # 12-137F), HBSS (GIBCO Hanks saltlösning, # 24.020-117) och MEM (GIBCO minimal viktigt medium # 12.360 - 038). Se tabell 2.
    • För varje av de tre typerna av media (HMEM, HBSS och MEM), alikvot ~ 50 ml från en 500 ml flaska medier i vart och ett av fyra 50 ml koniska rör. Parafilm alla slangar efter alikvotering. Förvara MEM i kylskåpet och förvara HMEM och HBSS i rumstemperatur.
    • Kulturen medier består av en blandning av häst serum, HMEM och HBSS (se nedan, tabell 2). MEM används som tvätt medier.
  4. Gör lösning för kapning (tabell 3). Den lösning för kapning består av (i mm): NaCl 125, 3 KCl, NaH 2 PO 4 1,25, NaHCO 3 26, 2 mm CaCl 2, 2 mm MgCl 2, och 20 mm glukos. Vi gör normalt 250 ml (tillför volym i mätkolv). Kontrollera osmolalitet (ska vara ~ 310) och pH (7,2-7,3).

Efterföljande steg (# 2 och # 3) utförs på dagen för skivning.

2. Kirurgi, skivning och Organotypic kultur

Det är viktigt att utföra operationen på en annan plats jämfört med alla andra förfaranden. Vi använder ett vakuum (rök) huva för operation för avlägsnande av hjärnan. Ett laminärt flöde huva används för ingrepp i semi-sterila förhållanden, t.ex. skivning och manipulationer av skivor och lösningar.

