Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Vurdering af gravende, Nest Construction, og hamstring i Mus

doi: 10.3791/2607 Published: January 5, 2012

Summary

Gravende, rugende og hamstring er arter-typiske aktiviteter, mus let at udføre i laboratoriet. Denne artikel beskriver, hvordan de kan nemt og billigt vurderes. Disse protokoller er ekstremt følsomme over for musestamme, hjerne læsioner og sygdomme. Desuden udgør de "miljøberigelse" for mus, og legemliggør det "forfining" aspekt af "3 R'er" 18.

Abstract

Forringelse i evnen til at udføre "dagligdags aktiviteter" (ADL) er et tidligt tegn på Alzheimers sygdom (AD). Prækliniske adfærdsmæssige screening af mulige behandlinger for AD for øjeblikket stort set fokuserer på kognitive test, som ofte kræver dyrt udstyr og masser af eksperimentator tid. Men menneskelige episodisk hukommelse (de hårdest ramte aspekt af hukommelse i AD) er forskellig for gnaver hukommelse, der synes at være stort set ikke-episodisk. Derfor er de nuværende metoder til at screene for nye AD behandlinger for AD hos gnavere er i sagens natur usandsynligt, at lykkes. En ny tilgang til prækliniske screening ville være at karakterisere ADL af mus. Heldigvis har flere sådanne analyser for nylig blevet udviklet på Oxford, og her er de tre mest følsomme og velkarakteriseret præsenteres.

Gravende blev først udviklet i Oxford 13. Det udviklede sig fra et behov for at udvikle en mus hamstring paradigme. De fleste offentliggøreed gnaver hamstring paradigmer kræves en fjern fødekilde for at være knyttet til hjemmet bur med en tilslutning passage. Dette ville indebære en ændring i hjemmet bur samt at gøre en mus-bevis forbinder passagen og fødekilde. Så det blev overvejet, hvorvidt det ville være muligt at sætte fødekilde inde i buret. Det blev konstateret, at hvis en container blev placeret på gulvet, det var tømt af den næste morgen. Blev Maden piller, men blot deponeres i en bunke på beholderen indgangen, i stedet placeres i et diskret sted væk fra beholderen, som man kunne forvente, hvis mus var virkelig hamstring dem. Luk inspektion viste, at mus var at udføre grave ("gravende") bevægelser, som ikke bærer de piller i munden til et udvalgt sted som de ville, hvis virkelig hamstring dem. 6

Mad piller er ikke en væsentlig substrat for gravende; mus vil tømme rør fyldt med sand, grus, selv snavset sengetøj fra deres eget bur. Mereoverstået, vil de tømme en hel slange, selvom en tom ene er placeret ved siden af den 8.

Flere indlejrer protokoller findes i litteraturen. Den nuværende Oxford en forenkling af proceduren og har en veldefineret pointsystem for reden kvalitet 5.

En hamstring paradigme blev senere udviklet i hvilken de mus, snarere end hamstring tilbage til den virkelige hjem bur, blev tilpasset til at leve i "hjemmebase" af en hamstring apparat. Denne base var forbundet til et rør lavet af trådnet, den distale ende af som indeholdt fødekilde. Dette arrangement viste sig at give gode hamstre, så længe mus blev tilpasset til at leve i "hjemmebase" i løbet af dagen og kun lov til at komme ind på hamstring røret om natten.

Protocol

1. Gravende

1. Apparatur

Forskellige container design blev forsøgt (for eksempel en metal kande, der kunne være lette at rengøre, men mus var tilbageholdende med at indtaste det). Til sidst blev det opdaget, at en længde af plast nedløbsrør (som er tilsluttet tagrender på huse) forhøjet en anelse i den ene ende for at forhindre uheld (ikke-bevidst) fortrængning af fødevarer pellets og forseglet i den anden ende, var et effektivt stykke apparatur. Burrows er nu lavet af plastik nedløbsrør, 68 mm diameter, skåret i 20 cm lange længder (Figur 1). Den ene ende er lukket med en prop af 12 mm halvhårde fiberplader (MDF). (Åndedrætsværn anbefales, når du arbejder med MDF). Til rengøring og imprægnering, kan en vandtæt lim mastiks sammensatte anvendes til indvendige og udvendige overflader af MDF samt tjener til at lime det i gravende røret. Maskin skruer (5 cm lang) bruges til at ophøje den anden ende of røret 3 cm fra gulvet. To huller er boret 1 cm fra den åbne ende af gravende røret i en vinkel på 90 ° indsættes, og det skruer og strammet 4.

