Summary
Floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile rafine bir hücre disosiasyon protokolü birleştirir fare testis yüksek derecede saflaştırılmış yaşayabilir mayotik kesirler elde etmek için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, DNA içeriği ve ayrık mayotik kesirler nükleer yoğunluğu farklılıkları yararlanır.
Abstract
Testis hücre tipleri heterojen doğası ve mayoz hücre kültürü modelleri yokluğunda mayoz bölünme sırasında ortaya eşsiz bir farklılaşma programları çalışma için önemli engellerin edilmiştir. BSA ve / veya Percoll gradyanlar Yıkayarak tasviye veya Staput (sedimantasyon): İki ana yöntemleri, değişen derecelerde, hem yetişkin ve immatür hayvanlarda çeşitli mayotik kesirler arındırmak için geliştirilmiştir var. Bu yöntemlerin her ikisi mayotik hücreleri 1-5 ayrı hücre boyutu ve yoğunluğu güveniyor. Genel olarak, birkaç hücre popülasyonlarının 6 dışında, bu protokolleri detaylı moleküler analizler için gerekli olan çok sayıda mayotik hücre popülasyonlarının yeterli saflıkta verim başarısız olur. Ayrıca, bu tür yöntemleri ile genellikle tek tip mayotik hücreleri mayoz hücre örnekleri karşılaştırarak tekrarlanabilirlik ve homojenlik ile ilgili ekstra bir karmaşıklık düzeyi ekler belirli bir zaman, arındırılmalıdır.
Burada, Hoechst 33.342 boyama 7,8 ile birlikte FACS kullanarak, germ hücreleri, yuvarlak spermatid, zarif bir yöntem tarif biri kolayca görselleştirmek belirlemek ve mayotik hücreleri arındırmak sağlar . Bu yöntem tüm mayotik sürecinin genel bir anlık sağlar ve bir mayoz en aşamasından son derece canlı hücreler arındırmak için izin verir. Bu saflaştırılmış hücreler daha sonra 11 mayotik rekombinasyon noktalarından örnek gen ekspresyonu 9,10 değişiklikleri ve nucleosome doluluk dinamikleri, mayoz bölünme yoluyla ilerlemesi eşlik moleküler değişiklikler için ayrıntılı olarak analiz edilebilir.
Protocol
Bu protokol, iki önemli adımlar ayrılabilir: (1) gerekirse fare testis hücrelerinin bölünmeler ve Hoechst 33.342 boyama, germ hücrelerinden mayoz tüm aşamaları da dahil olmak üzere ilgili mayotik kesirler, sıralama (2) FACS izledi yuvarlak spermatid. Bir kez toplanan bu zenginleştirilmiş mayotik popülasyonları geniş bir analiz için kullanılabilir. Bu protokol bir yetişkin testis ayrışma açıklar; miktarlar gençlerin veya ek testisler için buna göre adapte edilebilir.
1. Testis Ayrılma
- 15 ml'lik bir tüp içinde bir decapsulated testis.
- Kollajenaz tip I, 120 U / ml içeren Gey Dengesi Tuz Çözüm 3 ml (GBSS)
- 10 ul DNAz I (% 50 gliserol 1mg/ml stok solüsyonu) ekleyin ve ayırmak başlangıç testis tübüller görene kadar elle kuvvetlice sallayın.
- 33 ° C'de 15 dakika için 120 rpm maksimum yatay çalkalayın
- Oda sıcaklığında dikey olarak 1 dakika için Durusu ve supernatant atın.
- 1.5 ila 1.2 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Kollajenaz tip I, 50 ul, 1mm HCl çözeltisi ve 10 ul DNAz (1mg/ml) yeniden süspanse 50mg/ml tripsin stok solüsyonu içeren GBSS 2.5 ml ekleyin ve birkaç kez tüp ters.
- 33 ° C'de 15 dakika için 120 rpm maksimum yatay çalkalayın
- Geniş delikli plastik tek yeniden süspanse kullanarak, pipet yavaşça yukarı ve aşağı 3 min.No kümeleri için bu noktada görünür olmalıdır.
- Tripsin 30, 10 DNAz I, 40 DMSO (10 mg / ml) yeniden süspanse Hoechst 33.342 ul ul ul ekleyin ve birkaç kez tüp ters.
- 33 ° C'de 15 dakika için 120 rpm maksimum yatay çalkalayın
- 400-ul fetal buzağı serumu (FCS) ve tripsin inaktive tersini ile karıştırın.
