Summary
마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.
Abstract
testis의 세포 유형의 이질적인 성격과 meiotic 세포 배양 모델의 부재는 감수 분열 동안 매니 페스트의 독특한 차별화 프로그램의 연구에 상당한 장애물을하고 있습니다. elutriation 또는 Staput (침전) BSA 및 / 또는 percoll 그라디언트를 사용하는 두 가지 주요 방법은, 다양한 도로, 성인 및 미숙 동물 모두에서 다양한 meiotic 분수를 정화하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방법 중 두 세포 크기와 세포 meiotic에게 1-5 분리 밀도에 의존하고 있습니다. 전반적으로, 몇 가지 세포 인구 6 제외하고, 이러한 프로토콜 자세한 분자 분석을 위해 필요한 수많은 meiotic 세포 집단의 충분한 순도를 얻을하지. 또한, 같은 방법으로 meiotic 세포의 보통 한 종류는 meiotic 세포 샘플을 비교했을 때 재현성과 균질성에 관한 복잡한 여분 수준을 추가 주어진 시간에서 정화 수 있습니다.
여기, 우리는 Hoechst 33342 얼룩 7,8와 함께 외과를 사용하여 배아 세포에서 라운드 spermatids로, 하나는 쉽게 시각화 식별하고, meiotic 세포를 정화 수있는 세련된 방법을 설명합니다. 이 방법은 전체 meiotic 프로세스의 전반적인 스냅샷을 제공하며 하나는 높은 감수 분열 대부분의 단계에서 가능한 세포를 정화 수 있습니다. 이러한 정화 전지는 다음 meiotic 재조합 11 핫스팟에서 예제 유전자 발현 9,10의 변화와 nucleosome 인의 역학에 대해, 세포의 감수 분열을 통해 진행을 수반하는 분자 변경 사항을 자세하게 분석할 수 있습니다.
Protocol
이 프로토콜은 두 가지 주요 단계로 분리 수 있습니다 : 필요한 경우 (1) 마우스 testis 세포의 분리와 Hoechst 33342 얼룩이에 의해 배아 세포부터, 감수 분열의 모든 단계를 포함하여 관련 meiotic 분수의 정렬 (2) 외과를 따라 라운드 spermatids. 일단 수집이 매우 풍부한 meiotic 인구는 분석의 광범위한 사용하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 하나의 성인 testis의 분리를 설명, 볼륨 아동 또는 추가 testes에 대해 적절하게 적용할 수 있습니다.
1. Testis 분리
- 15 - ML 튜브에 놓으 decapsulated testis합니다.
- Collagenase 유형 I. 120 U / ML을 포함 Gey의 밸런스 소금 솔루션 3 - ML (GBSS)를 추가
- DNAse I (50 % 글리세롤의 1mg/ml 주식 솔루션) 10 μl를 추가하고 교제를 끊다 시작 고환 tubules가 나타날 때까지 손으로 적극적으로 그것을 흔들어.
- 33 ° C.에 15 분 120 RPM의 최대 가로 선동
- 실온에서 수직으로 1 분 가만히 따르다 및 뜨는 폐기.
- 1.5 단계 1.2를 반복합니다.
- Collagenase 유형 I, 1mM HCL 솔루션, 그리고 DNAse I (1mg/ml) 10 μl에 resuspended 50mg/ml 트립신 주식 솔루션 50 μl를 포함 GBSS 2.5 ML를 추가하고 튜브를 여러 번 반전.
- 33 ° C.에 15 분 120 RPM의 최대 가로 선동
- 넓은 구멍과 플라스틱 일회용 파스퇴르 pipet을 사용하여, 피펫 부드럽게 위아래로 3 min.No의 대단히 짧은 시간을 위해이 시점에서 볼 수 있습니다.
- 트립신 30 μl, DNAse I, DMSO (10 MG / ML)에 resuspended Hoechst 33342 40 μl, 10 μl를 추가하고 튜브를 여러 번 반전.
- 33 ° C.에 15 분 120 RPM의 최대 가로 선동
- 소태아 혈청 (FCS)의 400 μl를 추가하고 트립신을 inactivate로 반전하여 섞는다.
- 최종 얼룩은 Hoechst 33342 50 μl DMSO (10 MG / ML)에 resuspended, 그리고 DNAse I (1 MG / ML) 10 μl를 추가하여 수행됩니다.
