Grunt vann (Padling) Varianter av Water Maze Tester i Mus

Summary

Mus

Abstract

Når Richard Morris utviklet hans vann labyrint i 1981 ^7, ble de atferdsmessige arbeid utført hos rotter. Førte imidlertid større forståelse av mus genetikk til musen blir stadig viktigere. Men forskere funnet at noen stammer av mutante mus ble utsatt for problemer som passivt flytende eller dykking når de ble testet i den Morris vann labyrint ^11.. Dette var overraskende vurderer deres naturlige habitat, rotter svømme naturlig (klassisk, den "kloakk rotte"), mens musene utviklet seg i de tørre områdene i det sentrale Asia.

For å overvinne disse problemene, ble det vurdert om grunt vann ville være et tilstrekkelig stimulans til å gi flukt motivasjon for mus. Dette vil også unngå problemene med tørking av de små dyr med et håndkle og deretter sette dem i et oppvarmet kammer for å unngå utvinning hypotermi, som er et mye mer alvorlig problem enn ved rotter; det store forhold mellom overflate og volum for en mus gjør det particularly utsatt for rask varmetap.

En annen vurdering ble om en mer naturlig flukt strategi kunne brukes, for å lette læring. Siden dyr som faller i vannet og svømme bort fra sikkerheten til kysten er usannsynlig å passere på sine gener, har dyrene utviklet en naturlig tendens til å svømme til kanten av en vannmasse. Morris-labyrint vann, krever imidlertid dem til å svømme til en skjult plattform mot midten av labyrinten - akkurat motsatt av deres oppførsel utviklet seg. Derfor padling labyrinten bør innarbeide flykte til kanten av apparatet. Denne funksjonen, kombinert med bruk av relativt ikke-aversive grunt vann, legemliggjør "Refinement" aspekt av de "tre Rs" av Russell og Burch ^åtte.

Forskjellige typer av labyrint utforming ble forsøkt, og den felles trekk var at vannet var alltid grunne (2 cm dyp) og var rømme via en slange gjennomhulling av gjennomsiktig vegg av anordningen. Andre rør ("false exits ") ble også plassert rundt veggene, men disse ble blokkert av. Fra innsiden av labyrinten alle falske utganger og det eneste sanne utgang sett det samme. tiden et dodecagonal (12 dupleks) labyrint er i bruk i Oxford, med 12 true / false utganger satt i hjørnene. I en ny utvikling en gjennomsiktig padling Y-labyrint har blitt testet med hell.

Introduction

Morris og Barnes Labyrinter

Siden begynnelsen av eksperimentell psykologi, har studier av dyr læring støttet seg tungt på labyrinter, vanligvis laget av ugjennomsiktig tre eller metall. Uunngåelig, på grunn av de ekstraordinære olfactory evnene til gnagere, ble mange studier bruker dem kompromittert til en viss grad, når experimenter trodde at han / hun hadde lyktes i å undervise et dyr en visuell eller stilling diskriminering, rotte eller mus hadde faktisk vært hovedsakelig bruker luktesans for å løse problemet. Dette er illustrert av striden om rotter med lesjoner i hippocampus kan utføre romlige referanse minnet oppgaver, diskutert i detalj i 2002 ^4. Hovedsak, David Olton og kolleger, bortsett fra i tidlige arbeidet med radial labyrint, ikke synes å ha alltid systematisk rotert sine labyrinter. Dette førte til hippocampus lesioned dyr løse oppgaven, antagelig av lukt signaler som gjorde eACH arm særpreget. Ved Oxford, ble en (naturligvis) blind mus gang observert på en seks-arm radial labyrint. Det igjen sin start arm og slått rett. Da er det krysset sentrum og valgte motsatt arm. Etterpå falt i en stereotyp strategi om alltid å svinge mot høyre, men når det re-støtt i bunnen av den første armen det var kommet inn, tok det en kortvarig snuse på det (~ 0,2 sek) og deretter avvist det, og flyttet til neste arm. Hvis olfactory informasjon om et enkelt besøk kan bli husket, er det klart at testing i løpet gjentatte forsøk på et statisk labyrint med samme arm alltid agnet ville føre til sterke olfactory assosiasjoner til belønning, og læring vil lett oppstå selv om lesjon forhindret ethvert rent romfølelse.