Diameteren af Burrows er sandsynligvis kritisk; Schmid-Holmes et al 19 observeret, at mus i naturen "hule renset" hovedsageligt fra Burrows samme størrelse som vor kunstige dem..

Figur 1

Figur 1. En mus i et gravende rør.

2. Procedure

  1. Tilvænning
    Gravende er normalt spontane, men der er en vis indlæring element. Læringsprocessen er forstærkes af social lettelse. Derfor sted en hel hule natten i gruppen hjem bur af mus, som der senere skal testes med en behandling. Hver hule er fyldt med 200 g af den mad pellets normalt leveres som kost. (Dette refererer til than tæt komprimeret form for kost, hvis en "udvidet" kost er i brug den hule vil have mindre end 200 g). Eksperimentatorer bør tage hensyn til sådanne faktorer, når der vælges et gravende substrat.

    Hvis mus er på mad rationering (for eksempel, at motivere dem til at køre en samtidig labyrint learning opgave) non-food stoffer kan bruges, for eksempel ler bolde, som bruges til linje overfladen af ​​jorden i indendørs urtepotter; ært singels (små sten ~ 1 cm i diameter) og sand. Pea småsten og sand, som er tre gange tungere end mad pellets, er nyttige erstatninger for mad pellets, hvis mus er burrowing meget kraftigt, for at undgå et "loft effekt".
  2. Baselining
    Run (helst to) baseline gravende test 48 timer fra hinanden på samme måde, som vil ske til test efter den foreslåede behandling. Testen er optimalt startet omkring 4 PM hvis de mus er opstaldet på en 0700-1900 h mørke-lys cyklus. Det er et følsomt tidspunktat teste, da de ikke er normalt vågen på dette tidspunkt og gravende starter langsommere, end hvis de var godt i den mørke fase og derfor meget aktive. To timer efter starten, er et "øjebliksbillede" måling tages hensyn til de borede vægt af mad, den hule er tømt i en tareret beholder og vejes og pellets erstattet i den hule, som er sat tilbage i buret. Hvis musen er i den hule, bare forsigtigt hælde det, og indholdet i vejningen beholder og erstatter musen i buret. Vægten borede på to timer er herefter beregnes ved fratrækning fra de oprindelige 200 g. Den sidste læsning er taget det næste morgen. Timing er ikke kritisk, da musene vil have gået tilbage til at sove (ofte i den hule) og er ikke længere aktivt gravende. Brug 2 timer målingen taget på det andet forsøg at danne grupper, afbalanceret for baseline performance. Som gravende stiger med praksis 17, også baselining hjælper mus for at nå ud til flere stabile asymptotic præstation der afslører behandlingseffekt bedre.
  3. Test
    Til test, er efter behandlinger musene får burrowing testen nøjagtig den samme som i den baselining scenen. Hvis gravende testen skal bruges kronisk, anbefales det, at mindst 48 h adskille prøver for at forhindre et fald i ydeevne som følge af overdreven udsættelse for proceduren.
  4. Bemærk
    Erstatter ikke de gravede maden på buret gulvet i den hule. Selv om musen har ikke gravede noget, skal du udføre Vejningsprocedure som du ville gøre, hvis gravende var sket; de forstyrrelser, der skyldes ved vejning tendens til at stimulere adfærd, og mus, som allerede gravede nogle af underlaget vil ofte begynde gravende med fornyet kraft, efter at vejning proces.

