Biolumineszenz-Bildgebung für die Beurteilung von Immunantworten nach der Implantation von Engineered Heart Tissue (EHT)

Summary

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Abstract

Verschiedene Techniken der kardialen Tissue Engineering haben in den vergangenen Jahrzehnten auch Gerüste Strategien entweder nativ oder bioartifiziellen Gerüstmaterial, Einschluss von Herzmuskelzellen in Hydrogele wie Fibrin oder Kollagen und Stapeln von Myozyten Monoschichten ^{dem 1.} verfolgt. Diese Konzepte zielen auf die Wiederherstellung der Herzfunktion (z. B. nach Myokardinfarkt) oder als experimentelle Modelle (zB zur prädiktiven Toxikologie und Wirkstoff-Screening oder Krankheit Modellierung). Präzise Überwachung der das Überleben der Zelle nach Implantation von Engineered Heart Tissue (EHT) ist inzwischen möglich, mit in-vivo Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) Techniken ^2. Hier beschreiben wir die Erzeugung von Fibrin-basierten EHT aus einem transgenen Ratten-Stamm mit ubiquitäre Expression von Luciferase (ROSA / Luciferase-LEW Tg, ^3). Die Implantation ist in das große Netz verschiedener Zuchtlinien, um Immunreaktionen des Empfängerorganismus folgenden EHT Implantation beurteilen durchgeführt. Ein Vergleich der Ergebnisse von BLI und die Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) bestätigen die Verwendbarkeit von BLI für die Beurteilung der Immunantwort generiert.

Protocol

1. EHT-Generation und Kulturbedingungen

Herstellung von Fibrin-basierten EHT erfolgte wie an anderer Stelle beschrieben ^4. In kurzen, an Fibrin-basierten EHT für die Implantation Zwecke zu generieren, wurde ein Master-Mix hergestellt, die Zellen von Neugeborenen ROSA / Luciferase-LEW transgenen Rattenherzen, Rinder-Fibrinogen und Matrigel isoliert. Agarose Gussformen wurden unter Verwendung von Teflon Abstandshalter in 6-well Kulturschalen gelegt. Nach dem Erstarren der Agarose wurden Abstandhalter entfernt und Silikon-Post-Racks wurden auf Kulturschalen mit einem Thema bis in die Formen gelegt. Zur Erzeugung von EHT, war der Mastermix kurz mit einer berechneten Menge von Thrombin gemischt und pipettiert in die Form. Nach der Polymerisation von Fibrinogen, wurden Silikon-Racks mit EHTs Einhaltung der Beiträge vorsichtig aus dem Agarose-Gießformen, die mit neuen 6-well Zellkulturschalen und in einer 37 ° C, 7% CO ₂ Zellkulturbrutschrank entfernt mit maßgeschneiderten Zellkulturmedium.

EHT wurden unter Zellkultur-Bedingungen bis zum zehnten Tag gehalten. Während dieser Zeitspanne begann neugeborenen Ratten Herzzellen zu langgestreckten, Interconnect und richten entlang Kraftlinien zwischen Silikon-Beiträge. Zum Zeitpunkt der Implantation wurden spontane kohärente Kontraktionen beobachtet, Ablenkung Silikon Beiträge.

2. EHT Implantation

EHT-Implantation war in beiden immunkompetenten Brown Norway (BN) Ratten oder immundefizienten Nacktratten durchgeführt, um die allogene Immunantwort zu untersuchen. BN und nackte Ratten mit einem Gewicht von 100 bis 150 g wurden von Charles River Deutschland (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) erworben und beherbergte unter üblichen Bedingungen, gefüttert Standard Rattenfutter und Wasser ad libidum. Immundefizienten Ratten sind in sterilen Betten, Käfige und keimfreies Wasser verwendet untergebracht. Die deutsche Ethikkommission geprüft und genehmigt das Tier Verfahren. Alle chirurgischen Instrumente sind vor dem Gebrauch sterilisiert.

Die Implantation sind wie folgt durchgeführt:

Rat sind mit Isofluran (2.5-3%) mit einer Induktion Kammer narkotisiert. Exposition des Menschen gegenüber Isofluran kann durch Arbeiten in einem Fallstrom Tabelle oder Nicht-Rückführung Motorhaube reduziert werden. Die Körpertemperatur ist während des chirurgischen Eingriffs beibehalten.

1. Shave Bauchbereich und gelten Augensalbe auf die Augen vor dem Austrocknen während der Narkose zu verhindern.
2. Legen Sie die Ratte auf den Rücken und legen Sie eine Gesichtsmaske über seinen Mund und Nase zu halten die Anästhesie.
3. Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit Betadine und dann 80% Ethanol. Swab von Clean bis schmutzig, von der Mitte des rasierten Bereich bewegt nach außen in Richtung der behaarten Bereich.
4. Überprüfen Reflexe kneifen die Hinterfüße sicher sein, dass die Ratte ausreichend betäubt ist.
5. Hängen Sie die Tiere und führen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt Trennung der Haut und Muskeln in zwei Schritten auf den Bauch zu öffnen. Hot bead Sterilisation zwischen Haut und Muskel Öffnung verwendet.
6. Setzen Sie den Darm in einer angewärmten Kochsalzlösung befeuchtet puderfrei Handschuhe. Klappen Sie den Handschuh um den Darm, um den Verlust von Feuchtigkeit zu verhindern.
7. Entfernen Fettgewebe und setzen die Milz.
8. Visualisieren und breitete das große Netz mit einer Pinzette.
9. Schneiden Sie vorsichtig EHT vom Aussetzung Silikon Beiträge und Übertragung auf das große Netz.
10. Wickeln Sie das größere omentus rund um die EHT und fix mit zwei Einzelbetten 7-0 Prolene Fäden (Ethicon, Norderstedt, Deutschland)
11. Nächstes verschieben Sie den Darm wieder in den Bauch.
12. Spülen Sie den Bauch mit vorgewärmtem steriler Kochsalzlösung.
13. Schließen Sie die Muskelschicht der Bauchwand mit 6-0 Prolene fortlaufenden Nähten (Ethicon, Norderstedt, Deutschland).
14. Verwenden Sie 5-0 Prolene (Ethicon, Norderstedt, Deutschland) läuft Nähte auf der Haut zu schließen.
15. Während die Ratte immer noch in Narkose, injizieren 5 mg / kg Carprofen subkutan.
16. Um eine ausreichende Analgesie für diese Art von Verfahren, ein Analgetikum (z. B. Metamizol) ist mit dem Trinkwasser (50 mg Metamizol pro 100 ml) für Schmerzmittel für 3 Tage nach der Transplantation gegeben sind.

3. Biolumineszenz-Bildgebung des EHT nach der Implantation

Die IVIS Bioimaging Plattform (Xenogen, Alameda, CA, USA) ist für nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung in vivo verwendet und die Ergebnisse werden mit Hilfe der IVIS Wohnen Image (Xenogen) Software-Paket. Imaging durchgeführt wird täglich ab 2 Stunden postoperativ.

Anesthetize Ratte mit Isofluran (2,5 bis 3%) mit einer Induktion Kammer.

1. Desinfizieren Sie die Bauch-und Brustbereich weit über Provo-Jod, nächsten Einsatz 80% Ethanol, wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
2. Inject d-Luciferin (Xenogen; 375 mg / kg Körpergewicht) ip
3. Legen Sie narkotisierten Ratten in die IVIS Bildgebung Kammer (bis zu 4 Ratten können gleichzeitig analysiert werden).
4. Beurteilen Signalintensität luc + Zellen innerhalb EHT in Einheiten von Photonen / sec / cm ² / steridianin der region of interest (ROI) zu Studienbeginn (120 Minuten nach der Implantation) und an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7, 10, und in den Wochen 2, 3 und 4. Beachten Sie die Peak-Signal (erscheint ca. 20 Minuten nach dem D-Luciferin-Injektion).

Erstellen Sie eine Grafik (Excel) zeigt die Signalstärke über die Zeit.

4. Korrelation von BLI Ergebnisse und ELISPOT

Die zellulären in-vivo Immunantworten in immunkompetenten BN und immundefizienten nude Ratten wurden nach EHT Transplantation untersucht. Die Milz des Empfängers Tieren geerntet wurde 5 Tage nach EHT Transplantation Empfänger Splenozyten zu isolieren. Elispot Assays unter Verwendung von Mitomycin-gehemmte EHTs (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) als Stimulator und 5 x10 ⁶ Empfänger Splenozyten als Responder-Zellen nach dem Protokoll des Herstellers (BD Biosciences) mit IFN-γ und IL-4 beschichtete durchgeführt wurden Platten zu untersuchen, TH1-und TH2-Antwort, bzw.. IFN-γ-und IL-4-Spots waren signifikant höher in der immunkompetenten, Modell im Vergleich zu den immundefizienten Modell (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; Student-t-Test).

5. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. Korrelation von BLI Ergebnisse und ELISPOT a) Die zellulären in vivo Immunantworten in immunkompetenten Brown Norwegen und immundefizienten nude Ratten wurden nach EHT-Implantation untersucht. Empfänger Splenozyten wurden 5 Tage nach der Implantation EHT geerntet. IFN? und IL-4-Expression wurde durch ELISPOT-Assays mit Mitomycin-gehemmte EHT als Stimulatoren und 5x106 Empfänger Splenozyten als Responder-Zellen ausgewertet. Th1 und Th2-Antworten waren signifikant höher in der immunkompetenten Modell im Vergleich zu den immundefizienten Modell als durch IFNy-und IL-4 Produktion bzw. belegt. b) Luc + EHTs wurden in den größeren omentus entweder immunkompetenten BN Ratten oder immundefizienten nude Ratten transplantiert. Überleben der Zellen wurde in Längsrichtung durch BLI gefolgt. Die Rate der Tiere, dass die transplantierten EHTs abgelehnt wird vorgestellt. Alle BN Ratten schnell wies die EHT-Transplantationen, während die Zellen überlebten in T-Zell-defizienten Ratten.

Discussion

Bevor klinische Umsetzung der EHT-Technologie für die Herz-Reparatur, müssen grundlegende Fragen wie die Immunogenität der beiden Mobilfunk-und Matrix-Komponenten oder Transplantat-Überlebens nach der Implantation in experimentellen Modellen bewertet werden. In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung stellt eine nützliche neue Technik für die Überwachung der das Überleben der Zelle nach der Transplantation . Wir haben erfolgreich Fibrin-basierten EHT generiert mit Luciferase positive (luc +) Herzzellen durch Anpassung eines etablierten Protokoll ^4. Diese EHT wurden in das große Netz der Empfänger-Ratten implantiert. Intraperitoneale Injektion des spezifischen Substrats (d-Luciferin) Signale erzeugt, die nachweisbar mit dem IVIS Bioimaging Plattform (Xenogen) wurden. Signalintensität bei Studienbeginn (120 Minuten nach der Implantation) in Photonen / sec / cm ² / steridian als Surrogat-Parameter für die Anzahl der Zellen im Inneren veredelt EHTs serviert gemessen. Tägliche Messungen für nicht-invasive Längs die Überlegenheit der Transplantat-Überlebens erlaubt. In einer Ablehnung Modell wurde Niedergang der Signalintensität im Laufe der Zeit mit der Intensität und Kinetik der akuten Abstoßung in verschiedenen Rattenstämmen korreliert.

Materials

LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753) Matrigel (BD Bioscience 356235) DMEM (Biochrome F0415) Horse serum (Gibco 26050) Penicillin/streptomycin (Gibco 15140) Insulin (Sigma-Aldrich I9278) Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) d-Luciferin (Biosynth L-8220) Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)