  1. Förbered lösningar. (Dessa förfaranden behöver inte utföras under sterila förhållanden som lösningar kommer att filtreras i ett senare steg.).
    1. Förbered lösning för kapning (tabell 3). Bubble lösningen med en blandning av 95% O 2 / 5% CO 2 i minst 20 minuter (för att stabilisera pH och se till att alla salter i lösning). Tillsätt 1 mM pyrodruvsyra (metabolisk hämmare) and0.6 mM askorbat (antioxidant).
    2. Tina en delmängd av häst serum (11 ml).
  2. Förbered huva laminärt flöde (bära handskar för alla förfaranden, mätta handskar med EtOH). I detta avsnitt förbereder vi arbetsområdet för att ge en ren, semi-sterila arbetsplats. Vi kommer också att filtrera lösningar för att sterilisera dem.
    1. Använd UV-ljus för ~ 1 timme för att sterilisera arbetet utrymme inom laminär huven (UV-ljus kan skada plastdelarna så vi täcker theCampden Vibroslice vi använder för att skiva, se nedan). Rengör alla ytor med 70% EtOH (utom plasthandtag av slicer: EtOH skadar). Också normalt finns under laminärt luftflöde huven är pipetter och pipetter, EtOH flaska, lim, och slangar kopplade till 95% O 2 / 5% CO 2 och 100 O 2.
    2. Placera följande under laminärt luftflöde huven:
      • Autoklaveras skivning paket
      • 250 ml lösning för kapning
      • Millipore Express Plus-filter: 250 ml [0,2 ìm filter (# SC6PU02RE) för att filtrera lösning för kapning]:
      • Kultur Media Components:
        • 20 ml HMEM
        • 10 ml HBSS
        • 10 ml hästserum
      • Glas-paketet: autoklaveras bägare
      • 50 ml av MEM tvätta medier
      • Pipetter (DrummondPipettera-stöd)
      • Sju plast överföringspipetter (Fisher # 13-711-20). Dessa används för att överföra skivor och lösningar, samt fungera som kanal för gas-lösningar (O 2, 95% O 2 / 5% CO 2) för bubblande lösningar och media.
      • Cyanoakrylat lim
      • Rakblad eller sax (att klippa plast).
      • Sterila # 22 skalpell blad
      • Millicell cellkultur insatser (0,4 ìm, 30 ìm diameter, # PICM 03.050) 3 skär för varje 6-brunnar
      • 6-samt kultur skylt (ar) (Corning: Costar # 3516)
    3. Filtrera förberett 250 ml Cutting med en 250 ml Millipore filter (se ovan).
      Alikvotera 40 ml lösning för kapning i en 50 ml bägare. Placera 40 ml alikvot av lösning för kapning och 210 ml resterande lösning för kapning i frys (-20 ° C). Målet är att använda dessa lösningar som ett slaskigt blandning vid ~ 4 ° C för att få hjärnan efter avlägsnats från skallen (40 ml i bägare) och för att klippa (210 ml).
    4. Placera metall skivning kammare (täckt med autoklav papper) i -20 ° C frys. Detta hjälper till att hålla lösning för kapning och hjärnan kall under skivning.
    5. Förbered Kultur Media och tas i brunnar (inte bubbla Kultur Media - det kommer skum).
      • Förbered 40 Media ml kultur i 50 ml plast centrifugrör:
        • Blanda 20 ml HMEM + 10 ml HBSS + 10 ml alikvot av häst serum (tabell 2)
        • Filter Kultur Media (att sterilisera) med 50 ml Millipore steriflip 0,22 mikroM filter (# SCGP00525).
      • Placera 1,1 ml Media Kultur i 3 diagonalt placerade brunnar i en 6-brunnar (Corning: Costar # 3516 6 och kultur kluster). Placera 6-brunnar / Kultur Media i 37 ° C inkubator i minst en timme.
    6. Med steril sax eller rakblad, förkorta 4 av överföringen pipetter (använd för att överföra skivor). Snittet röret slutar används utan ytterligare ändringar för att skingra gaser bubblar lösningar. Dessa rör ansluter linjerna från tankar på 95% O 2 / 5% CO 2 eller 100% O 2 till lösningar.
    7. Filter Tvätta Media (50 ml) med 50 ml Millipore steriflip 0,22 mikroM filter (# SCGP00525). Placera Tvätta Media i kylskåp.
  3. Förberedelse för operation. Lösningarna måste vara redo att acceptera i hjärnan efter operationen (vakuum huva) och att tillåta snabba skivning och förberedelse för kultur (laminärt flöde huva). Vi utför operationen i ett vakuum huva. Det är viktigt att operationen utförs i ett separat område för att hålla hår och kroppsvätskor från semi-sterila laminärt flöde huva.
    1. Förbered media och lösningar.
      • Ta ut 50 ml bägare med 40 ml lösning för kapning från frysen och sätta i vakuum huven för att få hjärnan efter borttagning från skallen. Häll ~ 10 ml av Kallskärning lösning i en 25 ml bägare. Detta kommer att användas för att transportera hjärnan att laminärt flöde huva.
      • Ta 210 ml Cutting från frysen och sätta i laminärt flöde huva (för att skiva och skiva insamling).
      • Ta bort metall skivning kammare från frysen och sattes under laminärt flöde huva.
      • Bubble både skära lösningar med 95% O 2 / 5% CO 2 (använd skära plast överföringspipetter att ansluta slangen till lösning).
    2. Placera följande poster under vakuum huven (30 ml lösning för kapning är redan närvarande och bubblande med 95% O 2 / 5% CO 2):
      • autoklaveras 25 ml bägare
      • Autoklaveras kirurgiska instrument, handskar, pincett
    3. Ta bort Tvätta Media från kylskåp och bubbla med 100% O 2 (användning i slutet av klipp plast överföringspipetten att ansluta slangen till lösning).
  4. Operationen (utförs under vakuumflöde huva). Detta steg krävs för att ta bort hjärnan för efterföljande skärning. Det är viktigt att minimera tiden mellan att offra djur och placera hjärnan i kallt, syrerikt lösning för kapning. Det är också viktigt att minimera trauma mot hjärnan. Alla förfaranden godkändes av Animal skötsel och användning kommittén, University of Tennessee, Health Science Center.