Problemer som disse var stimulans for Morris til å utvikle sitt vann labyrint ^7, vann ville ikke gi konstant lokaliserte olfactory signaler.

Plaskebassenget er egentlig en hybrid mellom tradinale vann labyrint designet av Morris ⁷ og tørr Barnes ^en labyrint. I Morris vannet labyrint, dyret svømmer på dypt vann, flykte fra noe som er til grunt vann som dekker en litt nedsenket plattform ligger mot labyrinten sentrum. I Barnes labyrint, blir dyret plassert på en (tørr) sirkulær plattform med utgangshull rundt periferien, bare en av dem gir flukt til en boks som står under.

Bruken av padling som en flukt motivator oppsto fra problemer rapportert når uforholdsmessig antall av enkelte stammer av transgene mus klarte å svømme skikkelig i Morris labyrint. De enten dykket eller passivt fløt ^11. Siden dette kan representere en stressrelatert respons, ble det begrunnet at å redusere vann til padling dybde kan være nok til å løse dette problemet, som faktisk det gjorde. Det ble også bestemt for å tillate utslipp til et tørt rør som ligger i den side av anordningen, i stedet for grunt vann som dekker en plattform. Detteville være en mer "naturlig" escape response, og øke den romlige komponenten av prøven, siden mye av den første læring i Morris labyrint er fremgangsmåter; dyrene må først overvinne deres iboende tendens til å svømme langs veggene av labyrinten før romfølelse kan begynne.

Barnes labyrint også kan lide av dyr som ikke er tilstrekkelig motivert til å unnslippe den runde plattformen ^10,11.

Protocol

En. The Oxford plaskebasseng

Plaskebassenget er gjort i henhold til tre påfølgende design, Mk 1-3. Alle ansette grunt (2 cm) vann som finnes i en hvit (å styrke sin aversiveness) base, som er omgitt av transparente vegger laget av pleksiglass eller akryl plast. Disse har true / false utganger satt i dem. De falske utganger er tilstoppet av svarte malte tre plugger, mens den sanne exit er åpen og knyttet til en svart plastrør som kan fjernes med musen inne. Musen er så raskt og atraumatically returnert til sitt hjem buret mens inne i røret. Etter den første utgivelsen av plaskebasseng, ble det rapportert at retur til hjemmet buret var også en effektiv motivator for å lære Lashley III labyrint ^2.

En vanntemperatur på 20-25 ° C brukes. 20-21 ° C er ideelt, det har blitt bemerket at noen mus synes mindre motivert ved høyere temperaturer.

innhold "> Den første labyrint ⁵ var sirkulær. Men noen ganger mus (spesielt de med lesjoner til hippocampus) synes ikke å legge merke til den åpne exit tube. Et åttekantet design, med exit rør plassert i hjørnene, slik som å tiltrekke seg oppmerksomhet av musene, i stor grad bedres dette problemet. Men ville feilraten på sjansen ytelsen være 4/trial, i motsetning til 6/trial med 12-tube sirkulær design. Derfor et dodecagonal bassenget brukes nå med 11 falske og en sanne exit satt i vinkler laget av veikryssene veggene.

1.1. Evolusjon og egenskaper ved de plaskebasseng

Mk 1: et sirkulært basseng 85 cm i diameter med 12 true / false utganger (figur 1).

Mk 2: en åttekantet basseng 86 cm i diameter med 8 true / false utganger satt i hjørnene.

Mk 3: en dodecagonal (12 sided) pool 120 cm i diameter med 12 true / false exit satt i korneters (figur 4).

