Summary
Um método eficiente para obter altamente purificada viável frações meiótica de testículo do rato é descrito, que combina uma refinada célula dissociação protocolo com fluorescentes separação de células ativadas (FACS). Este método tira vantagem de diferenças no conteúdo de DNA nuclear e densidade de frações discretas meiótica.
Abstract
A natureza heterogênea de tipos de células nos testículos e na ausência de modelos de cultura de células meióticas foram obstáculos significativos para o estudo dos programas de diferenciação únicos que se manifestam durante a meiose. Dois principais métodos foram desenvolvidos para purificar, em diferentes graus, várias frações meiótica de ambos os adultos e animais jovens: elutriação ou Staput (sedimentação), utilizando BSA e / ou gradientes de Percoll. Ambos os métodos dependem do tamanho das células e densidade para separar células meióticas 1-5. No geral, exceto para populações de células poucos 6, estes protocolos não ceder pureza suficiente das inúmeras populações de células meióticas que são necessários para análises detalhadas molecular. Além disso, com tais métodos geralmente um tipo de células meióticas podem ser purificada em um determinado momento, o que adiciona um nível extra de complexidade quanto à reprodutibilidade e homogeneidade quando se comparam amostras de células meióticas.
Aqui, nós descrevemos um método refinado que permite facilmente visualizar, identificar e purificar as células meióticas, a partir de células germinativas de espermátides arredondadas, usando FACS combinado com coloração Hoechst 33342 7,8. Este método oferece um instantâneo global de todo o processo meiótico e permite altamente purificar as células viáveis da maioria fase da meiose. Estas células purificadas podem ser analisados em detalhe para mudanças moleculares que acompanham a progressão através da meiose, por exemplo, mudanças na expressão gênica 9,10 ea dinâmica de ocupação nucleosome em hotspots de recombinação meiótica 11.
Protocol
Este protocolo pode ser separado em duas etapas principais: (1) a dissociação e Hoechst 33342 coloração de células de camundongo testículos seguido, se necessário, (2) FACS triagem das frações relevantes meiótica, incluindo todas as fases da meiose, a partir de células germinativas de espermátides arredondadas. Depois de coletados, essas populações altamente enriquecido meiótica pode ser usado para uma ampla gama de análise. Este protocolo descreve a dissociação de um testículo adulto; volumes pode ser adaptado para os jovens ou para testes adicionais.
1. Testículo dissociação
- Coloque um testículo decapsulated em um tubo de 15 ml.
- Adicionar 3 ml de Salt Gey do Balance Solução (GBSS) contendo 120 U / ml de colagenase tipo I.
- Adicionar 10 ml de DNAse I (1mg/ml solução estoque em glicerol 50%) e agite-a vigorosamente com a mão até que você veja testicular túbulos começando a dissociar.
- Agitar horizontalmente em um máximo de 120 rpm por 15 min a 33 ° C.
- Decantar por 1 min verticalmente em temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
- Repita os passos de 1,2-1,5.
- Adicionar 2,5 ml de colagenase GBSS contendo o tipo I, 50 ul de uma solução de 50mg/ml de ações Tripsina ressuspenso em solução de HCl 1mM, e 10 ml de DNAse I (1mg/ml), e inverter o tubo várias vezes.
- Agitar horizontalmente em um máximo de 120 rpm por 15 min a 33 ° C.
- Usando plástico descartáveis pipeta Pasteur com orifício de largura, pipeta suavemente para cima e para baixo por três aglomerados min.No deve ser visível neste momento.
- Adicionar 30 mL de tripsina, 10 ml de DNAse I, 40 mL de Hoechst 33342 ressuspenso em DMSO (10 mg / ml), e inverter o tubo várias vezes.
- Agitar horizontalmente em um máximo de 120 rpm por 15 min a 33 ° C.
- Adicionar 400 mL de soro fetal bovino (FCS) e misturar por inversão para inativar a tripsina.
- Coloração final é realizada pela adição de 50 ul de Hoechst 33342 ressuspenso em DMSO (10 mg / ml) e 10 ml de DNAse I (1 mg / ml).
- Agitar horizontalmente em um máximo de 120 rpm por 15 min a 33 ° C.
- A amostra é então dissociado testículo passou por duas GBSS 40 mícrons de pré-filtros descartáveis molhada ao longo de um tubo cônico de 50 ml, então mL 5 de iodeto de propídio (PI) é adicionado e solução amostra é misturada delicadamente por pipetagem várias vezes com Pasteur descartáveis pipeta.
- Amostra é transferida para uma seringa de plástico de 5 ml por meio de uma agulha de calibre 18. O último é substituído por uma agulha de calibre 22 para a entrega da amostra. A seringa é armazenado em gelo e protegido da luz até que esteja pronto para o processamento FACS.
2. FACS Setup e Purificação
- Classificação foi realizada em um Becton-Dickinson classificador célula Aria IIU. As condições descritas deve ser utilizada como ponto de partida, especialmente quando se usa equipamentos diferentes. Usamos condições anteriormente descritas 7,8.
- Desde o IIU Aria não tem um laser UV, adaptamos o protocolo para a detecção de coloração Hoescht usando um laser violeta 405nm além usamos um laser de 488nm azul para a detecção de dispersão para a frente e lateral. Além disso, alguns filtros foram modificadas, a fim de limitar algumas leakiness laser vermelho, resultando em nitidez enredo melhorou dispersos.
- O laser violeta foi configurado com um passa-banda 450/40nm para a detecção de Hoescht Azul de emissão e um passa-banda 585/42nm para Hoescht emissão Vermelho. Um passe longo 502nm foi utilizado para separar o azul do fluorescência vermelha.
- Um bico M 100 foi usada com uma freqüência disco gota de 28.000 gotas / segundo. A taxa de limiar de amostra foi de aproximadamente 4000 eventos / segundo. A opção de controle de temperatura foi usado para manter a amostra e tubos de coleta a 4 ° C todo o período de classificação. Além disso, o recurso de agitação da amostra foi utilizado em 200 rpm para evitar que a amostra de sedimentação em todo o tipo.
- Normalmente, 02:58 testículos foram processados por seis horas espécie permitindo a coleta de 0,5-2.0x10 6 células de cada população (ver secção representativa).
- A amostra foi classificada em alíquotas de aproximadamente 750μl dispensado da seringa. Enquanto isso, durante estas pausas a tubos de coleta foram mantidas a 4 ° C, protegido da luz, e gentilmente misturado antes da espécie de reinício.
- As amostras classificadas foram coletadas em um tubo de coleta de vidro 12x75mm borosilicato contendo 250μl DMEM suplementado com 10% SFB.
3. Resultados representativos:
Um perfil FACS típico é mostrado na Figura 1. Todos os passos principais da meiose são identificados e são indicadas na legenda. Se a Hoechst 33342 mancha não é ideal, o perfil global vai aparecer muito mais compacto e menos definida. Um problema comum que diz respeito não a adição de DNAse suficiente, o que irá induzir aglutinação celular rápida. Adição de DNAse extras em todas as etapas indiciado geralmente resolve este problema. ª congelarawing do estoque de DNAse (armazenadas a -20 ° C) deve ser reduzido ao mínimo, pois isso resulta em rápida perda de atividade enzimática.
Spo11 é a endonuclease meiótica que direciona dupla vertente quebra em locais de hotspots de recombinação meiótica 12. A Figura 2 mostra perfis típicos de um testículo Spo11 nulo onde fita dupla ruptura não são formadas, resultando em uma meiose abortiva 12, bem como um pré-puberous perfil de um rato de 13 dias de idade, o que revela a natureza assíncrona da primeira onda de meiose. Análises citogenéticas padrão usando a combinação de proteínas complexas sinaptonêmico 3 (SCP3) e fosforilado anticorpos H2AX histona estágio marcadores específicos de meiose devem ser inicialmente utilizada para confirmar a pureza ea natureza das células classificadas meiótica, como descrito elswhere 11.
Figura 1. FACS tipo selvagem perfis meiose. A) gráfico de dispersão Representante é mostrado. As células gated são mostrados. Observe a grande quantidade de detritos presentes no testículo adulto contendo principalmente membranas vazio e caudas espermátides. B) A trama mostra o PI representante quantidade muito limitada de células PI positivos presentes em uma amostra. O portão típico é mostrado. C) Um representante do tipo selvagem Hoechst 33342 perfil FACS é mostrado. As várias populações de células meióticas que pode ser purificado usando este método para um estudo mais aprofundado são indicadas: espermatogônias (Sp), pré-leptóteno (PL), leptóteno-Zigóteno (L / Z), early-Paquíteno (PE), de meia-Paquíteno ( MP), late-Paquíteno (LP), diplóteno (D), e volta espermátides (RS).
Figura 2. Spo11 nulo e do tipo selvagem dia 13 perfis meiótica FACS. A) Um perfil Spo11 nulo típico é mostrado com uma clara falha meiótica, onde nenhum momento após o leptóteno / Zigóteno início de paquíteno pode ser detectado. B) O perfil de um de 13 dias de idade do rato do tipo selvagem macho mostra a alta concentração de células leptóteno / Zigóteno. Esta primeira onda da meiose é bastante assíncronas, como claramente visualizado utilizando esta metodologia.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado permite, simultaneamente, purificar a partir de camundongos machos adultos toda a gama de células estágio meiótico com pureza muito elevado, permitindo que os pesquisadores para estudar a dinâmica deste processo fundamental. Células purificadas podem ser usados para inúmeras aplicações que vão desde extração de RNA 9,10, mapeamento nucleosome 11, detecção molécula recombinante, análises de proteínas, e muitos mais. No entanto, métodos de detecção devem ser adaptadas à quantidade de células meióticas purificada. Além disso, com a alta reprodutibilidade deste método, é possível agrupar vários tipos independente de a mesma fração realizadas em dias diferentes para aumentar a quantidade de material necessário para uma experiência particular. Além disso, este método fornece investigadores com uma representação visual única de todo o processo meiótico, o que permite avaliar rapidamente os efeitos do nocaute genético, a aberração progressão do desenvolvimento, ou o efeito de qualquer tratamento especial destinado a atentar contra a meiose (por exemplo, a irradiação, ou tratamento com inibidores de molécula pequena).
Passos críticos neste protocolo são: (i) o uso de DNAse suficiente, o que facilita muito a separação de células, evitando aglomerações de células e agregados, e (ii) consistente coloração Hoechst 33342, que é necessário distinguir eficientemente as várias populações de células estágio meiótico. Além disso, a operadora FACS devem se familiarizar com as especificidades e peculiaridades de separação de células meióticas, a fim de melhor forma seu instrumento de instalação para obter os perfis mostrados na Figura 1 e detalhadas no vídeo. Uma modificação possível seria substituir a Hoechst 33342 com o novo Violet DyeCycle Vybrant Stain (Invitrogen), que foi otimizado para o laser violeta. No entanto, o perfil geral não seria de esperar para mudar drasticamente. Finalmente, é também importante notar que devido à natureza do tecido usado, um procedimento típico terá 1 ½ hr de preparar as células meióticas e de 4 a 6 horas para o tipo de células, além de adicional de pós-tipo de manipulações.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este projecto foi apoiado em parte por verbas do Estado da Flórida para Scripps e os números de prêmio R01GM085079 R21HD061304 e do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais e do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, respectivamente. Este é o número 20917 manuscrito de The Scripps Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
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