Summary
Une méthode efficace pour obtenir des fractions hautement purifiées viables méiotiques de la souris testicule est décrit, qui combine un cadre raffiné dissociation cellulaire protocole avec le tri de cellules fluorescentes (FACS). Cette méthode tire parti des différences dans le contenu en ADN et de la densité nucléaire de fractions distinctes méiotique.
Abstract
Le caractère hétérogène de types de cellules dans les testicules et l'absence de modèles de culture cellulaire méiotique ont été des obstacles importants à l'étude de la différenciation des programmes uniques qui se manifestent lors de la méiose. Deux principales méthodes ont été développées pour purifier, à des degrés divers, diverses fractions méiotique à la fois adulte et immature animaux: élutriation ou Staput (sédimentation) à l'aide de BSA et / ou des gradients de Percoll. Ces deux méthodes reposent sur la taille des cellules et la densité de séparer les cellules méiotiques 1-5. Dans l'ensemble, sauf pour quelques populations de cellules 6, ces protocoles ne parviennent pas à donner une pureté suffisante des populations de nombreuses cellules méiotiques qui sont nécessaires pour des analyses détaillées moléculaire. Par ailleurs, avec de telles méthodes habituellement un type de cellules méiotiques peut être purifié à un moment donné, ce qui ajoute un niveau supplémentaire de complexité quant à la reproductibilité et l'homogénéité en comparant des échantillons de cellules méiotiques.
Ici, nous décrivons une méthode raffinée qui permet de visualiser facilement, d'identifier et de purifier les cellules méiotiques, à partir des cellules germinales afin de spermatides rondes, en utilisant FACS combiné avec Hoechst 33342 coloration 7,8. Cette méthode fournit un instantané global de l'ensemble du processus méiotique et permet de purifier les cellules viables hautement de la plupart des étapes de la méiose. Ces cellules purifiées peuvent alors être analysés en détail pour des changements moléculaires qui accompagnent la progression à travers la méiose, par exemple des changements dans les 9,10 expression des gènes et la dynamique de l'occupation des nucléosomes sur les hotspots de la recombinaison méiotique 11.
Protocol
Ce protocole peut être séparé en deux grandes étapes: (1) la dissociation et Hoechst 33342 coloration des cellules des testicules de souris suivie, si nécessaire, (2) FACS de tri des fractions pertinentes méiotique, y compris toutes les étapes de la méiose, à partir de cellules germinales au spermatides rondes. Une fois collectées, ces populations hautement enrichi méiotique peut être utilisé pour un large éventail d'analyses. Ce protocole décrit la dissociation d'un testicule adulte; volumes peuvent être adaptées en conséquence pour les mineurs ou pour les testicules supplémentaires.
1. Testicule dissociation
- Placez un testicule décapsulé dans un tube de 15 ml.
- Ajouter 3 ml de solution de Gey équilibre du sel (GBSS) contenant 120 U / ml de collagénase de type I.
- Ajouter 10 ul de DNAse I (1mg/ml solution stock de glycérol 50%) et agiter vigoureusement à la main jusqu'à ce que vous voyez tubules testiculaires commencent à se dissocier.
- Agiter horizontalement à un maximum de 120 rpm pendant 15 min à 33 ° C.
- Décanter pendant 1 min à la verticale à la température ambiante et éliminer le surnageant.
- Répétez les étapes 1.2 à 1.5.
- Ajouter 2,5 ml de GBSS contenant la collagénase de type I, 50 ul d'une solution de trypsine stocks 50mg/ml remises en suspension dans une solution d'HCl 1mM, et 10 pi de DNAse I (1mg/ml), et inverser le tube plusieurs fois.
- Agiter horizontalement à un maximum de 120 rpm pendant 15 min à 33 ° C.
- L'utilisation de plastique jetables pipette Pasteur avec large orifice, une pipette doucement de haut en bas pour les touffes min.No 3 devrait être visible à ce stade.
- Ajouter 30 ul de la trypsine, 10 pl de la DNAse I, 40 pl de Hoechst 33342 resuspendues dans du DMSO (10 mg / ml), et inverser le tube plusieurs fois.
- Agiter horizontalement à un maximum de 120 rpm pendant 15 min à 33 ° C.