I alle de ovennevnte (og padling Y-labyrint, se nedenfor) avkjøringen rør var 40 mm diameter. Imidlertid ble det tidvis følt at musene var motvillige til å gå inn disse, og kontroll ytelse i Y-labyrinten vil noen ganger dukkert etter at de hadde vært å svare godt. Derfor, og med tanke på hvor lett de kom inn i gravende apparat (se JOVE publikasjonen "Vurdere gravende, reir konstruksjon og hamstring i mus"), også at exit hull i Barnes labyrinten er 50 mm diameter, ble det vurdert om 40 mm var for liten. En test ble utført i hjemmet bur av seks C57BL / 6 mus. (De virker mer klar for å gå inn 40 mm rør i hjemmet buret som antagelig stress er lavere her enn i et stykke apparat, så gjør testen i hjemmet buret ville minimere forskjellene i posten hvis de mindre rørene var litt motvilje, noe som gjør teste mer konservativ). To 40 mm rør og to 50 mm rør ble plassert på gulvet i enalternerende mønster. Som spådd, var det flere oppføringer i 50 mm rør (28 oppføringer) enn 40 mm (9 oppføringer). Derfor pilot tester er planlagt på en ny Y-labyrint med 50 mm exit rør, hvis dette lykkes de gamle 40 mm rør på dodecagonal basseng og padling Y-labyrinten vil bli erstattet med nye 50 mm seg.

Som plaskebasseng, padling Y-labyrint og romlig nyhet Y-labyrint er alle romlige tester, avhengig av rommet signaler som musen ser gjennom de gjennomsiktige veggene i apparatet, bør rommet være godt utstyrt med karakteristiske signaler (f.eks hyller, skap, svart plast figurer på veggene).

2. Kjører plaskebassenget

1. Plasser en mus i midten av bassenget vendt mot en av fire stillinger på omkretsen (9, 12 eller tre hvis flukten røret er på 6:00). Plassering er semi-tilfeldig, maksimalt tre påfølgende forsøk kan være i samme retning. Dette kan være vanskelig å oppnå i praksis, fordi somlæring forløper musene har en tendens til å orientere seg mot riktig utgang som de er senket ned i bassenget ved halen. Hvis de gjør dette på det sterkeste noe forsøk bør gjøres for å tvinge dem inn i den planlagte posisjon, siden de er rett og slett demonstrere læring.
2. Slipp dem når de er like over vannet, som da de slippe inn og umiddelbart vite at de ikke lenger blir holdt. Langsomt slippe dem resulterer i dem sliter med å frigjøre seg og dette kan svekke innledende orientering. Dette gjelder også for padling Y-labyrint.
3. Maksimal rettssaken lengde er 60 sek. Hvis musen ikke klarer å rømme da, manuelt lede det til avkjørselen ved hjelp av et par klare pleksiglass padleårer, som hver måler ca 30 x 20 cm. De iverksatte tiltakene er det på tide å finne utgangen (definisjon: hele hodet inne i røret) og feil. Feil ble definert som kommer innenfor en hodets lengde fra et rør (inkludert den virkelige exit). Passerer like ved den virkelige exit, uten oppføring, oppstår vanligvis infrequently etter de første forsøkene. Selv om en sak kan gjøres at dette er et problem, er et alternativt syn at mus svekket i romlig erkjennelse gjør dette fordi de ikke vet at det er en utgang rundt der. Controls vet, og derfor undersøke mer fullstendig. En himling av 11 feil / rettssaken er pålagt antall feil i analysen, for å hindre for mye skjevhet i dataene. Dette ville redusere mot et underskudd blir funnet i romlig svekket mus, det vil si det er et konservativt mål. Mus som ikke klarer å nå avslutte innen 60 sekunder er tildelt en score på 11 feil for at rettssaken. Så 60 sek ganger alltid ha 11 feil.

3. Den Padling Y-labyrint

For å forenkle plaskebasseng prosedyre og apparatet ble det besluttet å eksperimentere med en Y-labyrint, som drives etter de samme prinsipper som plaskebasseng. Anordningen består av tre armer laget av gjennomsiktig polystyren eller pleksiglass, hvert 30x 8 x 20 cm. Dette er montert på en hvit base (figur 7). Hvit ble valgt til å maksimere aversiveness av gulvet farge og så oppmuntre flukt fra den grunne (2 cm dyp). Som i vannet labyrint, er det bare en sann utgang, med de andre to armene ender i falske utganger som ser like ut fra innsiden av labyrinten (figur 8).

