Биолюминесценция изображений для оценки иммунного ответа после вживления Engineered ткани сердца (EHT)

Summary

Это видео демонстрирует использование

Abstract

Различные методы сердечных тканевой инженерии были, проводимой в последние десятилетия, в том числе леса стратегии с использованием либо родным или bioartificial эшафот материалов, захвата кардиомиоцитов в гидрогели, такие как фибрин и коллаген и укладки монослоев миоцитов ^1. Эти концепции направлены на восстановление под угрозу сердечной функции (например, после инфаркта миокарда) или в качестве экспериментальных моделей (например, интеллектуального токсикологии и вещества экранирование или болезни моделирование). Точные данные мониторинга о выживаемости клеток после имплантации инженерии тканей сердца (EHT), а теперь возможно с использованием в естественных условиях биолюминесценции томография (BLI) методы ^2. Здесь мы описываем процессы генерации фибрин основе EHT от трансгенных линия крыс с повсеместным выражение люциферазы светляков (ROSA / люциферазы-LEW Tg, ^3). Имплантация проводится в большого сальника различных штаммов крыс для оценки иммунного ответа из организма-реципиента следующие EHT имплантации. Сравнение результатов, полученных BLI и фермента иммуноферментный Пятно Техника (ELISPOT) подтверждают удобство BLI для оценки иммунного ответа.

Protocol

1. EHT поколения и культуры Условия

Производство фибрина основе EHT осуществляли, как описано в другом месте ^4. Короче говоря, для генерации фибрин основе EHT для имплантации целей, мастер микс был подготовлен содержащих клетки, выделенные из новорожденных ROSA / люциферазы-LEW трансгенных крыс сердца, бычьего фибриногена и Матригель. Агарозном литейных форм были приготовлены с использованием тефлоновой прокладки помещены в 6-и блюда культуры. После застывания агарозы, прокладки были сняты, а стойки силиконовые сообщение были размещены на культуру блюда с сообщения идущие в пресс-форм. Для создания EHT, Mastermix был на короткое время смешивается с расчетного количества тромбина и пипеткой в ​​форму. После полимеризации фибриногена, силиконовые стойки с EHTs придерживаясь должности были аккуратно удалены из литья агарозном пресс-форм, передается новым 6-а блюда культуре клеток и поддерживается в 37 ° C, 7% CO _{2 в} культуре клеток инкубатор использованием заказных среду клеточной культуры.

EHT хранились в условиях культуры клеток, пока день десять. В течение этого промежутка времени, неонатальной клетки сердца крысы стали удлиненные, соединения и выровнять вдоль силовых линий между силиконовой сообщений. Во время имплантации, спонтанное когерентное сокращений не наблюдалось, отклоняя силиконовые сообщений.

2. EHT Имплантация

EHT имплантация была выполнена в любом иммунокомпетентных Браун Норвегия (BN) крыс, или иммунодефицитных крыс обнаженной для расследования аллогенного иммунного ответа. Б. Н. и обнаженные крыс весом 100 - 150 г были приобретены у реки Чарльз Германии (Sandhofer Weg 7, Д-97633 Sulzfeld) и размещаются в обычных условиях, кормили стандартной крыс кормом и водой объявление libidum. Иммунодефицитом, крыс размещены в стерильных постельные принадлежности, клетки, и стерилизовать вода. Немецкий комитет по этике рассмотрены и одобрены животных процедур. Все хирургические инструменты стерилизуются перед использованием.

Процедуры имплантации проводятся следующим образом:

Крысы являются anesthesized с изофлуран (2,5-3%) с помощью индукции камеры. Воздействие на человека, чтобы изофлуран может быть уменьшена за счет работы в таблице нисходящего потока или не рециркуляции капот. Температура тела сохраняется во время хирургической операции.

1. Бритье области живота и применять глазную мазь, чтобы предотвратить глаз от высыхания во время анестезии.
2. Место крысу на спину и положите маску на нос и рот, чтобы не отставать анестезии.
3. Лечить брюшной области с помощью Бетадин, а затем 80% этанола. Тампон из чистого к грязному, от центра бритой области перемещаются наружу в сторону волосами области.
4. Проверить рефлексы щипать задние ноги, чтобы быть уверенным, что крысы достаточно анестезии.
5. Пелерина животных и выполняют средней линии разреза брюшной полости разделения кожи и мышц в два этапа, чтобы открыть живот. Горячие стерилизации шарик используется между кожей и мышечной открытия.
6. Место в кишечнике нагревается солевой увлажненной неопудренные перчатки. Сложите перчатка вокруг кишечника, чтобы предотвратить потерю влаги.
7. Удаление жировой ткани и выставить селезенки.
8. Визуализация и распространение большого сальника щипцами.
9. Аккуратно вырежьте EHT от приостановления силиконовые сообщений и передачи на большого сальника.
10. Оберните больше omentus вокруг EHT и исправить с помощью двух единый 7-0 проленовой швов (Ethicon, Нордерштедт, Германия)
11. Следующий шаг назад кишечника в брюшную полость.
12. Флеш живота с нагретого стерильного физиологического раствора.
13. Закрыть мышечного слоя брюшной стенки использованием 6-0 проленовой работает швов (Ethicon, Нордерштедт, Германия).
14. Используйте 5-0 проленовой (Ethicon, Нордерштедт, Германия), работающих швы, чтобы закрыть кожи.
15. Хотя крысы все еще находится в анестезии, вводят 5 мг / кг Carprofen подкожно.
16. Для обеспечения достаточного обезболивания для этого типа процедуры, обезболивающее (например, Метамизол) добавляется к питьевой воде (50 мг Метамизол на 100 мл) в течение обезболивающее в течение 3 дней после трансплантации.