    1. Vi använder Sprague-Dawley råttor från P6-P17 (vi föredrar P8-P10). Placera råttan till säkerställda 2-4 L plastbehållare. För anestesi, är ~ 1 ml isofluorane tillämpas på en bit gasbinda som sitter under en plast-nät (så att bedövning inte kontaktar djur). Bedöva råtta med isofluran till dess att djuret areflexive. Mätta handskar med EtOH.
    2. När råttan är sövda, halshugga djuret med stora skalpell, och ta bort hjärnan. Sätt hjärnan ibägare som innehåller 30 ml kallt (~ 4 ° C) Cutting lösning ~ 30 sek. Töm hjärnan till 25 ml bägare för att minimera överföring av hår eller blod laminärt flöde huva.
    3. Byt handskar (mätta med EtOH).
    4. Överföring hjärnan i kalla Cutting lösning (25 ml bägare) till laminärt flöde huva.
  5. Skiva hjärnan och förbereda sig för kultur. I detta steg vi orienterar hjärnan, ta bort onödiga hjärnvävnad, och klippa och samla hjärnan skivor. Vi tvättar sedan skivor, placera varje skiva på en maska ​​in, placera Mesh-inläggningar i 6-väl odlingsplattor, och överföra plattorna (med skivor) till inkubatorn för kulturen.
    1. Orient och blockera hjärnan (ta bort lillhjärnan och främre stolpen, gör delvis mitten sagital skära ~ halvvägs från frontala cortex slutet Detta möjliggör samtidig skärning av två skivor -. En från varje halvklotet - men fortfarande behåller både hemsipheres tillsammans på den bakre änden på en stabil bas att limma på scenen). Limma blockerade hjärnan på scen med cyanoakrylat. Placera hjärnan med frontala cortex upp och skär koronala skivor av frontoparietal cortex. Gör ytterligare skalpell skär som behövs för att begränsa storleken på skiva.
    2. Placera scenen med hjärnan i steriliserade metall skivning kammare (som är knuten till den vibrerande vävnad skivare) och fyll bad med iskall, bubblande lösning för kapning. Häll ~ 30 ml av återstående lösning för kapning i en 50 ml bägare (för att samla skivor i) och bubbla med 95% O 2 / 5% CO 2.
    3. Skär 250-300 ìm skivor med en vibrerande vävnad slicer (Campden Vibroslice # MA572: World precisionsinstrument, Sarasota, FL, USA). Placera skivor i bägare som innehåller 30 ml skärning. Samla det antal skivor du vill kultur (vanligtvis 3-6), plus några extra.
    4. Tvätta Slices: Placera ~ 2 ml Tvätta Media i ett 35 mm plast petriskål. Överför alla skivor från lösning för kapning till plast petriskål med Wash Media. Tvätta skivor 3 gånger med färska Wash Media varje gång. Använd separata överföringspipetter att överföra skivor, lägg till media och aspirera avfall lösningar.
    5. Överföring skivor till Kultur Media (i en annan 35 mm plast petriskål, nya överföringspipett). Ta bort toppar ur förpackningen för Mesh-inläggningar, men lämna insatserna i förpackningen.
    6. Överför Slices från kultur Media för att Mesh-inläggningar (med cuttransfer pipett): Position skivor i mitten av insatsen (Figur 1A). En liten bit av Kultur Media kommer tillsammans med slice. Använda en intakt överföringspipett, ta bort överskottet Kultur Media direkt efter att placera bit ner på insatsen. Försök att placera bit i mitten av insatsen (detta underlättar biolistic transfektion och gör det lättare att ta bort skiva för senare inspelning).
    7. Placera gallerinsats / skiva i Kultur Media i 6-brunnar (Figur 1B). Var noga med att förhindra att luftbubblor bildas under mesh.When 3 insatser / skivor är i 6-brunnar, plats 6-brunnar tillbaka i kuvös. Inkubera skivor i 37 ° C inkubator för ~ 1 timme.
  6. Transfektera skivor med hjälp av Gene Gun (Bio-Rad Helios). Detta kan göras omedelbart efter skivning och placering på mesh i 6-brunnar, men vi inkubera vanligtvis under 1 timme vid 37 ° C för att stabilisera skivor och sedan transfektera cellerna. För detaljerade protokoll för att göra cDNA "kulor" och med hjälp av Gene Gun, se Refs. 17-22.
    1. Ladda plast "cartidges" som innehåller "kulor". (Vi hänvisar till cDNA-belagda guldpartiklar som punkter. Alltså, många kulor finns i en plast "patron".). Lämna den första positionen fri (ingen "patron"). Ladda varannan position med kassetten som innehåller cDNA-belagda kulor. Placera filterhållaren i gen pistol.
    2. Klart pistol genom bränning fat utan kassett.
    3. Advance fat till en med patronen. Ta bort 6-brunnar från inkubatorn och rum under laminärt luftflöde huven. Håll pistolen strax ovanför toppen av 6-brunnar. Håll vertikala. Skjut på ~ 100 psi.
    4. Advance fat, klar, upprepa. Ett skott per skiva.
    5. Efter fotografering, tillbaka 6-brunnars plattor med skivor / skär till inkubatorn.
  7. Kultur skivor (under semi-sterila förhållanden). Alla manipulationer av skivor och 6-brunnar bör utföras med handskar mättad med EtOH och under laminärt flöde huven, efter rengöring område med EtOH. Vi kultur skivorna för olika tidsperioder (vanligtvis 2-7 dagar) för att tillåta återhämtning från den akuta skivning förfarandet och att ge tid för transfektion leda till nya proteiner.
    1. Kultur för 2-7 dagar (37 ° C, 5% CO 2) i inkubator (Forma vetenskaplig modell # 3110).
    2. Byt media varannan dag: Lägg till nya medier till de tre tomma brunnar, byt i inkubator i minst 1 timme. Flytta slice / membran till nya bra med EtOH rengjord böjd pincett. Aspireragamla medier. Återgå plattan inkubator.

