Summary
Un metodo efficace per ottenere altamente purificato frazioni praticabile meiotica da mouse testicolo è descritto, che unisce un raffinato cellulare dissociazione protocollo con fluorescenti separazione delle cellule attivate (FACS). Questo metodo sfrutta le differenze nel contenuto di DNA nucleare e la densità di discreta frazioni meiotico.
Abstract
La natura eterogenea di tipi cellulari nel testicolo e l'assenza di modelli di coltura cellulare meiotico sono stati ostacoli significativi allo studio dei programmi di differenziazione unico che si manifestano durante la meiosi. Due metodi principali sono state sviluppate per purificare, a livelli diversi, diverse frazioni meiotica sia da adulti e animali immaturi: elutriation o Staput (sedimentazione) utilizzando la BSA e / o gradienti di Percoll. Entrambi questi metodi si basano sulla dimensione della cella e la densità di separare le cellule meiotico 1-5. Nel complesso, ad eccezione di popolazioni cellulari pochi 6, questi protocolli non riescono a produrre una sufficiente purezza delle numerose popolazioni di cellule meiotica che sono necessari per la dettagliata analisi molecolari. Inoltre, con questi metodi di solito un tipo di cellule meiotico può essere purificato in un dato momento, che aggiunge un ulteriore livello di complessità quanto concerne la riproducibilità e omogeneità nel confronto tra campioni di cellule meiotica.
Qui, descriviamo un metodo raffinato che permette di visualizzare facilmente, identificare e purificare cellule meiotico, da cellule germinali di spermatidi rotondi, usando FACS combinato con Hoechst 33342 colorazione 7,8. Questo metodo fornisce una fotografia complessiva dell'intero processo meiotico e permette di purificare cellule vitali altamente dalla maggior parte fase della meiosi. Queste cellule purificate possono poi essere analizzati in dettaglio i cambiamenti molecolari che accompagnano la progressione attraverso la meiosi, per esempio le modifiche nell'espressione genica 9,10 e le dinamiche di occupazione nucleosoma presso gli hotspot di ricombinazione meiotica 11.
Protocol
Questo protocollo può essere diviso in due fasi principali: (1) la colorazione 33342 dissociazione e Hoechst di mouse cellule testicolo seguito, se necessario, (2) FACS ordinamento delle frazioni rilevanti meiotico, comprese tutte le fasi della meiosi, da cellule germinali di spermatidi rotondi. Una volta raccolte, queste popolazioni altamente arricchito meiotica può essere utilizzato per una vasta gamma di analisi. Questo protocollo descrive la dissociazione di un testicolo adulto; volumi possono essere adattate di conseguenza per i minori o per testicoli aggiuntivi.
1. Testicolo dissociazione
- Mettete un testicolo decapsulated in un tubo da 15 ml.
- Aggiungere 3 ml di soluzione Balance Gey di Salt (GBSS) contenente 120 U / ml di Collagenasi tipo I.
- Aggiungere 10 ml di DNAsi I (soluzione stock 1mg/ml nel 50% glicerolo) e scuoterlo energicamente a mano fino a quando vedrete tubuli testicolari iniziando a dissociarsi.
- Agitare orizzontalmente ad un massimo di 120 rpm per 15 minuti a 33 ° C.
- Decantare per 1 minuto in verticale a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
- Ripetere i passaggi 1,2-1,5.
- Aggiungere 2,5 ml di GBSS contenente Collagenasi di tipo I, 50 microlitri di una soluzione madre 50mg/ml tripsina risospese in soluzione 1mM HCl, e 10 ml di DNAsi I (1mg/ml), e capovolgere il tubo più volte.
- Agitare orizzontalmente ad un massimo di 120 rpm per 15 minuti a 33 ° C.
- Utilizzando plastica pipetta Pasteur monouso con orifizio largo, pipettare delicatamente su e giù per 3 grumi min.No dovrebbe essere visibile a questo punto.
- Aggiungere 30 ml di tripsina, 10 ml di DNAsi I, 40 ml di Hoechst 33342 risospeso in DMSO (10 mg / ml), e capovolgere il tubo più volte.
- Agitare orizzontalmente ad un massimo di 120 rpm per 15 minuti a 33 ° C.