3. Биолюминесценция Визуализация EHT После имплантации

Платформа ИВИС bioimaging (Xenogen, Аламеда, штат Калифорния, США) используется для неинвазивной визуализации биолюминесценции в естественных условиях, а результаты анализировались с помощью изображения ИВИС мебель (Xenogen) пакета программного обеспечения. Изображений осуществляется ежедневно, начиная с 2 часов после операции.

Обезболить крысы с изофлуран (2,5 - 3%) с помощью индукции камеры.

1. Лечить брюшной и грудной области широко используя Прово-йод, следующего использования 80% этанола, повторите этот шаг в три раза.
2. Inject г-люциферин (Xenogen, 375 мг / кг массы тела) ф
3. Место анестезии крыс в ИВИС изображения камеры (до 4 крысы могут быть проанализированы в то же время).
4. Оценка интенсивности сигнала лUC + клеток внутри EHT в единицах фотонов / сек / см ² / steridianin области интереса (ROI) в начале исследования (120 минут после имплантации) и в дни 1, 2, 3, 5, 7, 10, и в то недели 2, 3 и 4. Заметим, пик сигнала (появляется около 20 минут после того, г-люциферин инъекции).

Создайте график (Excel), показывающий интенсивность сигнала с течением времени.

4. Корреляция результатов BLI и ELISPOT

Сотовых в естественных иммунных реакций в иммунокомпетентных БН и иммунодефицитных обнаженной крыс исследовали после EHT трансплантации. Селезенки получателя животных было собрано 5 дней после трансплантации EHT изолировать получателя спленоцитов. ELISpot анализов использованием митомицин-тормозится EHTs (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в качестве стимулятора и 5 х 10 ⁶ спленоцитов получатель как ответчик клетки были выполнены в соответствии с протоколом производителя (BD Biosciences) с использованием ИФН-γ и ИЛ-4 покрытием пластины для расследования TH1-и ТН2 ответ, соответственно. IFN-γ и ИЛ-4 пятна были значительно выше в иммунокомпетентных, модель по сравнению с иммунодефицитом моделью (IFN-γ: р = 0,001; IL-4: р = 0,023; Стьюдента-тест).

5. Представитель Результаты:

Рисунок 1. Корреляция результатов BLI и ELISPOT) сотовых в естественных иммунных реакций в иммунокомпетентных Браун Норвегии и иммунодефицитных обнаженной крыс исследовали после EHT имплантации. Получатель спленоцитов было собрано 5 дней после EHT имплантации. ИФН? и ИЛ-4 выражении оценивался ELISpot анализов использованием митомицин-тормозится EHT как стимуляторы и 5x106 спленоцитов получателю в виде ячеек ответчик. Th1 и Th2 реакции были значительно выше в иммунокомпетентных модель по сравнению с иммунодефицитом модель, о чем свидетельствует IFNγ и IL-4 производства соответственно. б) Люк + EHTs были пересажены в большей omentus либо иммунокомпетентных крыс БН или иммунодефицитных обнаженной крыс. Выживаемость клеток была продольно следуют BLI. Скорость животных, которым отказано в пересаженных EHTs представлена. Все БН крысы быстро отклонили EHT пересадки, тогда как клетки выжили в Т-клеток недостаточно крыс.

Discussion

Перед клинической реализации EHT технологии для сердечной ремонт, фундаментальные вопросы, такие как иммуногенность и клеточном и матрица компонентов или выживаемость трансплантата после имплантации должны быть оценены в экспериментальных моделях. В естественных условиях биолюминесценции визуализации представляет полезную новую технику для мониторинга выживания клеток после трансплантации . Мы успешно генерируются фибрина основе EHT содержащие люциферазы положительным (Luc +) клетки сердца по адаптации установленным протоколом ^4. Эти EHT были имплантированы в большого сальника получателя крыс. Внутрибрюшинного введения специфического субстрата (D-люциферин) генерирует сигналы, которые были обнаружены с помощью платформы ИВИС bioimaging (Xenogen). Интенсивность сигнала в начале исследования (120 минут после имплантации), измеряемый в фотон / сек / см ² / steridian служил в качестве суррогатного параметра количество клеток внутри привитых EHTs. Ежедневные измерения позволили неинвазивным продольной assessement трансплантата выживания. В отказе модель, снижение интенсивности сигнала в течение долгого времени было связано с интенсивностью и кинетики острого отторжения в различных штаммов крысы.

Materials

LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753) Matrigel (BD Bioscience 356235) DMEM (Biochrome F0415) Horse serum (Gibco 26050) Penicillin/streptomycin (Gibco 15140) Insulin (Sigma-Aldrich I9278) Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) d-Luciferin (Biosynth L-8220) Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)