3. Spela in från pyramidala celler i skivor

Det är utanför ramen för detta protokoll för att ge detaljerade instruktioner på hela tekniker cell inspelning. Vi ger information om hur man överför skivor på inspelningen kammaren och ge information om vår inspelning av set-up, särskilt som avser att identifiera transfekterade celler för inspelning.

  1. Vi drar elektroder från Harvard GC150TF-10 glaset med en Sutter P-87 horisontella avdragare. Elektroder 2-6 Mohm i det extracellulära lösningen. Elektroder är fyllda med en KMeSO 4 interna (se tabell 3).
  2. Använd handskar. Ta bort 6-brunnar från inkubatorn. Under laminärt flöde huven, försiktigt bort en slice / gallerinsatsen med EtOH rensade, böjd pincett. Byt 6-brunnar i kuvös och överföra skiva som skall spelas in från till inspelningen området. I vårt fall är detta på ett annat laboratorium. Vi utför insatsen / skiva i en täckt 35 mm plast petriskål. Efter detta steg, handskar behöver inte användas (ingen möjlighet att förorena kulturer eller inkubator).
  3. Klipp bort membran med # 11 skalpell. Klipp mot spänning levereras av tång eller flexibla metall bar. (Det kan bli nödvändigt att avsluta den sista snitt med en sax). Använd pincett, överföra skiva med vidhängande nät till inspelningen kammaren på scenen av en Olympus BX50 WI upprätt mikroskop.
  4. Vi använder en Axon Instruments Multiclamp 700B förstärkare och dataprotokoll förvärv i PClamp 10. Elektrod position kontrolleras med Sutter ROE-200 manipulatorer och PC-200 controller. Vi använder en Olympus BX-50WI upprätt mikroskop med IR-DIC optik att visualisera pyramidala nervceller i lager II / III eller V. Vi använder en IR-känslig kamera (Olympus OLY-150 eller DAGE-MTI) och ProVideo 1201B övervaka att visualisera cellerna i segmentet. Skivor badar i carbogenated konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF: Tabell 3) levereras vid 2-3 ml / min vid 33 ± 1 ° C.
    Vanligtvis hittar vi 10-50 transfekterade celler per skiva. Celler finns vid lookingthrough mikroskop okularet och använda epifluorescence med ett FITC-filter (monteras på ett filter hjul i ett torn monteras ovanför mål och under okularet i mikroskop). Detta ger oss möjlighet att enkelt växla mellan IR-DIC och epifluorescence att bestämma celltyp, att cellen är transfekterade (cell visas i grönt i epifluorescence och innehåller en kula), och att cellen är frisk (cell är 3-dimensionell och har slät yta , kärnan inte svullna, cellen inte svullna eller krympta).
    Vi riktar pyramidformade nervceller i lager II / III eller V (se figur 1). Pyramidala celler identifieras genom närvaron av en apikal Dendrite stigande mot lagret jag, många Dendritutskotten och päronformad soma. Layer bestäms av celltäthet och plats i förhållande till Pia. Generellt transfekterade cellerna på ytan av den del kommer inte att vara friska. Även om det är svårare att visualisera celler djupt i organotypic skiva än med akut skivor, vi generellt kan visualisera friska, transfekterade celler från 20 till 50 ìm under segmentet ytan. Vi använder oss av normala hela metoder cell inspelning. Vi närmar cell under visuell vägledning och med positiva trycket i spänning-klämma. Tätningar förvärvas med skonsam sugkraft (med 1 ml spruta) under spänning-klämman. Efter att uppnå en GΩ tätning, är ytterligare sug används för att bryta in i cellen. Vi utför sedan inspelningarna i antingen ström-eller spännings-klämma.
    I slutet av inspelningen, vi kontrollera att den inspelade cellen är grön, innehåller en kula, och synligt reagerar negativt eller positivt tryck. Att kontrollera för variation mellan skivor, lager cell, ålder vid tidpunkten för operation, och tid i kultur, par vi alltid våra inspelningar av transfekterade celler med inspelningar från untransfected styra celler från samma lager och ligger med 50 ìm av transfekterade cellen.