2. Forventede resultater

C57 ~ BL / 6 mus typisk grave sig ned omkring 70 g i de første to timer, og i nærheden af ​​200 gnatten. Hippocampus lesioned mus ofte graver mindre end 5 g 11 (Figur 2). Prionsygdom hæmmer gravende 1,2, som gør lipopolysaccharide administration 20. Gravende kan registrere prion (scrapie) sygdom på 10-12 uger efter injektion af syge hjerne homogenatet, mens kliniske tegn kun vises i 22 uger 13. (Figur 3). Gravende har vist sig at være følsomme over for belastning forskelle 15 og knock-out af kalium-ion-kanal subunits 10.

Figur 2

Figur 2. Vægt af fødevarer pellets (medianer og interkvartile intervaller) borede i to timer ved kontrol og hippocampus-lesioned mus. Sidstnævnte borede betydeligt mindre end kontrol (P = 0,0001).

Figur 3

Figur 3. Vægt afmad pellets (betyder) borede natten med kontrol og scrapie-inficerede mus. Gravende stigninger (med praksis) i begge grupper fra uge 7 til 10 efter injektion, men fra uge 12 burrowing nedgang i scrapie gruppen og forskellen mellem grupperne bliver statistisk signifikant (mere end to standardafvigelser fra middelværdien).

3. Diskussion

Vi har testet gravende i andre arter af gnavere - rotter, ørkenrotter, hamstere og egyptiske tornede mus 8. Alle men sidstnævnte kunne være tilskyndet til at grave sig ned betydelige mængder af terrestriske substrater, såsom grus eller sand, men gravende af mad piller var meget mindre, selv efter en omfattende erfaring med det terrestriske materialer. Årsagen til denne forskel fra mus er ikke kendt. Efter dette arbejde var gjort, blev det opdaget, at egyptiske spiny mus, ikke i virkeligheden gøre huler i naturen, og de kan besætte Burrows fra ørkenrotter, også overfladen af ​​deres naturlige haBitat er ofte hård rock. Sidste observation i Nairobi viste, at inden for slægten Acomys, Wilsons spiny mus (Acomys wilsoni) og Percival er spiny mus (Acomys percivali), der graver i naturen, også borede i laboratoriet.

4. Nesting

1. Apparatur

Denne test er udført i individuelle bure, de samme som anvendes til gravende er egnede. Normal sengetøj bør dække gulvet til en dybde på 0,5 cm. (Variation i dybden, og meget dybstrøelse, der kan påvirke reden konstruktion). Hvert bur er forsynet med en "Nestlet", en 5 cm kvadrat af presset Bomuldspladevat (Ancare).

2. Procedure

Mus er placeret enkeltvis i nesting bure cirka en time før de mørke fase, og resultaterne vurderes næste morgen. Som med gravende, og af samme grunde, er timing ikke kritisk.

3.Scoring

De reder er vurderet på en 5-trins-skalaen (figur 4-8), og mængden af untorn Nestlet er også vejede 5.

  1. Den Nestlet er stort set uberørt (> 90% intakt).
  2. Den Nestlet er delvist revet op (50-90% tilbage intakte).
  3. Den Nestlet er for det meste makuleres, men ofte er der ikke er nogen påviselig reden site: <50% af de Nestlet forbliver intakt, men <90% er inden for en fjerdedel af buret gulvareal, dvs bomuld ikke er samlet i en rede, men spredt rundt i buret . Bemærk: Materialet kan undertiden være i en bredt defineret rede område, men den kritiske definition er, at 50-90% er blevet makuleret.
  4. En identificerbar, men flad reden:> 90% af Nestlet er revet op, er det materiale, samlet i en rede i en fjerdedel af buret gulvarealet, men reden er flad, med mure højere end mus legemshøjde (kruset op på sin side) på mindre end 50% af sin omkreds.
  5. En (næsten) perfekte nest:> 90% af Nestlet er revet op, reden er et krater, med mure højere end musen legemshøjde på mere end 50% af sin omkreds.

Når kriterierne ikke er enige splitte forskellen. For eksempel en perfekt rede med en unshredded 0.7g stykke ville score 4.5.

