Imagem bioluminescência para avaliação das respostas imune após o implante do tecido do coração Engineered (EHT)

Summary

Este vídeo demonstra o uso de

Abstract

Várias técnicas de engenharia de tecido cardíaco foram perseguidos nas últimas décadas, incluindo estratégias de andaimes utilizando materiais nativa ou bioartificial andaime, aprisionamento de miócitos cardíacos em hidrogéis, tais como fibrina ou colágeno e empilhamento de monocamadas miócitos ^1. Esses conceitos visem a restauração de comprometimento da função cardíaca (por exemplo, após infarto do miocárdio) ou como modelos experimentais (por exemplo, toxicologia preditiva e triagem substância ou modelagem de doença). Monitoramento preciso de sobrevivência das células após o implante do tecido do coração engenharia (EHT) tornou-se possível usando in-vivo de imagem de bioluminescência (BLI) técnicas de ^2. Aqui, descrevemos a geração de fibrina baseado EHT de uma linhagem de ratos transgênicos com expressão ubíqua de firefly luciferase (ROSA / luciferase-LEW Tg; ^3). Implantação é realizada no omento maior de linhagens de ratos diferentes para avaliar a resposta imune do organismo receptor após a implantação EHT. Comparação dos resultados gerados pelo BLI e Enzyme Linked Immuno Technique spot (ELISPOT) confirmam a usabilidade de BLI para a avaliação das respostas imunes.

Protocol

1. EHT Geração e Cultura Condições

Fabricação de fibrina baseado EHT foi realizada conforme já descrito ^4. Em resumo, para gerar fibrina baseado EHT para fins de implantação, um master mix foi preparado contendo células isoladas de ROSA neonatal / luciferase-LEW corações de ratos transgênicos, fibrinogênio bovino e Matrigel. Moldes de fundição de agarose foram preparadas utilizando espaçadores Teflon colocado em pratos bem 6-cultura. Após a solidificação da agarose, espaçadores foram retirados e racks pós silicone foram colocados em placas de cultura com posts atingindo os moldes. Para gerar EHT, a Mastermix foi brevemente misturado com um montante calculado de trombina e pipetado no molde. Após a polimerização do fibrinogênio, racks de silicone com EHTs aderir aos postos foram delicadamente retirados dos moldes de fundição agarose, transferidos para novas 6-bem os pratos de cultura de células e mantidas em 37 ° C, 7% CO ₂ de cultura de células incubadora usando custom-made meio de cultura celular.

EHT foram mantidos em condições de cultura de células até o dia dez. Durante este período, as células do coração de ratos neonatal começou a interligar, de forma alongada e alinham ao longo linhas de força entre posts silicone. No momento da implantação, as contrações espontâneas coerente foram observados, desviando posts silicone.

2. Implantação EHT

EHT implantação foi realizado em ambos os imunocompetentes Brown Norway (BN) ratos ou ratos imunodeficientes nua para investigar a resposta imunológica alogênica. BN e nu ratos pesando 100-150 g foram adquiridos da Charles River Alemanha (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) e alojados em condições convencionais, alimentados padrão ração e água ad libidum. Ratos imunodeficientes estão alojados em cama estéril, gaiolas, e água esterilizada é utilizada. O comitê de revisão ética alemã analisou e aprovou os procedimentos animal. Todos os instrumentos cirúrgicos são esterilizados antes da utilização.

O procedimento de implante são realizadas da seguinte forma:

Ratos são anestesiados com isoflurano (2,5-3%) utilizando uma câmara de indução. A exposição humana à isoflurano pode ser reduzida através do trabalho em uma tabela downdraft ou capuz não recirculação. Temperatura corporal é mantida durante o procedimento cirúrgico.

1. Shave área abdominal e aplicar pomada para evitar os olhos de secar durante a anestesia.
2. Coloque o rato sobre as suas costas e colocar uma máscara sobre seu nariz e boca para manter a anestesia.
3. Desinfetar a área abdominal com Betadine e, em seguida, o etanol 80%. Cotonete limpo para sujo, do centro da área raspada se movendo para fora em direção à área de cabelos.
4. Verifique reflexos beliscar as patas traseiras para ter a certeza que o rato é suficientemente anestesiados.
5. Drape do animal e realizar uma incisão mediana abdominal separando a pele eo músculo em duas etapas para abrir o abdômen. Esterilização talão quente é usado entre a pele e abertura do músculo.
6. Coloque o intestino em uma luva de pó aquecido salina hidratada livre. Dobre a luva ao redor do intestino para evitar a perda de umidade.
7. Remover tecido adiposo e expor o baço.
8. Visualize e se espalhou omento maior com uma pinça.
9. Corte cuidadosamente EHT de suspender posts silicone e transferir para o omento maior.
10. Enrole a omentus maior em torno da EHT e corrigir usando dois única prolene 7-0 (Ethicon, Norderstedt, Alemanha)
11. Em seguida mova o intestino volta para o abdômen.
12. Lave o abdome com solução salina estéril pré-aquecido.
13. Feche a camada muscular da parede abdominal com prolene 6-0 sutura (Ethicon, Norderstedt, Alemanha).
14. Use 5-0 prolene (Ethicon, Norderstedt, Alemanha), sutura contínua para fechar a pele.
15. Enquanto o rato ainda está em anestesia, injectar 5 carprofeno mg / kg por via subcutânea.
16. Para oferecer analgesia suficiente para este tipo de procedimento, um analgésico (como metamizol) é adicionado à água potável (50 mg por 100 ml metamizol) para dor medicação por 3 dias após o transplante.