4. Representativa resultat:

Figur 1a visar ett akut beredd skiva sitter på membranet för att infoga en 6-brunnar för odling. Denna skiva innehåller motor och somatosensoriska cortex från en P10 hos råttungar. PIA är till höger om figuren, med vit materia och striatum till vänster. Figur 1B visar slice / membran i brunnen, nedsänkta i ~ 1,1 ml Kultur Media. Vårt mål för organotypic kultur är att behålla det normala laminärt mönster av hjärnbarken, förhindra ytan torka under kultur, och i slutändan för att producera en hög andel av levande celler i segmentet efter flera dagar i kulturen som kan spelas in från (cellerna inte skrumpna eller svullen, minimal svullna cellkärnor, glänsande och tredimensionella utseendet på cellerna i IR-DIC optik). Figur 1C visar IR-DIC och epifluorescence bilder av ett lager III pyramidliknande neuron i ett organotypic bit av somatosensoriska cortex efter 3 dagar ikultur (från P10 djur). Figur 1D är en epifluorescence bild av en annan skiva, som visar flera celler lager V transfekterade med cDNA för GFP (grönt celler).

Figur 2 visar representativa spår i ström-och spännings-clamp inspelningar från ett lager V pyramidal cell efter organotypic bit kultur i 3 dagar (P10 djur). Figur 2a visar en potentiell överskridande åtgärd (AP). Figur 2B visar repetitiva urladdningar som svar på en 2 s, 400 pA konstant ström injektion. Dessa spår visar normala elektrofysiologiska egenskaper hos en vanlig tillsatta lager V neuron (se även tabell 1). Figur 1C är en spänning-clamp inspelning från ett lager V pyramidformade neuron i närvaro av en mikroM tetrodotoxin (TTX) för att blockera spänningskänsliga Na + strömmar. Spåren är en familj av strömmar som svar på 500 ms spänningen steg från en anläggning potential -70 mV till olika potentialer mellan -90 mV och 70 mV (vid 10 mV mellan stegen).

Figur 1
Figur 1. Organotypic bit kultur. A. Skiva av råtta sensomotoriska cortex från P10 råtta på Millicell filter mesh insats. Pia är till höger, djupa vita substansen och striatum till vänster. Mittlinjen ligger på den övre kanten. B. Tre slice och Mesh-inläggningar nedsänkt i ~ 1 ml Kultur Media och placeras i icke angränsande brunnar av 6-brunnar (samma djur som i A). C. IR-DIC (övre) och epifluoresent (lägre) bilder av lager III hjärnbarkens pyramidal cell i organotypic kultur (P10 djur, 3 dagar i kultur). Note "bullet" syns i DIC bild (svart sfär). D. Fluorescerande bild av flera skikt V nervceller efter biolistic transfektion med cDNA för GFP.