- Ajouter 400 ul de sérum de veau foetal (FCS) et mélanger en retournant pour inactiver la trypsine.
- Coloration finale est effectuée en ajoutant 50 pl de Hoechst 33342 resuspendues dans du DMSO (10 mg / ml), et 10 pi de DNAse I (1 mg / ml).
- Agiter horizontalement à un maximum de 120 rpm pendant 15 min à 33 ° C.
- L'échantillon est ensuite dissocié testicule passé par deux GBSS 40 um préhumidifié filtres jetables sur un tube conique de 50 ml, puis 5 ul d'iodure de propidium (PI) et la solution est ajoutée de l'échantillon est mélangé doucement par pipetage plusieurs fois avec Pasteur jetables pipette.
- L'échantillon est transféré dans une seringue en plastique de 5 ml à travers une aiguille de calibre 18. Cette dernière est remplacée par une aiguille de calibre 22 pour la livraison d'échantillons. La seringue est stocké sur la glace et protégé de la lumière jusqu'au moment de son traitement de FACS.
2. Configuration FACS et purification
- Le tri a été effectué sur un trieur Becton-Dickinson Aria cellules IIU. Les conditions décrites doivent donc être utilisés comme point de départ en particulier lors de l'utilisation des équipements différents. Nous avons utilisé les conditions décrites précédemment 7,8.
- Depuis l'IIU Aria n'a pas un laser UV, nous avons adapté le protocole pour la détection de coloration Hoescht en utilisant un laser violet 405nm en plus nous avons utilisé un laser 488nm bleu pour la détection diffusion vers l'avant et latérale. Par ailleurs, certains filtres ont été modifiées afin de limiter certains perméabilité laser rouge résultant de la netteté améliorée complot dispersés.
- Le laser violet a été configuré avec une bande passante 450/40nm pour la détection de Hoescht Bleu d'émission et un passe-bande pour les 585/42nm Hoescht-Rouge émission. Un laissez-passer 502nm long a été utilisé pour séparer bleue de fluorescence rouge.
- Une buse 100 um a été utilisé avec une fréquence d'entraînement goutte de 28000 gouttes / seconde. Le taux seuil de l'échantillon était d'environ 4000 événements / seconde. L'option de contrôle de température a été utilisée pour maintenir l'échantillon et les tubes de prélèvement à 4 ° C toute la durée de tri. En outre, la fonctionnalité de l'agitation de l'échantillon a été utilisé à 200 rpm pour empêcher l'échantillon de sédimentation dans le tri.
- Habituellement, deux à trois testicules ont été traités par 6 heures de tri permettant la collecte de 0,5-2.0x10 6 cellules pour chaque population (voir la section représentant).
- L'échantillon a été trié dans des aliquotes d'environ 750μl dispensé de la seringue. En attendant, pendant ces pauses les tubes de prélèvement ont été conservés à 4 ° C, protégé de la lumière, et mélanger doucement avant de reprendre de tri.
- Les échantillons ont été collectés triés dans un tube de collecte du verre borosilicaté contenant 250μl 12x75mm DMEM supplémenté avec 10% de FCS.
3. Les résultats représentatifs:
Un profil typique FACS est montré dans la figure 1. Toutes les grandes étapes de la méiose sont identifiés et sont indiqués dans la légende. Si le Hoechst 33342 tache n'est pas optimale, le profil global apparaîtra beaucoup plus compact et moins bien définies. Un problème commun concerne non ajoutant suffisamment DNAse, qui va induire l'agglutination cellulaire rapide. Ajout d'extra DNAse à toutes les étapes inculpé résout généralement ce problème. E gelAwing du stock DNAse (conservés à -20 ° C) devrait être maintenu à un minimum, car cela entraîne une perte rapide de l'activité enzymatique.
Spo11 est l'endonucléase méiotique qui dirige des cassures double brin dans des sites de hotspots recombinaison méiotique 12. La figure 2 montre les profils typiques d'un testicule Spo11-nulle, où cassures double brin ne sont pas formés, résultant en une méiose avortée 12, ainsi que d'un pré-puberous profil d'une souris de 13 jours, ce qui révèle la nature asynchrone de cette première vague de la méiose. Analyses cytogénétiques standard en utilisant la combinaison de protéines complexes synaptonémal 3 (SCP3) et phosphorylée anticorps histone H2AX stade de la méiose des marqueurs spécifiques doivent être d'abord utilisé pour confirmer la pureté et la nature des cellules triées méiotique, comme décrit elswhere 11.