Figur 4

Figur 4. Nest vurdering 1

Figur 5

Figur 5. Nest score 2

Figur 6

Figur 6. Nest score 3

Figur 7

Figur 7. Nest vurdering 4

Figur 8

Figur 8. Nest SCORE 5

4. Forventede resultater

Både hanner og hunner gøre reder, da deres formål er termoregulering samt at det er forbundet med reproduktion. For C57BL / 6 mus, er reden scorer for hanner og hunner i samme størrelsesorden, selv om vi ikke har gjort en kontrolleret sammenligning i et enkelt eksperiment. De fleste C57BL / 6 mus score 4-5 på reden byggeri, men når hippocampus er lesioned medianen score ville være omkring 1-2; en score på 3 er usandsynligt, at overskrides (figur 9). Nesting viste sig også at være følsomme over for prionsygdom omkring 10-12 uger 1,2,16.

Figur 9

Figur 9. Nest scores (medianer og interkvartile intervaller) for kontrol mus og mus med læsioner i ryg, bug og komplet hippocampus. Kun den fuldstændige lesioned mus viser, hæmning af nesting, så virkningen af ​​selektive ryg og VentRAl regioner synes sub-tærskel, men tilsætningsstof.

5. Hamstring

1. Apparatur

En serie af "hjem baser" er forbundet med rør lavet af trådnet, forseglet permanent på den distale ende hvor maden pellets er placeret, og midlertidigt ved den proksimale ende af et træ stik. Dette bruges til at forhindre musene kommer ind i rørene, før tilpasningen til hjemmebasen har occurred7.

Apparatet (figur 10) kan gøres på forskellige måder, så længe de grundlæggende principper overholdes. Vores består af en række på 8 trækasser, hver 30 x 13 x 15 cm med gennemsigtig plexiglas låg. Hver af dem er forsynet med en vandflaske, og har et hul i ryggen, hvori hamstring røret er push-monteret. Rør er lavet af sort plast, 10 cm lang, 40 mm i diameter, sluttet til et trådnet rør, 45 cm lang, 4 cm i diameter, til at danne en samlet længde på 50 cm. Redskabets består af 13 mm firkanter,og er en dobbelt rulle med de masker, mis-justeret for at gøre hullerne i masken mindre og forhindre mad pellets slippe igennem. Hvis 6 mm kvadratmasker er ledigt dette er et bedre materiale som en rulle ville være tilstrækkelig. Den distale ende af røret, hvor maden pellets er placeret, er lukket. Den proksimale ende er forseglet med en aftagelig træ stik.

Figur 10

Figur 10. Mus i hamstring rør

2. Procedure

  1. Typisk, hamstring er meget varierende første gang, og nogle mus kan ikke hamstre på alle. Hamstring, som under jorden forbedres med praksis. Derfor, hvor eksperimenterende design tillader det, er baselining sessioner bedst gives før en behandling administreres. Det er klart, det er ikke praktisk, hvis den uafhængige variabel er medfødt, som med en (ikke-betingede) mutant mus, eller når at teste forskellige musen stammer.
  2. En mus er sat ihver boks tidligt på dagen til at vænne til det. Boksen er forsynet med en pap-tunnel, der har været i The Real Group hjem bur mindst en nat, også en stor del af snavset sengetøj, så det føles som "hjem". Adgang til hamstring røret er forhindret indtil aften med en træ spuns. 100 g mad pellets (en blanding af små og store) er placeret i distale ende af hamstring røret (ved at hælde dem i den anden ende af røret holdes lodret). For at sikre at musen er mildt sulten før testen begynder, er hjemsted kassen ikke er forsynet med mad.
  3. Lige før starten på den mørke fase, skal du fjerne træ bung at lade musen adgang til hamstring røret. Den næste morgen (igen, timing er ikke kritisk) at indsamle og veje al den mad pellets, der er blevet hamstret i hjemmet basen boksen.

6. Forventede resultater

Brug af kvindelige C57BL / 6 mus, ville den mediane hamstret beløbet omkring50-70 g. Hippocampus læsioner stærkt undertrykke hoarding11, mens præfrontale cortex læsioner kun har en svag effekt 12 (figur 11).

Figur 11

Figur 11. Vægt af fødevarer pellets hamstret af kontrol og mediale præfrontale cortex-lesioned mus (medianer og interkvartile intervaller). Selv om medianerne stor forskel, den høje variabilitet i kontrolgruppen: resultatet er langt fra statistisk signifikant (p = 0,3).

Discussion

Disse tests er meget enkel at køre, men effekten størrelser er meget store, hvilket gør dem ekstremt følsomme over for behandlinger, stamme forskelle osv. De er i overensstemmelse med den "forfining" aspekt af Russell og Burch er 3 R'er "18. Faktisk gode resultater på tests som gravende synes at være tegn på god almen sundhedstilstand hos dyr. Derfor er dette kunne være en god test for vurdering af dyrevelfærd.

Vigtigheden af ​​miljøberigelse til laboratoriebrug gnavere er almindeligt anerkendt i disse dage. Levering af redemateriale er nu almindelig praksis i mange stalde, og det er nemt at gøre. Den begejstring, hvormed mus graver gør gravende en potentielt fremragende berigelse, men desværre en "self-ladning" grave sig ned, der ville være en praktisk måde at give dette er endnu ikke blevet udviklet. Uanset om mus finde hamstring berigende er endnu ikke fastlagt.

_content "> En ulempe er, at de data, der genereres af disse test er generelt ikke-parametrisk (ikke Gaussian ved distribution), er så passende ikke-parametrisk statistik er nødvendig for at analysere dem, f.eks Mann-Whitney U test for parvise sammenligninger, Kruskal- Wallis ANOVA til multi-gruppe data. Hvis gentagne målinger designs er brugt, da der ikke er egnet ANOVA-test for ikke-parametriske data, kan resultaterne blive transformeret, fx ved kvadratroden eller log procedurer for at få dem til at svare til en mere normal fordeling .

Målingerne af apparatet kan være lidt anderledes end dem, der er angivet i teksten (nyttigt for USA eksperimentatorer), men store forskelle bør undgås. Men i nogle tilfælde andre eksperimentatorer kan finde forskellige konstruktioner virker bedre end dem der er beskrevet her.

Som for alle adfærdsmæssige målinger, bør de mus blive testet for at se, om deres aktivitetsniveau er normale, vil som inaktivitet naturligvis have en detrimental effekt på arter-typiske adfærd. Når scrapie-inficerede mus viste nedsat gravende og nesting, deres aktivitetsniveau var normale (testet på en åben mark apparat). Faktisk en periode med hyperaktivitet opstår omkring 2-4 uger efter disse arter-typiske adfærd er først svækket 2.

Den kraftige svækkelse produceret af hippocampus læsioner på gravende, rugende og hamstring, som alle er arter-typiske adfærd, supplerer nedskrivninger i den fysiske læring og memory9, der er så veletablerede virkninger af disse læsioner. De synes at svare til nedskrivninger i de daglige gøremål så karakteristisk for AD 14.

Disse arter-typiske test kan meget vel vise sig at være til stor nytte i prækliniske screening for behandling af Alzheimers og andre neurodegenerative sygdomme 14. I mange menneskelige hjernesygdomme et tab eller nedsat evne til at udføre normale Evehverdagens opgaver er lige så vigtig som andre funktioner af sygdom som kognitiv svækkelse. Især kan dette tab nødvendiggøre inddragelse af pårørende og de store samfundsøkonomiske byrde, så ofte medfører.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

The Wellcome Trust for at åbne adgang finansiering til Oxford University. Robert Deacon er medlem af Oxford OXION gruppe, finansieret af Wellcome Trust tilskud WT084655MA.

