Summary
Een efficiënte methode om in hoge mate gezuiverd levensvatbare meiotische fracties te verkrijgen van de muis testis wordt beschreven, die een combinatie van een verfijnde cel dissociatie protocol met TL-geactiveerde cel sortering (FACS). Deze methode maakt gebruik van verschillen in het DNA-gehalte en de nucleaire dichtheid van discrete meiotische fracties.
Abstract
Het heterogene karakter van de celtypen in de testis en de afwezigheid van meiotische celkweek modellen zijn belangrijke obstakels voor de studie van de unieke differentiatie programma's die zich manifesteren zijn tijdens de meiose. Twee belangrijkste methoden zijn ontwikkeld om, te zuiveren in verschillende mate, diverse meiotische fracties uit zowel volwassen en onvolwassen dieren: elutriatie of Staput (sedimentatie) met behulp van BSA en / of Percoll gradiënten. Beide van deze methoden afhankelijk van celgrootte en dichtheid te scheiden cellen in de meiose 1-5. Het algemeen, behalve voor enkele celpopulaties 6, deze protocollen onvoldoende zuiverheid van de talrijke meiotische celpopulaties die nodig zijn voor gedetailleerde moleculaire analyses opleveren. Bovendien, met dergelijke methoden meestal een soort van cellen in de meiose kan worden gezuiverd op een gegeven tijd, die een extra niveau van complexiteit ten aanzien van de reproduceerbaarheid en de homogeniteit bij het vergelijken van de meiose celmonsters toevoegt.
We beschrijven hier een verfijnde methode die het mogelijk maakt een gemakkelijk te visualiseren, te identificeren en meiotische cellen te zuiveren, van kiemcellen te ronden spermatiden, met behulp van FACS in combinatie met Hoechst 33342 vlekken 7,8. Deze methode biedt een algemeen overzicht van het gehele meiotische proces en maakt het mogelijk om zeer zuiveren levensvatbare cellen van de meeste fase van de meiose. Deze gezuiverde cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in detail voor de moleculaire veranderingen die progressie te begeleiden door middel van meiose, bijvoorbeeld veranderingen in genexpressie 9,10 en de dynamiek van nucleosoom bezetting bij hotspots van meiotische recombinatie 11.
Protocol
Dit protocol kan worden gescheiden in twee grote stappen: (1) de dissociatie en Hoechst 33342 kleuring van de muis testis cellen gevolgd door, indien nodig, (2) FACS-sortering van de relevante meiotische fracties, met inbegrip van alle stadia van de meiose, uit kiemcellen tot ronde spermatiden. Eenmaal verzameld, kunnen deze hoogverrijkt meiotische bevolkingsgroepen worden gebruikt voor een breed scala aan analyse. Dit protocol beschrijft de dissociatie van een volwassen testis; volumes kunnen worden aangepast voor jongeren of voor extra testes.
1. Testis Dissociatie
- Plaats een decapsulated testis in een 15 ml buis.
- Voeg 3 ml van Balans Gey's Salt Solution (GBSS) met 120 U / ml Collagenase type I.
- Voeg 10 ul van DNAse I (1mg/ml stockoplossing in 50% glycerol) en schud het met de hand tot je testikels tubuli beginnen te distantiëren.
- Agiteren horizontaal op maximaal 120 rpm gedurende 15 minuten bij 33 ° C.
- Decanteren gedurende 1 min verticaal bij kamertemperatuur en gooi supernatant.
- Herhaal de stappen 1,2 tot 1,5.
- Voeg 2,5 ml van GBSS met Collagenase type I, 50 ul van een 50mg/ml Trypsine voorraadoplossing opnieuw gesuspendeerd in 1 mM HCl-oplossing, en 10 ul van DNAse I (1mg/ml), en draai de buis een paar keer.
- Agiteren horizontaal op maximaal 120 rpm gedurende 15 minuten bij 33 ° C.
- Met behulp van plastic wegwerp Pasteur pipet met brede opening, pipet voorzichtig op en neer voor 3 min.No klonten moeten zichtbaar zijn op dit punt.
- Voeg 30 pi van trypsine, 10 ul van DNAse I, 40 pi van Hoechst 33342 geresuspendeerd in DMSO (10 mg / ml), en draai de buis een paar keer.
- Agiteren horizontaal op maximaal 120 rpm gedurende 15 minuten bij 33 ° C.
- Voeg 400-ul van foetaal kalf serum (FCS) en meng door naar trypsine te inactiveren.