- 33 ° C.에 15 분 120 RPM의 최대 가로 선동
- dissociated testis 샘플 후 두 40 μm의 GBSS 통과하는 50 ML 원뿔 관을 통해 사전에 침수 일회용 필터, 일회용 파스퇴르와 함께 여러 번 pipetting하여 솔루션에 추가되고 예제가 부드럽게 혼합합니다 propidium의 요오드화물의 다음 5 μl (PI) 피펫.
- 샘플은 18 게이지 바늘을 통해 5 ML 플라스틱 주사기로 전송됩니다. 후자는 샘플 제공을위한 22 게이지 바늘로 대체됩니다. 주사기는 얼음에 저장하고 빛으로부터 외과 처리를위한 준비까지 보호됩니다.
2. 외과의 설치 및 정제
- 정렬은 백톤 디킨슨 - 아리아 IIu 세포 분류기에서 수행되었다. 다른 장비를 사용하여 특히 설명한 조건에 따라서 시작점으로 사용해야합니다. 우리는 이전에 조건을 사용 7,8 설명했다.
- 아리아 IIu은 UV 레이저를하지 않기 때문에, 우리는 앞으로 측면 산란 감지 488nm 청색 레이저를 사용 이외에 405nm 바이올렛 레이저를 사용하여 Hoescht 얼룩을 검출을위한 프로토콜을 적응. 또한, 일부 필터는 개선 흩어져 플롯 선명도에서 발생하는 몇 가지 빨간색 레이저 leakiness을 제한하기 위해 수정되었습니다.
- 바이올렛 레이저 Hoescht 블루 방출의 검출을위한 450/40nm 밴드 패스와 Hoescht 레드 방출을위한 585/42nm 밴드 패스로 구성되었다. 502nm 긴 패스는 적색 형광에서 파란색으로 구분하는 데 사용되었다.
- 100 μm의 노즐은 28000 방울 / 초의 드롭 드라이브 주파수로 사용되었다. 샘플 임계값 속도는 약 4000 이벤트 / 초되었다. 온도 제어 옵션은 4 샘플 및 수집 튜브를 유지하는 데 사용된 ° C 정렬의 전체 기간. 또한, 샘플 교반 기능은 일종의 전역 sedimenting에서 샘플을 방지하기 위해 200 rpm으로 사용되었다.
- 보통 2-3 testes은 각 인구 0.5 - 2.0x10 6 전지 (대표 섹션을 참조)의 컬렉션을 허용 6시간 정렬마다 처리되었습니다.
- 샘플은 주사기에서 적절 약 750μl의 aliquots으로 정렬되었습니다. 한편, 이러한 일시 중지하는 동안 컬렉션 튜브는 4 유지되었습니다 ° C, 빛으로부터 보호하고, 부드럽게 사전 재개 정렬 혼합.
- 정렬 샘플 10% FCS와 보충 250μl를 포함한 DMEM 12x75mm 유리 borosilicated 수집 튜브에 수집되었다.
3. 대표 결과 :
일반 외과 프로필은 그림 1에 표시됩니다. 감수 분열의 주요 단계를 모두 식별하고 전설에 표시됩니다. Hoechst 33342는 최적되지 얼룩 경우, 글로벌 프로파일은 훨씬 더 컴팩트 나타나고 이하 정의합니다. 일반적인 문제는 급속한 세포 clumping을 유도합니다 충분한 DNAse를 추가하지하시오. 모든 기소 단계에서 추가 DNAse의 추가는 일반적으로이 문제를 해결합니다. 프리즈 일DNAse 주식 (-20 ° C에 저장된)의 awing는 효소 활동의 급속한 손실이 결과로, 최소로 보관해야합니다.
Spo11는 meiotic 재조합 핫스팟 12 사이트에서 더블 스트랜드 나누기를 안내 meiotic endonuclease이다. 그림 2는 전형적인 불임 감수 분열 12 결과 더블 스트랜드 브레이크가 형성되지 않은 Spo11 - NULL testis의 프로필,뿐만 아니라를 보여줍니다 감수 분열의이 첫 번째 물결의 비동기 자연을 밝히지 13 일 옛 마우스, 사전 puberous 프로필입니다. synaptonemal 복잡한 단백질 3 (SCP3) 및 phosphorylated 히스톤 H2AX 항체의 조합을 사용하여 표준 cytogenetic 분석은 무대 특정 세포의 감수 분열의 마커가 처음으로 elswhere 11 설명한 정렬 meiotic 세포의 순수 자연을 확인하는 데 사용해야합니다.