Kjøre padling Y-labyrint

Plasser en mus ved enden av en av de lukkede armene, som vender bort fra midten. Sekvensen av armene velges som startposisjon er definert av en semi-tilfeldig sekvens, ikke mer enn tre påfølgende forsøk med den samme stilling, og likt antall av venstre eller høyre armer. Hver rettssaken varer 60 sek. Hvis musen ikke klarer å avslutte (hele hodet i exit tube) innen denne tiden oppmuntre den til å gå inn i armen ved hjelp av et stykke gjennomsiktig pleksiglass. Avkjørselen arm basen blir blokkert av pleksiglass og musen lov til finner exit av seg selv, og dettebør oppmuntre til bedre læring enn når den skyves rett inn i røret. Men dette kan være nødvendig å ty til hvis musen er motvillig til å gå inn i røret etter 15 sek. Iverksette tiltak av den totale tiden for å gå ut og antall feil (hele kroppen unntatt halen går inn i en blind arm).

Scoring padling Y-labyrint

Det er to definisjoner av en riktig studie: For det første en der musen finner exit i <60 sek og gjør ingen oppføringer i blinde armene, med feil som blir scoret på om blind armene føres og / eller om avkjøringen ikke blir funnet innen 60 sek. Denne analysen forundrer feil å begynne å bevege seg med feil i arm oppføringer. Dernest kan en rettssak analyse som vektlegger kognitiv evne utføres ved å ekskludere, for hver mus, alle studier der musen ikke forlate start arm innen 60 sekunder, (dvs. slette alle 0 60 poeng) deretter beregne% korrekt av gjenværende forsøk.

4. To typer Y-labyrintKombinert

En. Apparatus

Når du bygger en padling Y-labyrinten, er det nyttig å innlemme to dører for å kunne kjøres som en (tørr) romlig nyhet minne eksperiment ⁶ (Figur 13). Et gjennomsiktig giljotin dør dekker utgangshullet i endeveggen av exit arm, mens en ugjennomsiktig giljotin døren kan settes inn for å tette av en arm fra de to andre under samplingsfasen av testen. Det er viktig at løperne for disse dørene ikke er innenfor rekkevidde av musene, som ellers kan avlede sin oppmerksomhet fordi de ser potensielle rømningsveier. Ideelt sett bør de forlenge 7 cm ned fra toppen av labyrinten veggen.

2. Set-up

Plasser en tynn (0,5 cm) sjikt av treflis strømaterialer på gulvet av den Y-labyrint. Dette fordeles mellom de to faser test for individuelle mus, og mellom mus. For beste praksis, for å gjøre olfactory miljø more lik for de første versus etterfølgende mus, plasserer en eller to ikke-eksperimentelle mus i labyrinten i noen minutter før forsøket starter.

3. Prosedyre

Med exit arm blokkert av ved ugjennomsiktig døren og dens exit hull blokkert av gjennomsiktig dør, plasserer musen i starten arm (en av de to ikke-exit armer av labyrinten) og la den utforske for 5 min. Deretter fjerne den, heve ugjennomsiktig døren for å gi tilgang til alle tre armer, erstatte den i starten arm og observere det i 2 min. Noter antall oppføringer og tid brukt i hver arm. Kontroll mus bør huske at de første to armer, og bruke mer tid i tidligere utilgjengelige arm.

Representative Results

Hippocampus lesjoner i stor grad svekker læring i plaskebassenget ^fem. Ved hjelp av en padling Y-labyrint, har en alder-avhengige underskuddet blitt vist i 10 og 14, men ikke tre måneder gamle Tg2576 mus (en modell av amyloid over-uttrykk). Alderen (21 mnd) kontroll mus også gjorde det dårlig ^tre. En romlig nyhet minne eksperiment kjøres i tørr Y-labyrint avdekket svakheter i mus med knockout av glutamat reseptor-A (Glur-A) AMPA reseptoren subenheter ^ni.