References

  1. Cunningham, C., Deacon, R. M. J., Chan, K., Boche, D., Rawlins, J. N. P., Perry, V. H. Neuropathologically distinct prion strains give rise to similar temporal profiles ofbehavioural deficits. Neurobiol. Dis. 18, 258-269 (2005).
  2. Cunningham, C., Deacon, R., Wells, H., Boche, D., Waters, S., Picanco Diniz, C., Scott, H., Rawlins, J. N. P., Perry, V. H. Synaptic changes characterize early behavioural signs in the ME7 model of murine prion disease. Eur. J. Neurosci. 17, 2147-2215 (2003).
  3. Damiani, R., Modesto, S., Yates, A., Neveling, J. Earliest evidence of cynodont burrowing. Proc. R. Soc. Lond. B. 270, 1747-1751 (2003).
  4. Deacon, R. M. J. Burrowing in rodents: a sensitive method for detecting behavioral dysfunction. Nat. Protocols. 1, 118-121 (2006).
  5. Deacon, R. M. J. Assessing nest building in mice. Nat. Protocols. 1, 1117-1119 (2006).
  6. Deacon, R. M. J. Digging in Mice: Marble Burying, Burrowing, and Direct Observation Reveal Changes in Mouse Behavior. Mood and anxiety related phenotypes in mice. Gould, T. D. Humana Press. New York. (2009).
  7. Deacon, R. M. J. Assessing hoarding in mice. Nat. Protocols. 1, 2828-2830 (2006).
  8. Deacon, R. M. J. Burrowing: A sensitive behavioural assay, tested in five species of laboratory rodents. Behav. Brain. Res. 200, 128-133 (2009).
  9. Deacon, R. M. J., Bannerman, D. M., Kirby, B. P., Croucher, A., Rawlins, J. N. P. Effects of cytotoxic hippocampal lesions in mice on a cognitive test battery. Behav. Brain. Res. 133, 57-68 (2002).
  10. Deacon, R. M. J., Brook, R. C., Meyer, D., Haeckel, O., Ashcroft, F. M., Miki, T., Seino, S., Liss, B. Behavioral phenotyping of mice lacking the KATP channel subunit Kir6.2. Physiol. Behav. 87, 723-733 (2006).
  11. Deacon, R. M. J., Croucher, A., Rawlins, J. N. P. Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviors in mice. Behav. Brain. Res. 132, 203-213 (2002).
  12. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behav. Brain. Res. 139, 139-155 (2003).
  13. Deacon, R. M. J., Raley, J. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. P. Burrowing into prion disease. Neuroreport. 12, 2053-2057 (2001).
  14. Deacon, R. M. J., Rawlins, J. N. P. Hippocampal lesions, species-typical behaviours and anxiety in mice. Behav. Brain. Res. 156, 241-249 (2005).
  15. Deacon, R. M. J., Thomas, C. L., Rawlins, J. N. P., Morley, B. J. A comparison of the behavior of C57BL/6 and C57BL/10. Behav. Brain. Res. 179, 239-247 (2007).
  16. Guenther, K., Deacon, R. M. J., Perry, V. H., Rawlins, J. N. P. Early behavioural changes in scrapie-affected mice and the influence of dapsone. Eur. J. Neurosci. 14, 401-409 (2001).
  17. Mallucci, G. R., White, F. armer, Dickinson, M., Khatun, A., Powell, H., Brandner, A. D., Jefferys, S., R, J. G., Collinge, J. Targeting Cellular Prion Protein Reverses Early Cognitive Deficits and Neurophysiological Dysfunction in Prion-Infected Mice. Neuron. 53, 325-335 (2007).
  18. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Methuen, London. (1959).
  19. Schmid-Holmes, S., Drickamer, L. C., Robinson, A. S., Gillie, L. L. Burrows and burrow cleaning behaviour of house mice. Am. Mid. Nat. 146, 53-62 (2001).
  20. Teeling, J. L., Felton, L. M., Deacon, R. M. J., Cunningham, C., Rawlins, J. N. P., Perry, V. H. Sub-pyrogenic systemic inflammation impacts on brain and behavior, independent of cytokines. Brain Behav. Immun. 21, 836-850 (2007).
Vurdering af gravende, Nest Construction, og hamstring i Mus
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Deacon, R. Assessing Burrowing, Nest Construction, and Hoarding in Mice. J. Vis. Exp. (59), e2607, doi:10.3791/2607 (2012).More

Deacon, R. Assessing Burrowing, Nest Construction, and Hoarding in Mice. J. Vis. Exp. (59), e2607, doi:10.3791/2607 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter