Imagerie par bioluminescence pour l'évaluation des réponses immunitaires après l'implantation du tissu cardiaque d'ingénierie (ISE)

Summary

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Abstract

Diverses techniques d'ingénierie tissulaire cardiaque ont été poursuivis dans les dernières décennies, y compris les stratégies d'échafaudage en utilisant soit natif ou bioartificiel matériaux d'échafaudage, piégeage des myocytes cardiaques dans les hydrogels tels que la fibrine ou de collagène et l'empilement des monocouches myocytes ^1. Ces concepts visent à la restauration de la fonction cardiaque compromise (par exemple après un infarctus du myocarde) ou comme modèles expérimentaux (par exemple, la toxicologie prédictive et le dépistage de substances ou de modélisation de la maladie). Un suivi précis de la survie des cellules après l'implantation du tissu cardiaque d'ingénierie (ISE) est désormais possible en utilisant la bioluminescence in vivo d'imagerie (BLI) des techniques ^2. Nous décrivons ici la génération de base de fibrine ISE partir d'une souche de rats transgéniques avec expression ubiquitaire de la luciférase de luciole (ROSA / luciférase-LEW Tg; ^3). L'implantation est réalisée dans le grand omentum des différentes souches de rats afin d'évaluer la réponse immunitaire de l'organisme receveur après l'implantation d'ISE. Comparaison des résultats générés par BLI et l'enzyme liée Technique spot Immuno (ELISPOT) confirment l'utilité de BLI pour l'évaluation des réponses immunitaires.

Protocol

1. Génération d'ISE et de la Culture Conditions

Fabrication de base de fibrine ISE a été réalisée comme décrit par ailleurs ^4. En bref, pour produire à base de fibrine ISE à des fins d'implantation, un mélange maître a été préparée contenant des cellules isolées à partir néonatale ROSA / luciférase-LEW coeurs de rats transgéniques, le fibrinogène bovin et Matrigel. Agarose moules ont été préparés en utilisant des entretoises en téflon placés dans des boîtes de culture de 6 puits. Après solidification de l'agarose, entretoises ont été enlevés et racks message de silicone ont été placés sur des boîtes de culture avec des messages d'atteindre dans les moules. Pour générer l'ISE, le Mastermix a été brièvement mélangé à un montant calculé de la thrombine et à la pipette dans le moule. Après polymérisation du fibrinogène, des supports en silicone avec HASTI adhérant à des postes ont été délicatement retirée de la coulée des moules d'agarose, transférés à de nouveaux 6-même boîtes de culture cellulaire et maintenu dans un 37 ° C, 7% de CO ₂ incubateur de culture cellulaire à l'aide sur-mesure milieu de culture cellulaire.

ISE ont été conservés dans des conditions de culture cellulaire jusqu'à dix jours. Pendant ce laps de temps, les cellules de coeur de rat néonatal a commencé à allongée, d'interconnexion et d'aligner le long des lignes de force entre les deux poteaux de silicone. Au moment de l'implantation, les contractions spontanées cohérentes ont été observées, en déviant les messages de silicone.

2. Implantation d'ISE

L'implantation d'ISE a été réalisée en soit immunocompétent brun de Norvège (BN), les rats, ou immunodéficientes rats nus pour étudier la réponse allogénique immunitaire. Rats BN et nue pesant 100 - 150 g ont été achetés auprès de Charles River Allemagne (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) et logés dans des conditions classiques, nourris standards pour rats et libidum ad eau. Rats immunodéprimés sont logés dans la literie stérile, les cages, et de l'eau stérilisée est utilisée. Le comité d'examen éthique allemande examiné et approuvé les procédures animales. Tous les instruments chirurgicaux sont stérilisés avant leur utilisation.

La procédure d'implantation sont effectués comme suit:

Rat sont anesthésiés à l'isoflurane (2,5-3%) en utilisant une chambre d'induction. L'exposition humaine à l'isoflurane peut être réduit en travaillant dans une table aspirante ou non-recirculation capot. La température corporelle est maintenue pendant l'intervention chirurgicale.

1. Rasez la zone abdominale et d'appliquer une pommade oculaire pour éviter les yeux de sécher pendant l'anesthésie.
2. Placez le rat sur son dos et placer un masque sur sa bouche et le nez pour maintenir l'anesthésie.
3. Désinfectez la zone abdominale à l'aide Bétadine puis 80% d'éthanol. Swab de nettoyage de salir, de centre de la zone rasée déplaçant vers l'extérieur vers la zone de cheveux.
4. Vérifiez réflexes pinçant les pattes postérieures pour être sûr que le rat est suffisamment anesthésiés.
5. Drapé de l'animal et d'effectuer une incision abdominale médiane séparant la peau et de muscle en deux étapes pour ouvrir le ventre. La stérilisation à chaud billes est utilisé entre la peau et l'ouverture du muscle.
6. Placez les intestins dans un gant de poudre de sérum physiologique réchauffé hydratée libre. Pliez le gant autour de l'intestin pour empêcher la perte d'humidité.
7. Enlever les tissus adipeux et exposer la rate.
8. Visualisez et la propagation grand omentum avec une pince.
9. Découpez soigneusement l'ISE de suspendre les messages de silicone et de transfert sur le grand épiploon.
10. Enveloppez la plus grande autour de la omentus ISE et de fixer l'aide de deux simples sutures 7-0 Prolène (Ethicon, Norderstedt, Allemagne)
11. Suivant déplacer les intestins dans l'abdomen.
12. Rincer l'abdomen avec une solution saline stérile préchauffée.
13. Fermez la couche musculaire de la paroi abdominale en utilisant 6-0 prolène sutures course (Ethicon, Norderstedt, Allemagne).
14. Utilisez 5-0 Prolène (Ethicon, Norderstedt) fonctionnant sutures pour refermer la peau.
15. Alors que le rat est encore en anesthésie, injecter 5 mg / kg carprofène sous-cutanée.
16. Pour fournir une analgésie suffisante pour ce type de procédure, un analgésique (comme Metamizol) est ajouté à l'eau potable (50 mg par 100 ml Metamizol) pour des analgésiques pour 3 jours après la transplantation.