Figur 1. En mus i den sirkulære Mk 1 plaskebasseng.

Figur 2. Musen finner exit tube av plaskebassenget.

Figur 3 "src =" / files/ftp_upload/2608/2608fig3.jpg "/>
Figur 3. Musen rømmer inn i exit røret. Røret blir deretter løsnet fra labyrinten og musen tilbake til sin hjemme buret.

Figur 4. En mus i dodecagonal plaskebasseng.

Figur 5. En mus i ferd med å begå en feil som det nærmer seg en falsk exit.

Figur 6. En feil er begått som musens nesen kommer innenfor et hode avstand av en falsk exit. Den virkelige exit er til sin rett, med exit slange festet.

Figur 7. Et padling Y-labyrint.

Figur 8. Detalj av exit arm enden av Y-labyrint. Et grunt U-formet renne ligger inntil utgangshullet i endeveggen. Dette støtter exit tube, vist under støtten i bildet ovenfor. Utgangsfrekvensen røret kan fjernes fra støtten for å ta musen er tilbake i buret. Alle armer er utstyrt med dette oppsettet, men bare en arm endevegg forsynt med et sirkulært hull skåret inn i den for å tillate utslipp.

Figur 9. En mus i en blindvei i padling Y-labyrint.

Figur 10. Musen finner avkjøringen tube.

Figur 11. En mus, etter å ha rømt fra padling Y-labyrint, venter på å bli returnert til sitt hjem buret.

Figur 12. Mus kan generelt være grunnlag for å holde i røret mens de føres tilbake til sine nærliggende hjem buret.

Figur 13. Kombinere en padling Y-labyrint med en romlig nyhet Y-labyrint konfigurasjon. An ugjennomsiktig giljotin døren er innsatt i et lysbilde ved den proksimale enden av en arm, og et gjennomsiktig giljotindørpakninger utenfor exit hullet.

Discussion

Som konklusjon synes padling et generelt effektiv motivator for mus, og unngår stress forbundet med dypt vann svømming. I motsetning til banelengde og escape gang tiltak i Morris vannet labyrint, feilraten i plaskebassenget for hippocampus lesioned mus holdt seg konstant gjennom hele opplæringsperioden ^5, så dette representerer et rent mål på romlig minne, i motsetning til å flykte tid eller bane lengde, som begge reduksjon som musene seg kjent med de ikke-romlige elementer av oppgaven. The feil tiltaket gir også et større omfang av forskjell mellom svekket (f.eks hippocampus lesioned) mus og kontroller.

I den opprinnelige publikasjonen, ble probe tester utført for å sjekke om musene ble virkelig bruke romlig ^fem. I Probe 1, var labyrinten roteres 120 °, men den geografiske plasseringen av flukten tube forble den samme som på trening. Ytelsen tilnærmet uendret. I Probe 2, lik standard utryddelse test i Morris labyrint, ble exit tube blokkert. Tiden brukt i opplæringen kvadrant av labyrinten, hvor exit røret lå tidligere, var 50% for kontroll mus, 25% for mus med hippocampus lesjoner. I en tredje probe test hvorved posisjonen til utkjørselen røret ble endret, kontrollene igjen brukt mer tid i den opprinnelige trening kvadrant. Disse probe tester bekreftet at musene ikke brukte intramaze pekepinner, men ble styrt av de forskjellige tonene i laboratoriet eksterne til labyrinten. Denne mangelen på påvirkning av intramaze signaler setter plaskebasseng på en fordel over Barnes labyrint.

Selv om vi ikke har prøvd rotter i padling labyrinter, kan dette være mulig, selv om det kan være en fordel å gjøre vannet kaldere enn 20-25 ° C som normalt brukes i Morris labyrint. Men siden kroppen ikke ville være nedsenket i vannet dette bør ikke ha uønskede velferdseffektene.