Figur 2
Figur 2. Inspelningar från hjärnbarkens pyramidala celler i organotypic bit kultur. A. Action potential i lager III pyramidala celler (från P10 djur, efter 3 dagar i kultur) som svar på suprathreshold 10 ms aktuella injektion. B. repetitiva urladdningar från en annan, lager V pyramidala neuron (P10 råtta, 3 dagar i kultur) som svar på en 2 s, 400 pA aktuella injektion. Detta var en vanlig spetsa neuron. C. Spänning-clamp spela in från ett annat lager V pyramidala neuron (P10 råtta, 3 dagar i kultur). 1 mikroM TTX var närvarande för att blockera spänningskänsliga Na + ström. Utåt, K + strömmar som svar på en familj på 500 ms spänningen steg från en anläggning potential -70 mV (protokoll till höger). Spänningar korrigerades för en 10 mV vätska junction potential. Tillgång motstånd var ~ 9 Mohm. Ingen ersättning för serie motstånd eller membran kapacitans var anställd.

Tabell 1. Liknande elektriska egenskaper av kontroll kontra GFP-transfekterade pyramidala celler (skivor från P10 råtta, organotypic slice: 3-4 dagar in vitro). Medelvärde + standardfel Medelvärde (antal celler). RMP = vila membranpotential, Rn = Ingångsresistans, AP = aktionspotential, femte = spänningen tröskeln för AP, HW = AP bredd vid halva amplitud.

Behandling RMP (mV) Rn (Mohm) AP amplitud Femte (mV) HW (ms)
Kontroll -72 ± 1 (21) 119 ± 17 (11) 84 ± 2 (24) -45 ± 1 (21) 1,7 ± 0,1 (19)
GFP bara -77 ± 1 (9) 123 ± 7 (5) 87 ± 2 (24) -45 ± 2 (9) 2,1 ± 0,2 (7)

Tabell 2. Kommersiella medier. Köps och används omodifierad (Deras kompositioner är tillgängliga on-line från tillverkaren) Dessa medier.

1 Wash Media: MEM (GIBCO # 12.360)
Kultur Media: 20 ml HMEM 1 (Lonza Biowhittaker), + 10 ml HBSS1 (Gibco, 24.020-117) + 10 ml häst serum1 (Hyclone # SH 30074,03)

Tabell 3. Lösningar (koncentrationer i mM).

Kapning Lösning: 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20 glukos (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Konstgjord cerebrospinalvätska aCSF (extern inspelning): 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20 glukos (pH 7,4, 310 mOsm / L).
Intern inspelning (current-klämma): 130,5 KMeSO4, 10 KCl, 7,5 NaCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 ATP, 0,2 GTP, 0,1 EGTA (pH 7,2, 285-295 mOsm / L).
Intern inspelning (spänning-clamp): 55 KMeSO 4, 55 KOH, 2 MgCl 2, 20 HEPES, 6 kreatin fosfat, 4 ATP, 0,5 GTP, 10 BAPTA, 0,1 leupeptin (pH 7,2, 285-295 mOsm / L).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har studerat uttrycket och funktionella roller spänningskänsliga kaliumkanaler i pyramidala neuron från råtta neocortex (4, 9-11). På grund av bristen på specifika farmakologiska medel för dessa kanaler, använder vi en genetisk metod för att manipulera kanal uttryck (1,14,15,17-19). Vi använder en organotypic kultur förberedelse (2,3, 5-8, 12,13,15-22). Ändras från den strategi Stoppini et al (16), i syfte att upprätthålla cellmorfologin och laminära mönster av cortex. Vi isolerar akut hjärnbarkens skivor på postnatal dagar 6-17 och underhålla skivor i kultur för 2-7 dagar. Detta ger oss möjlighet att studera liknande åldern nervceller dem i vårt arbete med akut skivor och minimerar utvecklingen av översvallande excitatoriska anslutningar i segmentet. Vi spela in från visuellt identifieras pyramidformade nervceller i lager II / III eller V med hjälp av IR-belysning (IR-) och differential interferens kontrast mikroskopi (DIC) med hela cell patch clamp i ström-eller spännings-klämma. Biolistic (Gene pistol) transfektion av vildtyp eller mutant kaliumkanalen DNA används för att manipulera uttrycket för kanalerna för att studera deras funktion (1,14,15,17). Genom att samarbeta transfektion med cDNA för GFP, är de transfekterade cellerna lätt identifieras i epifluorescence mikroskopi. Vi jämför inspelningar av transfekterade celler till angränsande, untransfected nervceller i samma lager från samma skiva (1,17).

