Summary
一种有效的方法，从小鼠睾丸中获得高度纯化的可行减数分裂分数描述，一个精细胞分解协议相结合的荧光激活细胞分选（FACS）。这种方法需要利用DNA含量和核密度的离散减数分裂分数的差异。
Abstract
在睾丸细胞类型的异质性和减数分裂的细胞培养模型的情况下已表现减数分裂过程中的独特差异化的方案，研究的重大障碍。已经开发了两种主要方法净化，在不同程度上，各种成人和未成熟动物的减数分裂分数：淘洗或Staput（沉淀）BSA和/或percoll梯度。这些方法都依赖于细胞的大小和密度分离减数分裂细胞 1-5 。总体而言，除少数细胞群6，这些协议未能产生足够的纯度许多减数分裂的细胞群，都需要详细的分子生物学分析。此外，这种方法通常减数分裂细胞类型可以在特定的时间，这将增加额外的复杂性水平的重复性和均匀性进行比较时，减数分裂的细胞样本进行纯化。
在这里，我们描述了一个精致的方法，使一个轻松地可视化，识别，并净化减数分裂细胞，生殖细胞，圆形精子细胞，使用流式细胞仪结合用Hoechst 33342染色7,8。这种方法，提供了一个在整个减数分裂过程中的整体快照，并允许一个高度净化可行的细胞从最减数分裂期。然后可以将这些纯化的细胞分子的变化，伴随通过减数分裂的进展，例如在基因表达9,10和核小体占用的动态变化，在减数分裂重组11热点详细分析。
Protocol
此协议是可以分开在两个主要步骤：（1）小鼠睾丸细胞的分解和Hoechst 33342染色其次，如果有必要，（2）排序有关减数分裂的分数，包括减数分裂的所有阶段，从生殖细胞的流式细胞仪圆形精子细胞。一旦收集，这些高浓缩铀的减数分裂的人群，可用于广泛的分析。本协议描述了一个成人睾丸的解离;卷可以据此改编为未成年人或额外的睾丸。
1。睾丸离解
- 放置在一个15毫升的管拆封睾丸。
- Gey的平衡盐溶液3毫升（GBSS）含120 U / ml的一型胶原酶
- 加入10μl和DNA酶I（1mg/ml的储备液在50％的甘油），用手大力摇晃，直到你看到开始游离的睾丸管。
- 在33 ° C搅拌15分钟120转的最大水平
- 倒出在室温下垂直1分钟，弃上清。
- 重复步骤1.2至1.5。
- 加入2.5毫升含型胶原酶，50μL一个50mg/ml的胰蛋白酶股票1mm的盐酸溶液，10μLDNA酶我（1mg/ml的）悬浮的解决方案，我GBSS和反转管好几倍。
- 在33 ° C搅拌15分钟120转的最大水平
- 使用具有宽口塑料一次性巴斯德吸管，吸管轻轻向上和向下3 min.No团块应在这一点上可见。
- 加入胰蛋白酶30μL，10μL，40μLDMSO（10毫克/毫升）重悬的Hoechst 33342 DNA酶我和反转管好几倍。
- 在33 ° C搅拌15分钟120转的最大水平
- 加入400μL的胎牛血清（FCS）的反相混合灭活胰蛋白酶。
- 最终的染色是加入50μL的Hoechst 33342悬浮在二甲基亚砜（10毫克/毫升），10μLDNA酶I（1毫克/毫升）。
- 在33 ° C搅拌15分钟120转的最大水平
- 游离睾丸样本，然后通过两个40微米的GBSS预湿的一次性过滤器，超过50毫升的锥形管，5μL碘化丙啶（PI）的解决方案是添加和一次性巴斯德移液器多次轻轻混合样本吸管。
- 通过的18号针头，样品被转移到5毫升的塑料注射器。后者是由送样的22号针头取代。注射器是存储在冰块，从光，直到准备流式细胞仪处理保护。
2。流式细胞仪的安装和纯化
- 排序是一个贝克顿迪金森咏叹调IIU细胞分选。描述的情况，因此，应作为一个起点，尤其是当使用不同的设备。我们前面描述的使用条件7,8。
- 由于咏叹调IIU不具有紫外激光，我们适应的检测除了使用405纳米的紫激光用于正向和侧向散射检测一个488nm的蓝色激光的赫司特染色的协议。此外，一些过滤器进行了修改，以限制一些红色激光泄漏，造成散积清晰度改善。
- 紫激光配置与赫司特的蓝色发光检测450/40nm的带通和为赫司特红排放585/42nm带通滤波器。一个502nm的长传被用来单独蓝色红色荧光。
- 一个100微米的喷嘴使用了28,000滴/秒下降的驱动频率。样品的阈值率约4000事件/秒。温度控制选项用于样本和收集管保持在4 ° C的整个工期排序。此外，样品搅拌功能是用于在200转，以防止整个排序沉积样品。
- 通常情况下，两到三个睾丸每6小时排序处理，让每个人口的0.5 - 2.0x10 6细胞（见代表部分）集合。
