Bioluminescence Imaging för bedömning av immunsvaret efter implantationen av Engineered hjärtvävnad (EHT)

Summary

Denna video demonstrerar användning av

Abstract

Olika teknikerna för hjärtvävnad engineering ha skett i de senaste decennierna, inklusive byggnadsställningar strategier med antingen inbyggda eller bioartificial schavotten material, fastnar hjärt myocyter i hydrogel som fibrin eller kollagen och stapling av myocyte monolager ^1. Dessa begrepp syftar till restaurering av nedsatt hjärtfunktion (t ex efter hjärtinfarkt) eller som experimentella modeller (t.ex. prediktiva toxikologi och substans screening eller sjukdom modellering). Noggrann kontroll av cellens överlevnad efter implantation av tekniska hjärtvävnad (EHT) har nu blivit möjligt med hjälp av in-vivo (BLI) mareld avbildningstekniker ^2. Här beskriver vi den generation av fibrin-baserade EHT från en transgen råtta stam med allestädes närvarande uttryck i Firefly luciferas (Rosa / luciferas-LEW Tg, ^3). Implantation sker i större omentum olika råtta stammar för att utvärdera immunsvaret hos mottagarorganismen följande EHT implantation. Jämförelse av resultaten som genereras av BLI och enzymet Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) bekräfta användbarheten av BLI för bedömning av immunsvaret.

Protocol

1. EHT Generation och odlingsbetingelser

Tillverkning av fibrin-baserade EHT utfördes som beskrivs på annan plats ^4. I korthet, att skapa fibrin-baserade EHT för implantation ändamål, var en mästare blandning beredda, innehållande celler som isolerats från neonatal ROSA / luciferas-LEW transgena hjärtan råtta, nötkreatur fibrinogen och Matrigel. Agarosen gjutformar har sammanställts med teflon distanser placeras i 6-bra kultur rätter. Efter solidifiering av agaros var distanser bort och silikon inlägg rack placerades på kultur rätter med inlägg når in i formar. För att generera EHT var mastermix kort blandas med en beräknad mängd trombin och pipetteras i formen. Efter polymerisering av fibrinogen, var silikon rack med EHTs fastnat på inlägg försiktigt bort från agaros gjutformar, överförs till nya 6-och cellodling rätter och hållas i 37 ° C, 7% CO ₂ cellodling inkubator med hjälp av skräddarsydda cellodlingsmedium.

EHT hölls under förhållanden cellodling till dag tio. Under denna tidsperiod började nyfödda råttor hjärtceller till långsträckta, koppla och justera längs kraft linjer i mellan silikon inlägg. Vid tiden för implantation, var spontana sammanhängande sammandragningar observerats, avleda silikon inlägg.

2. EHT Implantation

EHT implantation utfördes i antingen immunkompetenta Brun Norge (BN) råttor, eller nedsatt immunförsvar naken råttor för att undersöka allogen immunförsvaret. BN och naken råttor som väger 100 - 150 g köptes från Charles River Tyskland (Sandhofer Weg 7, D-97.633 Sulzfeld) och förvarade under vanliga förhållanden, matas standard råtta chow och vatten ad libidum. Nedsatt immunförsvar råttor är inrymt i sterila sängkläder, burar, och sterilt vatten används. Den tyska etiska granskningskommitté granskat och godkänt djuret förfaranden. Alla kirurgiska instrument är steriliserade före användningen.

Implantation proceduren utförs enligt följande:

Rat är anesthesized med isofluran (2,5-3%) med hjälp av en induktion kammare. Människors exponering för isofluran kan minskas genom att arbeta i en Utsugsbordet eller icke-cirkulerande huva. Kroppstemperaturen upprätthålls under det kirurgiska ingreppet.

1. Raka buken och applicera ögonsalva för att förhindra att ögonen från att torka under anestesi.
2. Placera råttan på rygg och lägg en ansiktsmask över dess näsa och mun för att hålla uppe anestesi.
3. Desinficera buken med hjälp av Betadine och sedan 80% etanol. Pinnen från rena till smutsiga, från mitten av rakade området flytta utåt mot hår-området.
4. Kontrollera reflexer nypa bakbenen vara säker på att råttan är tillräckligt sövd.
5. Drapera djuret och göra en mittlinje buksnitt separera hud och muskler i två steg för att öppna buken. Hot pärla sterilisering används mellan hud och muskler öppning.
6. Placera tarmarna i en varm saltlösning återfuktad puderfria handske. Vik handsken runt tarmarna att förhindra förlust av fukt.
7. Ta bort fettvävnad och exponera mjälten.
8. Visualisera och sprida större omentum med pincett.
9. Skär försiktigt EHT från att avbryta silikon inlägg och överföra på större omentum.
10. Linda större omentus runt EHT och fixa med hjälp av två enkla 7-0 prolene suturer (Ethicon, Norderstedt, Tyskland)
11. Nästa drag tarmen tillbaka in i buken.
12. Spola buken med uppvärmd steril koksaltlösning.
13. Stäng muskel lagret av bukväggen med 6-0 prolene kör suturer (Ethicon, Norderstedt, Tyskland).
14. Använd 5-0 prolene (Ethicon, Norderstedt, Tyskland) som kör suturer att stänga huden.
15. Medan råttan är fortfarande i narkos, injicera 5 mg / kg Karprofen subkutant.
16. Att ge tillräcklig analgesi för denna typ av förfarande, ett analgetikum (såsom Metamizol) läggs till dricksvatten (50 mg Metamizol per 100 ml) för smärtstillande i 3 dagar efter transplantation.

3. Bioluminescence Imaging av EHT efter implantationen

Den IVIS bioimaging plattform (Xenogen, Alameda, CA, USA) används för icke-invasiv mareld imaging in-vivo och resultat analyseras med hjälp av IVIS Living Image (Xenogen) programpaketet. Imaging utförs dagligen från 2 timmar postoperativt.

Bedöva råtta med isofluran (2,5 - 3%) med hjälp av en induktion kammare.

1. Desinficera buk och bröstkorg område får stor spridning via Provo-Jod, nästa använder 80% etanol, upprepa detta steg tre gånger.
2. Injicera d-luciferin (Xenogen, 375 mg / kg kroppsvikt) ip
3. Placera sövda råttor i IVIS imaging kammaren (upp till 4 råttor kan analyseras på samma gång).
4. Bedöm signalstyrka av luc + celler inuti EHT i enheter av fotoner / sek / cm ² / steridianin regionen av intresse (ROI) vid baseline (120 minuter efter implantation) och i dag 1, 2, 3, 5, 7, 10 och vid vecka 2, 3 och 4. Notera toppen signalen (visas runt 20 minuter efter d-luciferin injektion).

Skapa ett diagram (Excel) som visar signal intensiteten över tiden.

4. Korrelation mellan BLI Resultat och ELISPOT

Det cellulära in vivo immunsvar hos immunkompetenta BN och nedsatt immunförsvar nakna råttor har studerats efter EHT transplantation. Mjälten Mottagarens djur har skördats 5 dagar efter EHT transplantation för att isolera mottagare splenocytes. ELISPOT-analyser med hjälp av mitomycin-hämmade EHTs (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) som stimulatorn och 5 x10 ⁶ splenocytes mottagaren som responder celler utfördes enligt tillverkarens protokollet (BD Biosciences) med IFN-γ och IL-4 belagd plattor för att undersöka TH1-och TH2 svar, respektive. IFN-γ och IL-4 ställen var signifikant högre i immunkompetenta, modell jämfört med immundefekta modell (IFN-γ: p = 0,001, IL-4: p = 0,023; Students t-test).

5. Representativa resultat:

Figur 1. Korrelation mellan BLI resultat och ELISPOT en) var de cellulära in vivo immunsvar hos immunkompetenta Brown Norge och nedsatt immunförsvar naken råttor studerats efter EHT implantation. Mottagare splenocytes skördades 5 dagar efter EHT implantation. IFN? och IL-4 uttryck utvärderades av ELISPOT-analyser med mitomycin-hämmade EHT som stimulatorer och 5x106 splenocytes mottagaren som responder celler. Th1 och Th2 svaren var signifikant högre i immunkompetenta modellen jämfört med immundefekta modellen som framgår av IFNγ-och IL-4 produktionen respektive. b) Luc + EHTs har transplanterats in i större omentus av antingen immunkompetenta BN råttor eller nedsatt immunförsvar naken råttor. Cell överlevnad var längden följt av BLI. Andelen djur som avvisade transplanterade EHTs presenteras. Alla BN råttor förkastade snabbt EHT transplantationer, medan cellerna överlevde i T-cell bristfällig råttor.

Discussion

Innan kliniska genomförandet av EHT teknik för hjärt-reparation, grundläggande frågor såsom immunogenicitet av både cellulära och matrix komponenter eller graft överlevnad efter implantation måste bedömas i experimentella modeller. In vivo mareld imaging utgör en användbar ny teknik för övervakning cellöverlevnad efter transplantation . Vi lyckades genererade fibrin-baserade EHT innehåller luciferas positiva (Luc +) hjärtceller i en anpassning av ett fastställt protokoll ^4. Dessa EHT var implanteras i större omentum av mottagare råttor. Intraperitoneal injektion av de specifika substrat (d-luciferin) genererar signaler som detekteras med hjälp av IVIS bioimaging plattformen (Xenogen). Signalstyrka vid baseline (120 minuter efter implantation) mätt i fotoner / sek / cm ² / steridian fungerade som ett surrogat parameter för antalet celler inuti ympade EHTs. Dagliga mätningar tillåtet för icke-invasiv längsgående UTVÄRDERING av graft överlevnad. I ett avslag modell, var minskningen av signal intensitet över tiden korrelerad med intensitet och kinetik av akut avstötning i olika råtta stammar.

Materials

LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor-luc)11Jmsk rats (NBPR rat number 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) Bovine fibrinogen (stock solution: 200 mg/ml plus aprotinin 5 μg/ml fibrinogen in NaCl 0.9%, Sigma F4753) Matrigel (BD Bioscience 356235) DMEM (Biochrome F0415) Horse serum (Gibco 26050) Penicillin/streptomycin (Gibco 15140) Insulin (Sigma-Aldrich I9278) Aprotinin (Sigma Aldrich A1153) d-Luciferin (Biosynth L-8220) Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assay plates (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99)