Figure 1. Wild-type de la méiose FACS profils. A) nuage de points représentant est montré. Les cellules fermée sont représentés. Notez la grande quantité de débris présents dans le testicule adulte contenant principalement des membranes vides et les queues des spermatides. B) Un tracé représentatif PI indique la quantité très limitée de cellules PI positives présentes dans un échantillon. La porte typique est montré. C) Un représentant de type sauvage Hoechst 33342 profil FACS est montré. Les différentes populations de cellules méiotiques qui peuvent être purifiés en utilisant cette méthode pour une étude plus approfondie sont indiqués: les spermatogonies (Sp), pré-leptotène (PL), leptotène-zygotène (L / Z), début Pachytène (EP), le Moyen-Pachytène ( spermatides MP), fin-Pachytène (LP), diplotène (D) et ronde (RS).
Figure 2. Spo11-nulle et de type sauvage jours 13 méiotique profils FACS. A) Un typiques Spo11-nulle profil est représenté avec un échec patent méiotique, où aucune étape de la dernière leptotène / zygotène précoce pachytène peut être détecté. B) le profil d'un 13-jours-anciens de type sauvage souris mâle montre la forte concentration de cellules leptotène / zygotène. Cette première vague de la méiose est plutôt asynchrone, aussi clairement visualisés en utilisant cette méthodologie.
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Discussion
Le protocole présenté ici permet un à la fois purifier de souris mâles adultes toute la gamme des cellules stade de la méiose avec une très grande pureté, ce qui permet aux enquêteurs d'étudier la dynamique de ce processus fondamental. Cellules purifiées peuvent être utilisées pour de nombreuses applications allant de l'extraction de l'ARN 9,10, la cartographie nucléosome 11, la détection de molécules recombinantes, les analyses de protéines, et beaucoup plus. Cependant, les méthodes de détection doivent être adaptées à la quantité de cellules méiotiques purifiée. Par ailleurs, avec la grande reproductibilité de cette méthode, il est possible de regrouper plusieurs sortes indépendant de la même fraction effectuées à des jours différents pour augmenter la quantité de matériau nécessaire pour une expérience particulière. En outre, cette méthode fournit aux enquêteurs une représentation visuelle unique de l'ensemble du processus méiotique, qui permet d'évaluer rapidement les effets de KO génétique, une aberration progression développementale, ou l'effet d'un traitement particulier visant à nuire à la méiose (par exemple, l'irradiation, ou traitement avec des inhibiteurs à petite molécule).
Les étapes critiques dans ce protocole sont: (i) l'utilisation de DNAse suffisante, ce qui facilite grandement le tri cellulaire en évitant amas cellulaires et des agrégats, et (ii) conformes coloration Hoechst 33342 qui est nécessaire pour distinguer efficacement les différentes populations de cellules stade de la méiose. En outre, l'opérateur FACS devraient se familiariser avec les spécificités et les particularités de tri cellulaire méiotique, afin de leur instrument de façon optimale l'installation afin d'obtenir les profils de la figure 1 et détaillé dans la vidéo. Une modification possible pourrait être de remplacer le Hoechst 33342 avec le violet de nouveaux DyeCycle Vybrant Stain (Invitrogen) qui a été optimisée pour le laser violet. Cependant, le profil global ne devrait pas changer radicalement. Enfin, il est également important de noter qu'en raison de la nature du tissu utilisé, une procédure typique prendra une demi-heure pour préparer les cellules méiotiques et de 4 à 6 h pour le tri cellulaire, ainsi que d'autres manipulations post-tri.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu en partie par l'argent de l'Etat de Floride aux Scripps et les numéros de récompense et de R01GM085079 R21HD061304 de l'Institut national des sciences médicales générales et l'Institut national de la santé infantile et du développement humain, respectivement. Ceci est le numéro de manuscrit de 20917 The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
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