- Final boyama Hoechst 33.342 50 ul DMSO (10 mg / ml) yeniden süspanse ve DNAz (1 mg / ml) 10 ul ekleyerek yapılır.
- 33 ° C'de 15 dakika için 120 rpm maksimum yatay çalkalayın
- Ayrışmış testis örnek daha sonra iki adet 40 mikron GBSS geçirilir 50 ml konik tüp üzerinde önceden ıslatılmış tek filtreleri, tek kullanımlık Pasteur ile birkaç kez pipetleme çözüm eklenir ve örnek hafifçe karıştırılır, propidium iyodür daha sonra 5 ul (PI) pipet.
- 18-gauge iğne ile örnek bir 5 ml plastik şırınga aktarılır. İkinci örnek teslimat için 22-gauge iğne ile değiştirilir. Şırınga, buz üzerinde saklanır ve ışık FACS işlem için hazır olana kadar korunur.
2. FACS Kurulum ve Arıtma
- Sıralama Becton-Dickinson Aria IIU hücre sıralayıcı yapıldı. Bu nedenle açıklanan koşullar, özellikle farklı ekipman kullanılarak bir başlangıç noktası olarak kullanılmalıdır. Daha önce 7,8 açıklanan koşulları kullanılan.
- Aria IIU UV lazer sahip olmadığından, biz Hoescht boyama 488nm bir mavi lazer ileri ve yan dağılım tespiti için kullanılan ek olarak 405nm menekşe lazer kullanarak tespit etmek için protokol uyarladı. Ayrıca, bazı filtreler, gelişmiş dağınık arsa netliği ile sonuçlanan bazı kırmızı lazer leakiness sınırlamak amacıyla modifiye edilmiştir.
- Menekşe lazer Hoescht Mavi emisyon tespiti için bir 450/40nm bir bant geçiren ve Hoescht Kırmızı emisyon için bir 585/42nm bant geçiren yapılandırıldı. 502nm bir uzun pas kırmızı floresan mavi ayırmak için kullanılmıştır.
- 100 mikron meme 28.000 damla / saniye bir damla sürücü frekans ile kullanılmıştır. Örnek eşik hızı yaklaşık 4000 olayları / saniye idi. Sıcaklık kontrol seçeneği, 4 örnek ve toplama tüpleri korumak için kullanılan ° C sıralama tüm süresi. Ayrıca, örnek ajitasyon özelliği tür boyunca sedimenting örnek önlemek için 200 rpm'de kullanılmıştır.
- Genellikle, her nüfus için 0.5-2.0x10 6 hücreli (temsilcisi bölümüne bakınız) toplanması için izin 02:58 testisler 6 saat her tür işlendi.
- Örnek şırıngadan reçete yaklaşık 750μl alikotları sıralanır. Bu arada, bu duraklamalar sırasında toplama tüpleri 4 tutuldu ° C, ışıktan korumalı ve yavaşça önce sürdürme tür karışık.
- % 10 FCS ile desteklenmiş 250μl DMEM içeren bir 12x75mm cam borosilicated toplama tüpünün içine sıralanır örnekleri toplandı.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Tipik bir FACS profili Şekil 1'de gösterilmiştir. Mayoz bölünme önemli adımlar tespit edilir ve göstergede gösterilir. Hoechst 33.342 optimal değildir leke varsa, çok daha kompakt küresel bir profil görünür ve daha az belirgin olacaktır. Yaygın bir sorun, yeterli DNAz, hızlı hücre topaklanma neden olacaktır ekleyerek görmektedir. Zan altındaki bütün adımları ekstra DNAz eklenmesi genellikle bu sorunu çözer. Freeze inciDNAz stok (-20 ° C'de saklanan) Awing bu enzim aktivitesi hızlı kaybı sonucu olarak, asgari düzeyde tutulmalıdır.
Spo11 mayotik rekombinasyon hotspots 12 siteleri çift iplikli tatili yönlendirir mayotik endonükleaz Şekil 2. Tipik bir prematüre mayoz 12 çift iplikli sonu oluşan bir Spo11 boş testis profilleri, yanı sıra gösterir asenkron mayoz bu ilk dalga doğasını ortaya çıkarır, 13 gün yaşlı fare, ön puberous profili. Synaptonemal kompleks protein 3 (SCP3) ve fosforile histon H2AX antikorlar kombinasyonunu kullanarak Standart sitogenetik analiz aşamasında özel mayoz bölünme işaretleri ilk olarak açıklanan 11 elswhere sıralaması mayotik hücrelerinin saflık ve doğa, teyit için kullanılan olmalıdır.