- 该样本是从注射器配发约750μl等份排序。同时，在这些暂停收集管保存在4 ° C时，从光线，保护和恢复排序前轻轻混合。
- 排序的样品被收集到一个12x75mm的玻璃borosilicated收集管含有250μlDMEM培养液含10％FCS为辅。
3。代表性的成果：
一个典型的流式细胞仪配置文件，如图1所示。减数分裂的主要步骤是，在传说中表示。如果的Hoechst 33342染色是不是最佳的，全球的个人资料将出现更为紧凑和少定义。一个常见的问题方面没有加入足够的DNA酶，会诱发细胞快速聚集。通常添加额外的DNA酶在所有被起诉的步骤解决这个问题。冻结日澳威的DNA酶的股票（储存在-20 ° C）应保持在最低限度，在酶的活性迅速丧失这个结果。
Spo11是减数分裂的内切酶，指示在减数分裂重组热点 12的网站的双链休息。，图2显示了典型剖面，双链断裂 ，没有形成一个Spo11空睾丸 ，造成胎死腹中减数分裂12，以及前puberous 13天的旧鼠标，从而揭示了这减数分裂的第一次浪潮的异步性质的个人资料。标准细胞遗传学分析，使用的联会复合体蛋白3（SCP3）和磷酸化组蛋白H2AX抗体的组合阶段具体减数分裂标记应最初用来证实排序减数分裂细胞的纯度和性质， 可谓 elswhere 11。
图1野生型减数分裂流式细胞仪配置文件。一）代表散点图显示。门控单元格显示。注意：目前主要包含空膜和精子尾巴的成人睾丸中的大量碎片。二）代表的PI曲线显示样品中的PI阳性细胞的数额非常有限。所示的典型栅极。 C）是一个具有代表性的野生型赫希斯特33342流式细胞仪配置文件所示。表示人口为进一步研究使用这种方法可以净化各种减数分裂细胞：精原干细胞（SP），前细线（PL），细线，zygotene（L / Z轴），早粗线（EP），中间粗线（ MP），晚粗线期（LP），双线（D）和圆形精子细胞（RS）
图2。Spo11空和野生型的13天减数分裂流式细胞仪配置文件。 A）典型的 Spo11空轮廓是一个明确的减数分裂失败，如果没有过去的粗线细线/ zygotene早期阶段可以检测。二）一个13日龄的野生型雄性小鼠的个人资料显示细线/ zygotene细胞的高浓度。而这减数分裂的第一次浪潮是异步的，明确的可视化使用这种方法。
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Discussion
本协议允许同时净化成年雄性小鼠的整个范围内具有非常高的纯度的减数分裂期细胞，使调查研究这一基本过程的动态。纯净细胞，可用于众多应用，核小体映射 9,10 RNA 提取11日 ，重组分子探测，蛋白质分析和多不等。然而，检测方法要适应纯化减数分裂细胞的数量。此外，这种方法的高重复性，它是可能的，池中的多个独立的各种表现在不同的日子里增加一个特定的实验所需的材料数量相同的分数。此外，这种方法提供了一个独特的可视化表示整个减数分裂过程中，它允许一个迅速评估基因敲除，发育进程畸变，或旨在影响减数分裂任何特定的治疗效果（如照射的影响调查，或与小分子抑制剂治疗）。
这一协议的关键步骤是：（i）足够的DNA酶，极大的方便，避免细胞团块和聚集细胞分选，及（ii）一致赫希斯特33342染色，是必要的，以有效区分减数分裂期细胞不同人群的使用。此外，流式细胞仪操作员应熟悉自己与减数分裂细胞分类的具体情况和特殊性，以优化设置他们的仪器，以获得在图1和详细的视频所示的配置文件。一个可能的修改，可以与新Vybrant DyeCycle紫染色（Invitrogen公司）已为紫激光优化的Hoechst 33342来代替。不过，整体轮廓不会预计将发生急剧变化。最后，它也是重要的注意，由于所使用的组织的性质，一个典型的程序将采取1个半小时准备细胞排序细胞减数分裂和4至6小时，再加上额外的后排序操作。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这个项目是支持的，部分款项从佛罗里达州斯克里普斯和奖项数目从国家普通医学科学研究所和国家儿童健康和人类发展研究所，分别R01GM085079和R21HD061304。这是手稿斯克里普斯研究所20917。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
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