- Aggiungere 400 ml di siero fetale bovino (FCS) e mescolare invertendo per inattivare la tripsina.
- Colorazione finale è eseguita aggiungendo 50 l di Hoechst 33342 risospeso in DMSO (10 mg / ml) e 10 ml di DNAsi I (1 mg / ml).
- Agitare orizzontalmente ad un massimo di 120 rpm per 15 minuti a 33 ° C.
- Il campione testicolo dissociata viene fatto passare attraverso due GBSS 40-micron filtri usa e getta di pre-contatto con il fluido in un tubo da 50 ml conica, poi 5 ml di ioduro di propidio (PI) si aggiunge la soluzione e il campione viene delicatamente mescolato pipettando più volte con Pasteur monouso pipetta.
- Campione viene trasferito in una siringa da 5 ml in plastica attraverso un ago calibro 18. Quest'ultima viene sostituita da una 22-gauge per la consegna del campione. La siringa è memorizzato sul ghiaccio e al riparo dalla luce fino al momento per l'elaborazione FACS.
2. FACS installazione e purificazione
- L'ordinamento è stato eseguito su un Becton Dickinson-cell sorter Aria IIU. Le condizioni descritte dovrebbero pertanto essere utilizzate come punto di partenza soprattutto quando si utilizzano apparecchiature differenti. Abbiamo usato condizioni precedentemente descritte 7,8.
- Dato che la IIU Aria non ha un laser UV, abbiamo adattato il protocollo per la rilevazione di colorazione Hoescht utilizzando un laser 405nm viola in aggiunta abbiamo utilizzato un laser blu 488 nm per il rilevamento scatter in avanti e laterale. Inoltre, alcuni filtri sono stati modificati al fine di limitare alcune permeabilità laser rosso con conseguente miglioramento della nitidezza trama sparsi.
- Il laser viola è stato configurato con una banda passante 450/40nm per il rilevamento delle emissioni Hoescht blu e una banda passante 585/42nm per l'emissione Hoescht Rosso. Un passaggio 502nm lungo è stata utilizzata per separare blu fluorescenza rossa.
- A 100 micron ugello è stata utilizzata con una frequenza goccia disco di 28.000 gocce / secondo. Il tasso soglia campione è stato di circa 4000 eventi / secondo. L'opzione di controllo della temperatura è stata utilizzata per mantenere campioni e provette a 4 ° C tutta la durata della selezione. Inoltre, la funzione agitazione campione è stato utilizzato a 200 giri al minuto per evitare che il campione dalla sedimentazione nel corso del genere.
- Di solito, due o tre testicoli sono stati elaborati per 6 specie ora che permette la raccolta di 0.5-2.0x10 6 celle per ogni popolazione (vedere la sezione rappresentante).
- Il campione è stato ordinato in aliquote di circa 750μl dispensato dalla siringa. Nel frattempo, durante queste pause le provette di raccolta sono stati mantenuti a 4 ° C, al riparo dalla luce, e delicatamente miscelati prima di ordinare la ripresa.
- I campioni raccolti sono stati ordinati in una 12x75mm tubo di raccolta di vetro borosilicato contenente 250μl DMEM supplementato con 10% FCS.
3. Rappresentante dei risultati:
Un profilo tipico FACS è mostrata in Figura 1. Tutte le fasi principali della meiosi sono identificati e sono indicati in legenda. Se l'Hoechst 33342 macchia non è ottimale, il profilo globale appare molto più compatto e meno definite. Un problema comune riguarda la non sufficiente l'aggiunta di DNAsi, che inducono una rapida aggregazione cellulare. Aggiunta di olio extra DNAsi a tutti i passaggi incriminati risolve di solito questo problema. Congelare °awing dello stock DNAsi (conservati a -20 ° C) dovrebbe essere ridotto al minimo, come questo si traduce in una rapida perdita di attività enzimatica.
Spo11 è la endonucleasi meiotica che dirige rotture del doppio filamento in siti di hotspot ricombinazione meiotica 12. La figura 2 mostra i profili tipici di un Spo11 nullo testicolo dove doppio filamento pausa non si formano, con un conseguente meiosi abortivo 12, così come un pre-puberous profilo di un 13-giorni vecchio mouse, che rivela la natura asincrona di questa prima ondata di meiosi. Standard di analisi citogenetica utilizzando la combinazione di proteine complesse sinaptonemalico 3 (SCP3) e fosforilato anticorpi H2AX fase-specifici marcatori meiosi dovrebbe essere inizialmente utilizzato per confermare la purezza e la natura delle cellule ordinati meiotico, come descritto jazz band 11.
