التصوير تلألؤ بيولوجي لتقييم الاستجابات المناعية عقب زرع أنسجة القلب المهندسة (EHT)

Summary

هذا الفيديو يوضح استخدام

Abstract

واتبعت أساليب مختلفة للهندسة الأنسجة القلبية في العقود الماضية بما في ذلك استراتيجيات السقالات باستخدام المواد الأصلية أو الحيوي الصناعي سقالة ، انحباس myocytes القلب في الهلاميات المائية مثل الليفين أو الكولاجين والتراص من monolayers العضلية ^1. هذه المفاهيم تهدف إلى استعادة وظيفة القلب للخطر (على سبيل المثال بعد احتشاء عضلة القلب) أو نماذج تجريبية (مثل علم السموم التنبؤي وفحص مادة أو النمذجة المرض). الرصد الدقيق للبقاء على قيد الحياة بعد زرع خلايا أنسجة القلب هندسيا (EHT) أصبح من الممكن الآن استخدام التقنيات في الجسم الحي ، تلألؤ بيولوجي (BLI) التصوير ^2. نحن هنا وصف جيل من الليفين المستندة EHT الفئران من سلالة معدلة وراثيا مع التعبير في كل مكان من luciferase يراعة (ROSA / تيراغرام luciferase - LEW ؛ ^3). يتم تنفيذ غرس في أكبر سلالات الفئران الثرب مختلفة لتقييم الاستجابات المناعية للكائن المتلقي التالية زرع EHT. المقارنة بين النتائج التي تم إنشاؤها بواسطة BLI وانزيم مرتبط تقنيات سبوت المناعي (ELISPOT) تأكيد قابليتها للBLI لتقييم الاستجابات المناعية.

Protocol

1. EHT انشاء الشروط والثقافة

أنجز تصنيع الليفين المستندة EHT في مكان آخر كما هو موضح ^4. وباختصار ، لتوليد الليفين المستندة EHT لأغراض الزرع ، التي أعدت مزيجا رئيسية تحتوي على خلايا معزولة من ROSA الولدان / luciferase - قلوب الفئران المعدلة وراثيا LEW ، الفيبرينوجين الأبقار وMatrigel. وأعدت Agarose قوالب الصب باستخدام الفواصل وضعت في تفلون الأطباق ثقافة 6 - جيدا. بعد تصلب agarose ، أزيلت الفواصل ووضعت رفوف آخر سيليكون على أطباق مع الثقافة المشاركات التوصل إلى قوالب. لتوليد EHT ، كانت مختلطة لفترة وجيزة mastermix مع كمية محسوبة من ثرومبين وpipetted في القالب. بعد بلمرة الفيبرينوجين ، أزيلت بلطف مع رفوف سيليكون EHTs الانضمام إلى وظيفة من قوالب الصب agarose ، ونقل إلى 6 جديدة رفاه أطباق زراعة الخلايا والحفاظ عليها في 37 درجة مئوية ، و 7 ٪ CO ₂ خلية حاضنة الثقافة باستخدام مصنوعة خصيصا خلية ثقافة المتوسط.

تم الاحتفاظ بها في ظل ظروف EHT ثقافة الخلية حتى لمدة عشرة أيام. خلال هذه الفترة الزمنية ، بدأ الولدان خلايا قلب فأر على التواصل ، ومحاذاة ممدود على طول خطوط القوة بين الوظائف في سيليكون. في وقت الزرع ، وقد لوحظت تقلصات متماسكة عفوية ، تنحرف عن المشاركات السيليكون.

2. EHT زراعة

تم تنفيذ EHT في غرس إما مناعيا الفئران براون (الجبهة الوطنية) والنرويج ، أو الفئران عارية العوز المناعي للتحقيق في استجابة خيفي المناعي. وتم شراء 150 غراما من نهر تشارلز ألمانيا (7 Sandhofer خبراء المياه ، D - Sulzfeld 97633) ، ويضم في ظل الظروف التقليدية ، وتغذية الفئران القياسية طعام وماء libidum الإعلانية -- BN عارية الفئران وزنها 100. ويعيش العوز المناعي الفئران عقيمة في الفراش ، الأقفاص ، والمياه المعقمة المستخدمة. الألماني لجنة المراجعة الأخلاقية مراجعتها والموافقة على الإجراءات الحيوانية. يتم تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل الاستخدام.