3. Imagerie par bioluminescence de suite à l'implantation d'ISE

La plate-forme bio-imagerie IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA) est utilisé pour l'imagerie par bioluminescence non-invasif in vivo et les résultats sont analysés en utilisant l'image vivante IVIS (Xenogen) logiciel. L'imagerie est effectuée quotidiennement à partir de 2 heures après l'opération.

Anesthetize rat avec l'isoflurane (2,5 - 3%) en utilisant une chambre d'induction.

1. Désinfectez la zone abdominale et thoracique en utilisant largement Provo-iode, la prochaine utilisation d'éthanol à 80%, répétez cette étape trois fois.
2. Injecter D-luciférine (Xenogen; 375 mg / kg) ip
3. Placez rats anesthésiés dans la chambre d'imagerie IVIS (jusqu'à 4 rats peuvent être analysés en même temps).
4. Évaluer l'intensité du signal de luc + cellules à l'intérieur d'ISE dans les unités de photons / sec / cm ² / steridianin la région d'intérêt (ROI) au départ (120 minutes après l'implantation) et aux jours 1, 2, 3, 5, 7, 10, et aux semaines 2, 3 et 4. Notez le signal de crête (apparaît environ 20 minutes après l'injection D-luciférine).

Créer un graphique (Excel) montrant l'intensité du signal dans le temps.

4. Corrélation des résultats BLI et ELISPOT

Le cellulaire in vivo des réponses immunitaires chez BN immunocompétents et immunodéprimés rats nus ont été étudiés après la transplantation d'ISE. La rate des animaux receveurs a été récolté 5 jours après la transplantation d'ISE pour isoler splénocytes destinataire. Tests ELISPOT en utilisant la mitomycine-inhibée HASTI (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) comme stimulateur et 5 splénocytes x10 bénéficiaires ⁶ comme cellules répondeuses ont été effectués selon le protocole du fabricant (BD Biosciences) en utilisant l'IFN-γ et IL-4 revêtement plaques d'enquêter TH1, TH2 et la réponse, respectivement. IFN-γ et IL-4 spots ont été significativement plus élevé dans le immunocompétents, le modèle par rapport au modèle immunodéficientes (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; t de Student-test).

5. Les résultats représentatifs:

Figure 1. Corrélation des résultats BLI et ELISPOT a) Le cellulaire in vivo des réponses immunitaires chez immunocompétents Brown Norvège et immunodéficientes rats nus ont été étudiés après l'implantation d'ISE. Récipiendaire splénocytes ont été récoltés 5 jours après l'implantation d'ISE. IFN? et IL-4 d'expression a été évaluée par tests ELISPOT en utilisant la mitomycine-inhibée ISE comme stimulateurs et 5x106 splénocytes destinataire comme cellules répondeuses. Th1 et Th2 étaient significativement plus élevés dans le modèle immunocompétentes par rapport au modèle immunodéficientes comme en témoigne IFNy et IL-4, respectivement. b) Luc HASTI + ont été transplantées dans plus de la omentus des rats BN soit immunocompétents ou immunodéprimés rats nus. La survie des cellules a été suivie par BLI longitudinalement. Le taux d'animaux qui a rejeté l'HASTI transplanté est présenté. Tous les rats BN rapidement rejeté les greffes de l'ISE, alors que les cellules ont survécu dans des rats de cellules T déficientes.

Discussion

Avant la mise en œuvre clinique de la technologie d'ISE pour la réparation cardiaque, des questions fondamentales telles que l'immunogénicité de deux composants cellulaires et de la matrice ou de la survie du greffon après l'implantation doivent être évalués dans des modèles expérimentaux. Imagerie par bioluminescence in vivo représente une nouvelle technique utile pour la survie des cellules de suivi après la transplantation . Nous avons réussi à généré à base de fibrine ISE contenant la luciférase positif (luc +) des cellules cardiaques par l'adaptation d'un protocole établi ^4. Ces ISE ont été implantés dans le grand épiploon du rat receveur. L'injection intrapéritonéale du substrat spécifique (D-luciférine) génère des signaux qui ont été détectable en utilisant la plate-forme bio-imagerie IVIS (Xenogen). L'intensité du signal au départ (120 minutes après l'implantation) mesurée en photons / s / cm ² / steridian servi comme un paramètre de substitution pour le nombre de cellules à l'intérieur HASTI greffé. Mesures journalières autorisées pour non-invasive Évaluation longitudinale de la survie du greffon. Dans un modèle de rejet, le déclin de l'intensité du signal dans le temps a été corrélée avec l'intensité et la cinétique de rejet aigu dans les différentes souches de rats.

Materials

LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753) Matrigel (BD Bioscience 356235) DMEM (Biochrome F0415) Horse serum (Gibco 26050) Penicillin/streptomycin (Gibco 15140) Insulin (Sigma-Aldrich I9278) Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) d-Luciferin (Biosynth L-8220) Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)