Şekil 1 Wild-tip mayoz FACS profilleri. A) Temsilcisi scatter plot gösterilmiştir. Kapılı hücreler gösterilmiştir. Çoğunlukla boş membranlar ve spermatid kuyrukları içeren erişkin testis bulunan enkaz büyük miktarda unutmayın. B) bir temsilci PI arsa çok sınırlı bir örnek PI pozitif hücre miktarını gösterir. Tipik bir kapı gösterilir. C) bir temsilci yabani tip Hoechst 33.342 FACS Profil gösterilir. Daha fazla çalışma için bu yöntemi kullanarak saflaştırılmış olabilir çeşitli mayotik hücre popülasyonlarının belirtilmiştir: spermatogonium (Sp), ön-leptoten (pL), leptoten zigoten (L / Z), erken Pachytene (EP), orta Pachytene ( mP), geç-Pachytene (LP), diploten (D) ve yuvarlak spermatid (SC).
Şekil 2 Spo11 boş ve yabani tip gün 13 mayotik FACS profilleri. A) Tipik bir Spo11 boş profil zigoten / leptoten erken pachytene geçmişte hiçbir aşamada tespit edilebilir bir açık mayotik yetmezliği ile gösterilir. B) 13 gün yabani tip erkek fare profili leptoten / zigoten hücreleri yüksek konsantrasyonda gösterir. Mayoz Bu ilk dalga olarak açık bir şekilde bu yöntemi kullanarak görüntülendi yerine, asenkron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol biri eş zamanlı olarak araştırmacılar, bu temel sürecin dinamiklerini incelemek için izin yetişkin erkek fareler, çok yüksek saflıkta mayotik sahne hücrelerinin tüm aralığı arındırmak için izin verir. Saf hücrelerin RNA ekstraksiyon 9,10, nucleosome haritalama 11, rekombinant molekül algılama, protein analizi, ve daha birçok arasında değişen çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Ancak, algılama yöntemleri, saflaştırılmış mayotik hücrelerinin miktarına adapte olmak zorunda. Ayrıca, bu yöntemin yüksek tekrarlanabilirlik ile, birden fazla bağımsız türlü, belirli bir deney için gerekli malzeme miktarını artırmak için farklı günlerde yapılan aynı fraksiyonu havuzu mümkün. Ayrıca, bu yöntem bir hızla genetik nakavt, gelişim ilerlemesi sapma veya mayoz etkilemeye yönelik herhangi bir özel tedavi (örn., radyasyon etkisi etkilerini değerlendirmek için tüm mayotik süreci sağlar eşsiz bir görsel temsilini, araştırmacılar sağlar, veya küçük molekül inhibitörleri ile tedavi).
Bu protokol kritik adımlar, büyük ölçüde hücre kümeleri ve agrega kaçınarak hücre sıralama kolaylaştırır yeterli DNAz, ve (ii) mayotik sahne hücrelerinin çeşitli toplumlarda etkin bir şekilde ayırt etmek için gerekli olan tutarlı Hoechst 33.342 boyama kullanımı (i). Buna ek olarak, Şekil 1 ve video ayrıntılı gösterilen profiller elde etmek için optimum araç kurulum için FACS operatör mayotik hücre sıralama özellikleri ve özellikleri ile kendilerini tanıtmak gerekir. Menekşe lazer için optimize edilmiş yeni Leke Vybrant DyeCycle Violet (Invitrogen) ile Hoechst 33.342 yerine olası bir değişiklik olabilir. Ancak, genel profilini önemli ölçüde değiştirmek için beklenen olmaz. Sonuç olarak, kullanılan doku doğası nedeniyle, tipik bir prosedür 1 alacak ki yarım saat, 6 saat hücre sıralama için mayotik hücreleri ve 4 hazırlamak için dikkat etmek de önemlidir, ek post-tür manipülasyonlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu proje, Florida Devlet Scripps ve ödül sayıları sırasıyla Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü ve Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü R01GM085079 ve R21HD061304 paralar kısmen desteklenmiştir. Bu Scripps Araştırma Enstitüsü yazının sayısı 20.917.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type-1 | Worthington Biochemical | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C |
| Trypsin | Worthington Biochemical | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Purification, A. R. culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Namekawa, S. H. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).
- Lassalle, B. Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131, 479-487 (2004).
- Bastos, H. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. Genetic analysis of variation in human meiotic recombination. PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).
- Roig, I. Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis. PLoS Genet. 6, (2010).
- Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots. EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).
- Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis. Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).