그림 1. 와일드 타입의 감수 분열의 외과 프로필. A) 대표 스캐터 플롯이 표시됩니다. 문이 세포가 표시됩니다. 대부분 비어있는 점막 및 spermatid 꼬리를 포함한 성인 testis에있는 파편의 많은 양의 있습니다. B) 대표 PI의 줄거리는 샘플에있는 PI 긍정적인 세포의 매우 제한된 금액을 보여줍니다. 전형적인 게이트가 표시됩니다. C) 대표 야생 타입 Hoechst 33342 외과 프로필이 표시됩니다. 진학이 방법을 사용하여 정화 수있는 다양한 meiotic 세포 집단이 표시됩니다 : spermatogonia (SP), 사전 leptotene (PL), leptotene - 접합기에 이어지는시기로 (L / Z), 초기 Pachytene (EP), 중간 Pachytene ( MP), 늦은 Pachytene (LP), diplotene (D), 그리고 원형 spermatids (RS).
그림 2. Spo11 - NULL과 야생 형 13 일 meiotic 외과 프로필. A) 일반적인 Spo11 - NULL 프로필 접합기에 이어지는시기로 / leptotene 초기 pachytene 과거의 어떤 단계가 감지 수 없습니다 명확한 meiotic 실패와 표시됩니다. B) 13 일 된 야생 형 남성 마우스의 프로필 leptotene / 접합기에 이어지는시기로 세포의 높은 농도를 나타냅니다. 감수 분열의 첫 번째 물결은 명확하게이 방법을 사용하여 시각, 오히려 비동기입니다.
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Discussion
여기에 제시 프로토콜 사람이 동시에 조사이 근본적인 프로세스의 역학을 연구 수 있도록, 성인 남자 생쥐에서 매우 높은 순도로 meiotic 무대 세포의 전체 범위를 정화 수 있습니다. 정화 세포는 RNA 추출 9,10, nucleosome 매핑 11, 재조합 분자 탐지, 단백질 분석, 그리고 많은 이르기까지 다양한 애플 리케이션에 사용할 수 있습니다. 그러나, 검출 방법은 정화 meiotic 세포의 금액에 적응해야합니다. 또한,이 방법의 높은 재현성과 함께, 그것은 특정 실험에 필요한 재료의 양을 증가하기 위해 다른 일에서 수행 같은 분수의 수영장 여러 독립적인 종류의 수 있습니다. 또한이 방법은 하나가 빠른 속도로 유전자 녹아웃, 발달 진행 수차, 또는 세포의 감수 분열에 영향을 목적으로 특정 치료의 효과 (예, 방사선 조사의 효과를 평가할 수있는 전체 meiotic 프로세스의 독특한 시각적 표현과 함께 조사를 제공하거나, 작은 분자 억제제 치료).
이 프로토콜의 중요한 단계는 (i) 크게 세포 대단히 짧은 시간 및 집계를 피함으로써 셀 정렬을 용이하게 충분한 DNAse, 그리고 효율적으로 meiotic 무대 세포의 다양한 인구를 구별하는 것이 필요합니다 (2) 일관성 Hoechst 33342 얼룩을 사용합니다. 또한, 외과 연산자는 최적의 그림 1과 비디오에 대한 자세한에 표시된 프로필을 얻기 위해 자신의 악기를 설정하기 위해 meiotic 셀 정렬의 세부 사항과 특성을 지닌 자신을 숙지해야합니다. 가능한 수정은 보라색 레이저를위한 최적화된 스테인 새로운 Vybrant DyeCycle 바이올렛 (Invitrogen)를 Hoechst 33342을 대체할 수 있습니다. 그러나, 전체 프로필 크게 변화될 수 없습니다 것입니다. 마지막으로, 그것 때문에 사용하는 조직의 특성, 전형 절차는 1을 것이라는 ½ 시간을 셀 정렬 6 - HR에 meiotic 세포와 4를 준비하는주의하는 것도 중요하다, 또한 추가적인 사후 정렬 조작.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 플로리다 주에서 스크립스 및 보너스 번호는 각각 종합 의료 과학 국립 연구소와 아동 건강 및 인간 발달의 국립 연구소에서 R01GM085079 및 R21HD061304에 돈도에 의해 부분적으로 지원되었다. 이것은 스크립스 연구소의 논문 번호는 20917입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
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