- Laatste kleuring is uitgevoerd door het toevoegen van 50 pi van Hoechst 33342 geresuspendeerd in DMSO (10 mg / ml), en 10 ul van DNAse I (1 mg / ml).
- Agiteren horizontaal op maximaal 120 rpm gedurende 15 minuten bij 33 ° C.
- De gedissocieerde testis monster wordt vervolgens door twee 40-um GBSS pre-bevochtigd wegwerpfilters over een 50-ml conische buis, dan 5 ul van propidiumjodide (PI) oplossing wordt toegevoegd en monster wordt voorzichtig gemengd door pipetteren verschillende keren met wegwerp Pasteur pipet.
- Monster wordt overgebracht naar een 5-ml plastic spuit door middel van een 18-gauge naald. De laatste wordt vervangen door een 22-gauge naald voor sample levering. De spuit is opgeslagen op ijs en beschermd tegen het licht tot aan de verwerking van FACS.
2. FACS Setup en zuivering
- Sorteren werd uitgevoerd op een Becton-Dickinson Aria IIU cell sorter. De beschreven omstandigheden moet daarom worden gebruikt als een startpunt in het bijzonder bij het gebruik van verschillende apparatuur. We gebruikten voorwaarden eerder beschreven 7,8.
- Omdat de Aria IIU niet beschikt over een UV-laser, we paste het protocol voor het detecteren van Hoescht kleuring met behulp van een 405nm violet laser daarnaast hebben we een 488nm blauwe laser wordt gebruikt voor voor-en zijwaartse verstrooiing detectie. Daarnaast werden een aantal filters gewijzigd om een aantal rode laser lekkages resulteert in een betere verspreide plot scherpte te beperken.
- De violette laser werd geconfigureerd met een 450/40nm band pass voor de detectie van Hoescht Blue emissie en een 585/42nm band pass voor Hoescht Red emissie. Een 502nm lange pass werd gebruikt voor het scheiden van rood blauwe fluorescentie.
- Een 100 um mondstuk werd gebruikt met een druppel aandrijving frequentie van 28.000 druppels / seconde. Het monster drempel bedroeg ongeveer 4000 events / seconde. De temperatuur control optie werd gebruikt voor het monster en verzamelen van tubes te handhaven op 4 ° C de gehele duur van het sorteren. Daarnaast werd het monster agitatie voorziening waarmee de gebruiker bij 200 omwentelingen per minuut om het monster te voorkomen dat sedimenting de hele soort.
- Meestal twee tot drie testikels worden verwerkt per 6 uur sorteren zodat de collectie van 0.5-2.0x10 6 cellen voor elke populatie (zie representatief gedeelte).
- Het monster werd gesorteerd in porties van ongeveer 750μl vrijgesteld van de spuit. Ondertussen, tijdens deze pauzes de verzameling buizen werden bewaard bij 4 ° C, beschermd tegen het licht en voorzichtig voorafgaand aan de hervatting van sorteren gemengd.
- De gesorteerde monsters werden verzameld in een 12x75mm glazen boorsilicaat collectie buis met 250μl DMEM aangevuld met 10% FCS.
3. Representatieve resultaten:
Een typische FACS profiel wordt weergegeven in figuur 1. Alle belangrijke stappen van de meiose worden geïdentificeerd en worden aangegeven in de legenda. Als de Hoechst 33342 vlek is niet optimaal, zal de wereldwijde profiel lijken veel compacter en minder gedefinieerd. Een veel voorkomend probleem betreft niet het toevoegen van voldoende DNAse, die een snelle cel klonteren zal leiden. Toevoeging van extra DNAse bij alle aangeklaagd stappen lost meestal dit probleem. Freeze eawing van het DNAse voorraad (bewaard bij -20 ° C) moet tot een minimum beperkt, omdat dit resulteert in een snelle verlies van de enzymactiviteit.
Spo11 is het meiotische endonuclease dat de dubbel-breuken op plaatsen van meiotische recombinatie hotspots 12 regisseert. Figuur 2 laat de typische profielen van een Spo11-null testis, waar dubbelstrengs breuken niet worden gevormd, wat resulteert in een mislukte meiose 12, evenals een pre-puberous profiel van een 13-dagen oude muis, die asynchrone karakter van deze eerste golf van de meiose onthult. Standaard cytogenetische analyses met behulp van de combinatie van synaptonemal complex eiwit 3 (SCP3) en gefosforyleerd histon H2AX antilichamen stadium-specifieke meiose markers dient in eerste instantie worden gebruikt voor het bevestigen van de zuiverheid en de aard van de gesorteerde cellen in de meiose, zoals beschreven elders 11.