Ingen av de förfaranden som omfattas här är dock svårt uppmärksamhet på några detaljer kan avsevärt förbättra resultaten. I våra händer är cellviabiliteten bäst när kulturer görs från skivor från ~ P8-P10 djur. Det är viktigt att upprätthålla semi-sterila förhållanden under skivning och odling av skivor. För att förhindra bakteriell förorening, autoklav vi instrumenten och rengör kirurgiska området med UV-ljus och EtOH, filterlösningar, handskar slitage och handskar växla mellan borttagning av hjärnan och göra skivor. Konsekvenserna av bakteriell kontamination inkluderar dålig vävnad livskraft och nödvändigheten av att sanera inkubatorer. Som med alla hjärnan skivor, är lönsamheten förbättras genom att minimera tiden mellan offer av djur och skivning. Hjärnan ska placeras och skivning bör göras med hjärnan nedsänkt i en iskall slam av lösning för kapning. Skär vid låg hastighet, med låg amplitud horisontella vibrationer av bladet.

Ett annat potentiellt problem är uttorkning av skivor medan i inkubatorn. Torkning kan minimeras genom att förbereda skivor som är små: begränsad till cortex av intresse och en liten bit av striatum (för orientering ändamål). Stora skivor tenderar att torka ut i inkubatorn och det är svårare att få stabila inspelningsförhållanden med stora skivor. Skivor skärs vid 250-300 ìm tjock. Vi finner att tunnare skivor (vi föredrar 250 mikrometer) resultera i mindre torkning. Vid överföring skivor ur lösning för kapning till inkubatorn, tvätta vi skivor flera gånger, först i Wash Media och sedan i Kultur Media. Det är viktigt att ta bort överflödig vätska efter överföring till membranet (så att slice att fästa nätet). För tjockare skivor (t ex 300 mikrometer), en enda droppe Kultur Media tempo ovanpå slice (när den sitter på membranet) hjälper till att förhindra uttorkning. Detta förfarande tycks främsta förflyttningen av fuktiga materialet till toppen yta skiva. Byta Kultur Media varannan dag också förhindrar uttorkning och främjar livskraft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Mayumi Sakuraba och Rebecca Foehring för enastående tekniskt bistånd. Dessutom vill vi tacka Dr. Rodrigo Andrade för att få hjälp med att genomföra organotypic slice kultur och biolistic protokoll transfektion och Dr Jeanne Nerbonne för att förse oss med cDNA konstruktioner för transfektion. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag: NS044163 från NINDS (för RCF).

Materials

Surgery / transfection / culture:

  1. Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
  2. Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
    • Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
    • Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
    • disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
      • 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
      • Tefzel Tubing: #165-2441
  3. Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766).

Media:

  1. Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
  2. HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  3. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  4. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  5. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
  6. Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
  7. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)

Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.

Recording:

  1. Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
  2. Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
  3. Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  4. PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  5. lectrode position is controlled with Sutter R–-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
  6. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
  7. IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R–ske Avenue, Michigan City, IN 46360).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).
  2. Buonomano, D. V. Timing of neural responses in cortical organotypic slices. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).
  3. Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex. Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).
  4. Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons. Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).
  5. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
  6. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).
  7. Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
  8. Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue. Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).
  9. Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones. J Physiol. 571, 371-389 (2006).
  10. Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).
  11. Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons. J Physiol. 581, 941-960 (2007).
  12. Johnson, H. A., Buonomano, D. V. A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes. Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).
  13. Johnson, H. A., Buonomano, D. V. Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices. J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).
  14. Malin, S. A., Nerbonne, J. M. Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons. J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).
  15. O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
  16. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  17. Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons. J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).
  18. Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons. J Neurochem. 75, 882-885 (2000).
  19. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
  20. O'Brien, J. A., Lummis, S. C. Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun. Nat Proc. 1, 977-981 (2006).
  21. Joshi, P., Dunaevsky, A. Gene gun transfection of hippocampal neurons. J Vis Exp. , (2006).
  22. Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).

Tags

Neurovetenskap 52 Organotypic neocortex somatosensoriska pyramidala celler skiva beredning biolistic transfektion
Hela Cell Spela in från en Organotypic Slice Beredning av neocortex
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Foehring, R. C., Guan, D., Toleman,… More

Foehring, R. C., Guan, D., Toleman, T., Cantrell, A. R. Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex. J. Vis. Exp. (52), e2600, doi:10.3791/2600 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter