Engineered Kalp Doku İmplantasyonu takiben İmmün Yanıtların Değerlendirilmesi (EHT) Biyoparlaklık Görüntüleme

Summary

Bu video kullanımını gösterir

Abstract

Çeşitli kardiyak doku mühendisliği teknikleri, yerli veya biyoyapay ya iskele malzemeleri, örneğin fibrin ve kollajen gibi hidrojeller, kardiyak miyositler miyosit mono ^tabakaları 1 tuzak ve istifleme kullanarak iskele stratejileri de dahil olmak üzere geçmiş yıllarda takip edilmiştir . Bu kavramlar tehlikeye kalp fonksiyonu (örneğin miyokard enfarktüsü sonra) restorasyonu veya deneysel modellerde (örneğin tahmin toksikoloji ve madde taraması ya da hastalık modelleme) olarak hedefliyoruz. Mühendislik kalp dokusu (EHT) implantasyon sonrası hücre sağkalım hassas izleme biyoparlaklık görüntüleme (BLI) teknikleri ^2-vivo kullanarak mümkün hale gelmiştir. Burada bir ateşböceği lusiferaz ⁽³ ROSA / lusiferaz LEW Tg) her yerde ifade ile transgenik sıçan suşu fibrin tabanlı EHT nesil açıklar. İmplantasyon EHT implantasyon sonrası alıcı organizmanın bağışıklık yanıtlarını değerlendirmek için farklı sıçan suşlarının büyük omentum içine yapılır. BLI ve Enzim Bağlı İmmüno Nokta Tekniği (ELISPOT) bağışıklık yanıtlarının değerlendirilmesi için BLI kullanılabilirlik onaylayın tarafından oluşturulan sonuçların karşılaştırılması.

Protocol

1. EHT Üretimi ve Kültür Koşullar

Fibrin EHT imalatı başka yerde ⁴ açıklandığı gibi yapıldı. Kısacası, implantasyon amaçlı fibrin tabanlı EHT oluşturmak için, bir master karışımı yenidoğan ROSA / lusiferaz LEW transgenik sıçan kalpleri, sığır fibrinojen ve Matrigel izole hücreler içeren hazırlanmıştır. Agaroz döküm kalıpları, 6 kuyu kültür yemekleri yerleştirilen teflon ayırıcılar kullanılarak hazırlanmıştır. Agaroz katılaşma sonra, ayırıcılar çıkarıldı ve silikon yazılan rafları, kalıplar içine ulaşan mesajların kültür kaplarına yerleştirildi. EHT oluşturmak için, Mastermix kısaca trombin hesaplanan miktarı ile karıştırılır ve kalıp pipetlenir. Fibrinojenin polimerizasyonu sonra, mesaj için yapışmış EHTs silikon rafları hafifçe ölçüye yeni 6-kuyu hücre kültür kaplarına aktarılır ve 37 ° C'de,% 7 CO ₂ hücre kültürü inkübatör muhafaza agaroz döküm kalıpları çıkarıldı hücre kültür ortamı.

EHT on gün kadar hücre kültürü şartlar altında tutuldu. Bu zaman dilimi boyunca, yenidoğan sıçan kalp hücrelerinin uzamış birbirine başladı ve silikon mesajları arasındaki kuvvet çizgileri boyunca hizalayın. Implantasyon zamanda silikon mesajları saptırma, spontan tutarlı kasılmalar gözlendi.

2. EHT İmplantasyon

EHT implantasyon allojenik bağışıklık yanıtının araştırılması immünkompetan Brown Norveç (BN) sıçanlarda, ya da immünyetmezligi çıplak sıçanlarda yapıldı. BN ve çıplak sıçanlarda ağırlığı 100 - 150 g Charles River Almanya (Sandhofer Weg 7, D-97.633 Sulzfeld) satın alınan ve geleneksel koşulları altında, beslenen standart sıçan yemi ve su reklam libidum alır. Immünyetmezligi sıçanlarda steril yataklar, kafesleri, ve sterilize su kullanılan yerleştirilmiştir. Alman etik komitesi ve hayvan işlemleri onaylanmış. Tüm cerrahi aletler kullanmadan önce sterilize edilir.

Implantasyon prosedürü şu şekilde yapılır:

Rat indüksiyon odası (% 2.5-3) izofluran ile anesthesized. İnsan izofluran için maruz kalma, bir aşağı hava akışı tablosu veya non-sirkülasyon kaput çalışan düşebilir. Vücut ısısı, cerrahi işlem sırasında korunur.

1. Karın bölgesinde Tıraş ve gözleri anestezi sırasında kurumasını önlemek için göz merhemi geçerlidir.
2. Sırtında sıçan yerleştirin ve anestezi tutmak için burun ve ağız içinde bir facemask yerde.
3. Betadine ve daha sonra% 80 etanol kullanarak karın bölgesi dezenfekte edin. Traş alanının merkezine temiz kirli Swab, saçlı alanda dışa doğru hareket.
4. Sıçan yeterli anestezi olduğundan emin olmak için arka ayaklarının kısma refleksleri kontrol edin.
5. Hayvan Örtüsü ve karın açmak için iki adımda cilt ve kas ayıran orta hat abdominal kesi gerçekleştirmek. Sıcak boncuk sterilizasyon, cilt ve kas açılış arasındaki kullanılır.
6. Isıtılmış bir tuzlu nemli toz ücretsiz eldiven bağırsak yerleştirin. Bağırsakların çevresinde nem kaybını önlemek için eldiven katlayın.
7. Yağ dokusu çıkarın ve dalak maruz.
8. Forseps ile büyük omentum gözünüzde canlandırın ve yayılmıştır.
9. Büyük omentum üzerine silikon mesaj ve transfer askıya EHT dikkatlice kesin.
10. EHT etrafında büyük omentus sarın ve iki tek 7-0 prolen sütür (Ethicon, Norderstedt, Almanya) kullanılarak düzeltme
11. Sonraki bağırsaklar karın içine taşıyın.
12. Karın prewarmed steril tuzlu su ile yıkayın.
13. 6-0 prolen çalışan dikişler (Ethicon, Norderstedt, Almanya) ile karın duvarı kas tabakası kapatın.
14. Cilt kapatmak için sütürlerinin 5-0 prolen (Ethicon, Norderstedt, Almanya) kullanın.
15. Rat anestezi hala iken, subkutan 5 mg / kg Carprofen enjekte.
16. Prosedürü bu tür bir analjezik (örneğin metamizol olarak) 3 gün transplantasyon sonrası için ağrı kesici ilaçlar için içme suyu (100 ml başına 50 mg metamizol) eklenir yeterli analjezi sağlamak.

3. EHT ardından İmplantasyon Biyoparlaklık Görüntüleme

IVIS bio platformu (Xenogen, Alameda, CA, USA), non-invaziv in vivo biyoparlaklık görüntüleme için kullanılır ve sonuç IVIS Yaşam Resim (Xenogen) yazılım paketi kullanılarak analiz edilmektedir . Görüntüleme günde 2 saat postoperatif başlangıç ​​yapılır.

Indüksiyon odasına kullanarak - (3% 2.5) izofluran ile sıçan anestezisi.

1. Provo-İyot, bir sonraki kullanım% 80 etanol, bu adımı üç kez tekrarlayacak ve yaygın karın ve göğüs bölgesi dezenfekte edin.
2. Ip, d-luciferase (375 mg / kg vücut ağırlığı Xenogen) enjekte edilir
3. Anestezi sıçanlarda IVIS görüntüleme odası (en fazla 4 fareler aynı zamanda analiz edilebilir) içine yerleştirin.
4. L sinyal şiddeti değerlendirinuc + fotonlar / sn / cm ² / steridianin başlangıçta ilgi bölge (ROI) (120 dakikası implantasyon sonrası) birimi içinde ve gün 1, 2, 3, 5, 7, 10, ve hafta 2 EHT içinde hücreler, 3 ve 4. Zirve sinyali (d-luciferase enjeksiyondan sonra yaklaşık 20 dakika) dikkat edin.

Zamanla sinyal yoğunluğu gösteren bir grafik (Excel) oluşturun.

4. BLI Sonuçlar Korelasyon ve ELISPOT

EHT nakli sonrası bağışıklık sistemi BN ve immünyetmezligi çıplak sıçanlarda in vivo hücresel immün yanıtları incelendi. Alıcının hayvanların dalak EHT nakli alıcı splenositlerin izole etmek için 5 gün sonra hasat edildi. Cevapçı hücreleri IFN-γ ve IL-4 kaplı üretici protokolü (BD Biosciences) göre yapıldı ELISPOT testleri kullanarak Stimülatörü ve 5 x10 ⁶ alıcı dalak gibi EHTs (Sigma Aldrich, St Louis, MO, ABD) mitomisin-inhibe araştırmak için plakalar TH1, TH2 tepki idi. IFN-gama ve IL-4 noktalar bağışıklık sistemi, model immünyetmezligi modele göre anlamlı düzeyde yüksek bulundu (IFN-γ: p = 0.001, IL-4: p = 0.023; Student t-testi).

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1. BLI sonuçları ve ELISPOT korelasyon) hücresel bağışıklık sistemi Brown Norveç ve immünyetmezligi çıplak sıçanlarda in vivo immün yanıtları EHT implantasyon sonrası incelendi. Alıcı splenositlerin EHT implantasyon 5 gün sonra hasat edildi. IFN? ve IL-4 ekspresyonu cevaplayıcı hücreleri olarak uyarıcı ve 5x106 alıcı splenositlerin olarak mitomisin-inhibe EHT kullanarak ELISPOT testleri ile değerlendirildi. Th1 ve Th2 yanıtları immünkompetan modeli sırasıyla IFNγ ve IL-4 üretimi ile kanıtlanan immünyetmezligi modele göre anlamlı derecede yüksekti. b) Luc + EHTs immünkompetan BN fareler ya da immünyetmezligi çıplak sıçanlarda ya da daha fazla omentus naklediliyor. Hücre hayatta kalma boyuna BLI izledi. Nakledilen EHTs reddetti hayvanların oranı sunulmaktadır. Tüm BN sıçanlarda hücreleri T hücre eksikliği olan sıçanlarda hayatta iken hızla EHT nakli reddetti.

Discussion

Klinik uygulama önce kalp onarımı için EHT teknoloji, implantasyon sonrası hücresel ve matriks bileşenleri veya greft sağkalım immünojenitesini gibi temel sorular deneysel modellerde değerlendirilmesi gerekir. In-vivo biyoparlaklık görüntüleme transplantasyonu sonrası izleme hücrenin hayatta kalabilmek için yeni ve yararlı bir tekniği temsil eder . Biz başarıyla içeren fibrin tabanlı EHT oluşturulan olumlu lusiferaz (luc +) kurulmuş bir protokol ⁴ adaptasyon kalp hücreleri. Bu EHT alıcı sıçanların büyük omentum içine implante edildi. Özel substrat (d-luciferase) intraperitoneal IVIS bio platformu (Xenogen) kullanılarak algılanamaz olan sinyalleri üretir. Başlangıçta Sinyal yoğunluğu (implantasyon sonrası 120 dakika) / sn / cm ² / steridian aşılı EHTs içinde hücre sayısı için bir vekil parametre olarak görev yaptı fotonlar ölçülür. Günlük ölçümler greft sağkalım non-invaziv uzunlamasına assessement için izin verdi. Bir ret modeli, sinyal yoğunluğu zaman içinde düşüş farklı sıçan suşları yoğunluğu ve akut rejeksiyon kinetiği ile korele bulunmuştur.

Materials

LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753) Matrigel (BD Bioscience 356235) DMEM (Biochrome F0415) Horse serum (Gibco 26050) Penicillin/streptomycin (Gibco 15140) Insulin (Sigma-Aldrich I9278) Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) d-Luciferin (Biosynth L-8220) Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)