Figuur 1. Wild-type meiose FACS profielen. A) Representatieve spreidingsdiagram wordt weergegeven. De gated cellen worden getoond. Let op de grote hoeveelheid vuil aanwezig is bij volwassen testis die voornamelijk leeg membranen en spermatid staarten. B) Een vertegenwoordiger PI plot geeft de zeer beperkte hoeveelheid van de PI positieve cellen aanwezig in een monster. De typische poort wordt weergegeven. C) Een vertegenwoordiger wild-type Hoechst 33342 FACS profiel wordt weergegeven. De verschillende meiotische celpopulaties dat kan worden gezuiverd met behulp van deze methode voor verdere studie worden aangegeven: spermatogonia (Sp), pre-leptotene (PL), leptotene-zygotene (L / Z), vroeg-Pachytene (EP), midden-Pachytene ( mP), late-Pachytene (LP), diploteen (D), en ronde spermatiden (RS).
Figuur 2. Spo11-null-en wild-type dag 13 meiotische FACS profielen. A) Een typische Spo11-null profiel wordt weergegeven met een duidelijke meiotische mislukking, waar geen enkel moment voorbij de leptotene / zygotene vroeg-pachytene kan worden gedetecteerd. B) Het profiel van een 13-dagen-oude wild-type mannelijke muizen toont de hoge concentratie van leptotene / zygotene cellen. Deze eerste golf van meiose is vrij asynchroon, zoals duidelijk gevisualiseerd met behulp van deze methodiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol vermeld in dit document maakt het mogelijk om tegelijk te zuiveren van volwassen mannelijke muizen het hele bereik van de meiotische podium cellen met een zeer hoge zuiverheid, waardoor onderzoekers de dynamiek studie van deze fundamentele proces. Gezuiverde cellen kunnen worden gebruikt voor tal van toepassingen, variërend van RNA-extractie 9,10, nucleosoom in kaart brengen van 11, recombinant molecuul detectie, eiwit analyses, en nog veel meer. Echter, detectiemethoden moeten worden aangepast aan de hoeveelheid gezuiverde cellen in de meiose. Bovendien is met de hoge reproduceerbaarheid van deze methode, is het mogelijk te bundelen meerdere onafhankelijke soorten van de betrokken fractie uitgevoerd op verschillende dagen aan de hoeveelheid materiaal die nodig is voor een bepaald experiment te verhogen. Ook deze methode biedt onderzoekers met een unieke visuele weergave van het gehele meiotische proces, dat toelaat om snelle beoordeling van de effecten van genetische knock-out, ontwikkelings-progressie aberratie, of het effect van een bepaalde behandeling gericht op aantasting van meiose (bv., bestraling, of behandeling met kleine molecule inhibitoren).
Kritische stappen in dit protocol zijn (i) het gebruik van voldoende DNAse, die sterk celsortering vergemakkelijkt door het vermijden van cel-klompen en aggregaten, en (ii) consistent Hoechst 33342 vlekken die nodig is om efficiënt te onderscheiden van de verschillende populaties van meiotische podium cellen. Daarnaast moet FACS operator vertrouwd maken met de bijzondere kenmerken en eigenaardigheden van meiotische celsortering om optimaal instellen van hun instrument om de profielen in figuur 1 en gedetailleerd in de video te verkrijgen. Een mogelijke wijziging zou kunnen zijn om de Hoechst 33342 te vervangen door de nieuwe Vybrant DyeCycle Violet Stain (Invitrogen), die is geoptimaliseerd voor de violette laser. Toch zou het algemene profiel niet worden verwacht dat drastisch veranderen. Tot slot is het ook belangrijk op te merken dat vanwege de aard van de gebruikte het weefsel, een typische procedure zal 1 ½ uur te nemen naar de cellen in de meiose en 4 voor te bereiden op 6-uur voor de cel sorteren, plus aanvullende post-soort manipulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit project werd mede ondersteund door geld van de staat Florida aan Scripps en toekenning nummers R01GM085079 en R21HD061304 van het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen en het National Institute of Child Health and Human Development, respectievelijk. Dit is het aantal handschrift 20917 van het Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Purification, A. R. culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Namekawa, S. H. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).
- Lassalle, B. Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131, 479-487 (2004).
- Bastos, H. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. Genetic analysis of variation in human meiotic recombination. PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).
- Roig, I. Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis. PLoS Genet. 6, (2010).
- Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots. EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).
- Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis. Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).