3. Imagem de bioluminescência de Implantação Após EHT

A plataforma bioimaging IVIS (Xenogen, Alameda, CA, EUA) é usado para não-invasivos de imagem de bioluminescência in-vivo e os resultados são analisados ​​utilizando a imagem viva IVIS (Xenogen) pacote de software. Imagem é realizada diariamente a partir 2 horas pós-operatório.

Anestesiar ratos com isoflurano (2,5 - 3%), utilizando uma câmara de indução.

1. Desinfectar a zona abdominal e torácica amplamente utilizando Iodo-Provo, use próxima de etanol 80%, repita este passo três vezes.
2. Injetar d-luciferina (Xenogen; 375 peso corporal mg / kg) ip
3. Lugar ratos anestesiados para a imagem IVIS câmara (até 4 ratos podem ser analisados ​​ao mesmo tempo).
4. Avaliar a intensidade do sinal luc + células dentro EHT em unidades de fótons / seg / cm ² / steridianin a região de interesse (ROI) no início do estudo (120 minutos após o implante) e nos dias 1, 2, 3, 5, 7, 10, e nas semanas 2, 3 e 4. Observe o sinal de pico (aparece cerca de 20 minutos após o d-Luciferina injecção).

Criar um gráfico (Excel), mostrando a intensidade do sinal ao longo do tempo.

4. Correlação de Resultados BLI e ELISPOT

O celular in vivo respostas imunes em imunocompetentes e imunodeficientes BN ratos nus foram estudados após EHT transplante. O baço dos animais receptores foi colhida 5 dias após o transplante EHT para isolar esplenócitos destinatário. Ensaios de ELISPOT com mitomicina-inibida EHTs (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) como estimulador e 5 x10 ⁶ esplenócitos destinatário como células de resposta foram realizados de acordo com protocolo do fabricante (BD Biosciences) IFN-γ usando e IL-4 revestido placas para investigar TH1, TH2 e resposta, respectivamente. IFN-γ e IL-4 spots foram significativamente maiores no modelo, imunocompetentes em relação ao modelo imunodeficientes (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; Student t-test).

5. Resultados representativos:

Figura 1. Correlação de resultados BLI e ELISPOT a) O celular in vivo respostas imunes em imunocompetentes Brown Noruega e imunodeficientes ratos nus foram estudados após o implante EHT. Esplenócitos destinatário foram colhidas cinco dias após o implante EHT. IFN? e IL-4 expressão foi avaliada por ensaios ELISpot com mitomicina-inibida EHT como estimuladores e 5x106 esplenócitos destinatário como células responder. Th1 e Th2 foram significativamente maiores no modelo imunocompetentes em relação ao modelo imunodeficientes como evidenciado pelo IFNγ e IL-4, respectivamente. b) EHTs Luc + foram transplantadas para o omentus maior de ambos os ratos BN imunocompetentes ou imunodeficientes ratos nude. Sobrevivência celular foi seguido por longitudinalmente BLI. A taxa de animais que rejeitou a EHTs transplantado é apresentado. Todos os ratos BN rapidamente rejeitou a transplantes EHT, enquanto as células sobreviveram em ratos células T deficiente.

Discussion

Antes da implementação clínica da tecnologia EHT para reparação cardíaca, questões fundamentais, como a imunogenicidade de ambos os componentes celulares e da matriz ou sobrevida do enxerto após o implante devem ser avaliados em modelos experimentais. In-vivo de imagem de bioluminescência representa uma nova técnica útil para a sobrevivência da célula de acompanhamento após o transplante . Nós gerado com sucesso fibrina baseado EHT contendo luciferase positivo (luc +) células do coração pela adaptação de um protocolo estabelecido ^4. Estes EHT foram implantados no omento maior de ratas destinatário. Injeção intraperitoneal do substrato específico (d-Luciferina) gera sinais de que foram detectadas utilizando a plataforma bioimaging IVIS (Xenogen). Intensidade do sinal no início do estudo (120 minutos após o implante) medido em fótons / seg / cm ² / steridian serviu como um parâmetro substituto para o número de células no interior EHTs enxertados. Medições diárias permitidas para não-invasivo Ponderar longitudinal de sobrevida do enxerto. Em um modelo de rejeição, a diminuição da intensidade do sinal ao longo do tempo foi correlacionada com a intensidade ea cinética de rejeição aguda em ratos cepas diferentes.

Materials

LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753) Matrigel (BD Bioscience 356235) DMEM (Biochrome F0415) Horse serum (Gibco 26050) Penicillin/streptomycin (Gibco 15140) Insulin (Sigma-Aldrich I9278) Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) d-Luciferin (Biosynth L-8220) Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)