يتم تنفيذ الإجراء زرع على النحو التالي :

وanesthesized الفئران مع isoflurane (2.5-3 ٪) باستخدام غرفة التعريفي. يمكن الحد من تعرض الإنسان لisoflurane من خلال العمل في الجدول اسفل أو عدم إعادة تدوير غطاء محرك السيارة. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم أثناء العملية الجراحية.

1. حلق منطقة البطن وتطبيق مرهم العين لمنع جفاف العين من خلال التخدير.
2. وضع فأر على ظهرها ووضع قناع على الأنف والفم والخمسين للحفاظ على التخدير.
3. تطهير منطقة البطن باستخدام Betadine ثم الايثانول 80 ٪. مسحة من نظيف لالقذرة ، من وسط منطقة حلق تتحرك إلى الخارج في اتجاه منطقة الشعر.
4. فحص ردود الفعل معسر القدمين الخلفيتين للتأكد من أن الفأر هو تخدير بما فيه الكفاية.
5. ثنى الحيوان وإجراء شق البطن خط الوسط التي تفصل بين الجلد والعضلات في خطوتين لفتح البطن. وتستخدم حبة تعقيم الساخن بين الجلد والعضلات الافتتاح.
6. وضع الامعاء في درجة حرارة المياه المالحة قفاز مسحوق رطب الحرة. طوى القفازات حول الامعاء لمنع فقدان الرطوبة.
7. إزالة الأنسجة الدهنية وفضح الطحال.
8. تصور وانتشار أكبر الثرب بالملقط.
9. قطع بعناية EHT من السيليكون وتعليق المشاركات هاربورفرونت الثرب أكبر.
10. التفاف حول أكبر omentus EHT والإصلاح باستخدام اثنين من الغرز واحدة 7-0 prolene (Ethicon ، Norderstedt ، المانيا)
11. الخطوة التالية في الأمعاء مرة أخرى في البطن.
12. مسح البطن مع المالحة prewarmed العقيمة.
13. إغلاق الطبقة العضلية للجدار البطن باستخدام 6-0 prolene الغرز تشغيل (Ethicon ، Norderstedt ، ألمانيا).
14. استخدام prolene 5-0 (Ethicon ، Norderstedt ، ألمانيا) تشغيل الغرز لإغلاق الجلد.
15. في حين أن الفئران لا يزال في التخدير وحقن 5 ملغ / كلغ كاربروفين تحت الجلد.
16. لتوفير ما يكفي من وعي لهذا النوع من الإجراء ، وهو يضاف مسكن (مثل Metamizol) لمياه الشرب (50 ملجم لكل 100 مل Metamizol) لعلاج الألم لمدة 3 أيام بعد الزرع.

3. تلألؤ بيولوجي من التصوير وبعد زرع EHT

تم استخدام منصة bioimaging IVIS (Xenogen ، ألاميدا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) للتصوير تلألؤ بيولوجي غير الغازية في الجسم الحي ، ويتم تحليل النتائج باستخدام صورة حية IVIS (Xenogen) حزمة البرمجيات. يتم إجراء التصوير يوميا بدءا 2 ساعة بعد الجراحة.

تخدير الفئران مع isoflurane (2.5 -- 3 ٪) باستخدام غرفة التعريفي.

1. تطهير منطقة البطن والصدر به على نطاق واسع ، بروفو اليود ، واستخدام الايثانول 80 ٪ المقبل ، كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
2. حقن د Luciferin (Xenogen ؛ 375 من وزن الجسم ملغ / كلغ) الملكية الفكرية
3. مكان الفئران مخدرة الى غرفة التصوير IVIS (ويمكن تحليل ما يصل إلى 4 الفئران في الوقت نفسه).
4. تقييم قوة إشارة لUC + الخلايا داخل EHT في وحدات ثانية / الفوتونات / سم ² / steridianin المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في الأساس (120 دقيقة بعد زرع) وفي أيام 1 ، 2 ، 3 ، 5 ، 7 ، 10 ، وفي الأسابيع 2 ، 3 و 4. لاحظ إشارة الذروة (يظهر حوالي 20 دقيقة بعد الحقن Luciferin د).

إنشاء رسم بياني (اكسل) تظهر كثافة إشارة مرور الوقت.

4. الربط بين النتائج وBLI ELISPOT

وكانت دراسة الخلوية داخل الجسم الحي الاستجابات المناعية في BN مناعيا والفئران عارية العوز المناعي بعد زرع EHT. وكان حصاد الطحال من الحيوانات المتلقية 5 أيام بعد زرع EHT لعزل splenocytes المتلقية. المقايسات Elispot باستخدام mitomycin - منعت EHTs (سيغما الدريتش ، وسانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ومنشط و 5 splenocytes X10 المتلقي كما تم تنفيذ ⁶ خلايا المستجيب وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة دينار بحريني (العلوم البيولوجية) باستخدام الإنترفيرون γ والمغلفة IL - 4 لوحات للتحقيق TH1 ، والاستجابة TH2 ، على التوالي. الإنترفيرون γ وIL - 4 نقاط كانت أعلى بشكل ملموس في النموذج ، مناعيا بالمقارنة مع النموذج العوز المناعي (IFN - γ : ع = 0.001 ؛ IL - 4 : ع = 0.023 ؛ الطالب اختبار t).

5. ممثل النتائج :

الشكل 1. الربط بين النتائج وBLI ELISPOT أ) ودرس في الاستجابات المناعية الخلوية المجراة في النرويج براون مناعيا والفئران عارية العوز المناعي بعد زرع EHT. كانت تحصد splenocytes المتلقي 5 أيام بعد غرس EHT. الإنترفيرون؟ وجرى تقييم IL - 4 التعبير المقايسات ELISpot mitomycin به ، كما منعت EHT التحفيز والتشجيع وsplenocytes المتلقي 5x106 كخلايا مستجيب. وTH1 والاستجابات TH2 أعلى بكثير في النموذج مناعيا بالمقارنة مع النموذج العوز المناعي كما يتضح من IFNγ و- IL - 4 الإنتاج على التوالي. ب) تم زرع لوك + EHTs في omentus أكبر من أي من الفئران أو الجرذان BN مناعيا عارية العوز المناعي. وأعقب طوليا بقاء الخلية BLI. وتقدم نسبة الحيوانات التي رفضت EHTs المزروعة. جميع الفئران BN رفض زرع EHT بسرعة ، في حين نجا الخلايا في الفئران الخلايا التائية ناقصة.

Discussion

قبل التنفيذ السريرية التكنولوجيا EHT لإصلاح القلب ، والمسائل الأساسية مثل استمناع كل من المكونات الخلوية والمصفوفة أو البقاء على قيد الحياة بعد زرع الفساد تحتاج إلى تقييم في النماذج التجريبية. التصوير داخل الجسم الحي تلألؤ بيولوجي يمثل تقنية جديدة مفيدة للبقاء على قيد الحياة بعد زرع الخلايا الرصد . نحن ولدت بنجاح الليفين المستندة EHT تحتوي luciferase الموجب (+ لوك) خلايا القلب من التكيف لبروتوكول إنشاء ^4. وزرعت هذه EHT في الثرب أكبر من الفئران المتلقية. حقن داخل الصفاق من ركيزة معينة (د Luciferin) يولد إشارات التي تم كشفها باستخدام منصة bioimaging IVIS (Xenogen). كثافة إشارة في الأساس (120 دقيقة بعد الزرع) في قياس الفوتونات / ثانية / سم ² / steridian عمل كمعلمة بديلة لعدد من الخلايا داخل EHTs المطعمة. القياسات اليومية المسموح بها لغير الغازية assessement الطولي للبقاء الكسب غير المشروع. في نموذج الرفض ، فقد ارتبط انخفاض كثافة إشارة مرور الوقت مع كثافة وحركية الرفض الحاد في سلالات الفئران مختلفة.

Materials

LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753) Matrigel (BD Bioscience 356235) DMEM (Biochrome F0415) Horse serum (Gibco 26050) Penicillin/streptomycin (Gibco 15140) Insulin (Sigma-Aldrich I9278) Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) d-Luciferin (Biosynth L-8220) Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)