Figura 1. Wild-type FACS meiosi profili. A) scatter plot Rappresentante è mostrato. Le cellule gated sono mostrati. Notare la grande quantità di detriti presenti nel testicolo adulto contenente per lo più vuote e le membrane code spermatidi. B) Una trama rappresentante PI mostra la quantità molto limitata di cellule PI positivi presenti in un campione. Il cancello tipico è mostrato. C) Un rappresentante wild-type Hoechst 33342 profilo FACS è mostrato. Le varie popolazioni di cellule meiotica che può essere purificato usare questo metodo per ulteriori studi sono indicati: spermatogoni (Sp), pre-leptotene (PL), leptotene-zigotene (L / Z), pachitene precoce (EP), medio-pachitene ( spermatidi mP), tardo-pachitene (LP), diplotene (D), e tonde (RS).
Figura 2. Spo11 nullo e wild-type giorno 13 profili meiotica FACS. A) Un tipico Spo11-null profilo viene mostrato con un chiaro fallimento meiotica, dove nessuna fase passato leptotene / zigotene precoce pachitene possono essere rilevati. B) Il profilo di un 13-giorno-vecchio wild-type topo maschio dimostra l'alta concentrazione di cellule leptotene / zigotene. Questa prima ondata di meiosi è piuttosto asincrono, come chiaramente visualizzate utilizzando questa metodologia.
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Discussion
Il protocollo presentato qui permette di purificare contemporaneamente da topi maschi adulti l'intera gamma delle cellule stadio meiotico con purezza molto elevata, permettendo agli investigatori di studiare la dinamica di questo processo fondamentale. Cellule purificate possono essere utilizzati per numerose applicazioni che vanno dalla RNA 9,10, la mappatura nucleosoma 11, il rilevamento molecola ricombinante, analisi delle proteine, e molti altri. Tuttavia, i metodi di rilevazione devono essere adattati alla quantità di cellule purificate meiotico. Inoltre, con l'alta riproducibilità di questo metodo, è possibile mettere in comune le specie più indipendente della frazione stessa effettuate in giorni diversi per aumentare la quantità di materiale necessario per un particolare esperimento. Inoltre, questo metodo fornisce investigatori una rappresentazione visiva unica di tutto il processo meiotico, che permette di valutare rapidamente gli effetti di eliminazione diretta genetica, l'aberrazione progressione dello sviluppo, o l'effetto di un particolare trattamento diretto a pregiudicare meiosi (ad esempio, l'irradiazione, o il trattamento con piccole molecole inibitrici).
Passaggi critici in questo protocollo sono: (i) l'uso di sufficiente DNAsi, che facilita enormemente l'ordinamento delle cellule, evitando grumi di cellule e aggregati, e (ii) coerenti Hoechst 33342 colorazione che è necessario distinguere efficacemente le varie popolazioni di cellule stadio meiotico. Inoltre, l'operatore FACS dovrebbero familiarizzare con le specificità e le peculiarità di separazione delle cellule meiotica al fine di impostare in modo ottimale il loro strumento per ottenere i profili mostrato nella Figura 1 e dettagliati nel video. Una modifica potrebbe essere quella di sostituire la Hoechst 33342 con la nuova Viola Vybrant DyeCycle Stain (Invitrogen) che è stato ottimizzato per il laser viola. Tuttavia, il profilo complessivo non dovrebbe cambiare drasticamente. Infine, è anche importante notare che a causa della natura del tessuto utilizzato, una tipica procedura sono necessari 1 ½ ora per preparare le cellule meiotico e da 4 a 6 ore per l'ordinamento delle cellule, più altri post-ordinamento manipolazioni.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo progetto è stato sostenuto in parte dal denaro dallo Stato della Florida a Scripps e numeri premio R01GM085079 e R21HD061304 dal National Institute of General Medical Sciences e il National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano, rispettivamente. Questo è il numero manoscritto 20917 di The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
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