Grunt vatten (Paddling) Varianter av test Water Maze hos möss

Summary

Möss

Abstract

När Richard Morris utarbetat sitt vatten labyrint 1981 ^7, var mest beteendemässiga arbete hos råttor. Ledde dock större förståelse av mus genetik till musen blir allt viktigare. Men forskarna fann att vissa stammar av muterade möss var benägna att problem som passivt flytande eller dykning när de testades i Morris water maze ^11. Detta var inte förvånande med tanke på den naturliga livsmiljön, råttor simma naturligt (klassiskt, den "kloak råtta"), medan möss utvecklades i de torra områdena i Centralasien.

För att övervinna dessa problem, ansågs det huruvida grunt vatten skulle vara en tillräcklig stimulans för att ge fly motivation för möss. Detta skulle också undvika problemen med torka de små varelser med en handduk och sedan sätta dem i en upphettad återhämtning kammare för att undvika hypotermi, vilket är ett mycket allvarligare problem än med råttor, det stora förhållandet mellan yta och volym av en mus gör det partikulärt sårbara för snabba värmeförluster.

En annan faktor var om en mer naturlig flykt strategi skulle kunna användas för att underlätta lärandet. Eftersom djur som faller i vattnet och simma bort från säkerheten i stranden är osannolikt att föra vidare sina gener, har djuren utvecklat en naturlig tendens att simma till kanten av en kropp i vatten. Morris water maze kräver emellertid dem att simma till en dold plattform mot mitten av labyrinten - precis motsatsen till deras utvecklats beteende. Därför paddlingen labyrinten bör omfatta fly till kanten av apparaten. Denna funktion i kombination med användningen av relativt icke-aversiv grunt vatten, förkroppsligar "förfining" aspekten av den "3 Rs" av Russell och Burch ^8.

Olika typer av mazedesign prövades, den gemensamma nämnaren var att vattnet var alltid grunt (2 cm djup) och fly var via en slang piercing genomskinliga väggen av apparaten. Andra rör ("false exits ") var också placerade runt väggarna men dessa var avstängd. Från insidan av labyrinten alla falska utgångar och den enda sanna exit såg samma. närvarande en dodecagonal (12-sidig) labyrint används i Oxford, med 12 true / false lämnar in i hörnen. I en ny utveckling en transparent paddling Y-labyrinten har testats framgångsrikt.

Introduction

Morris och Barnes Mazes

Sedan början av experimentell psykologi, har studier av animaliskt lärande förlitade sig på labyrinter, vanligen tillverkade av ogenomskinlig trä eller metall. Oundvikligen, på grund av de extraordinära lukt förmågor av gnagare, har många studier som använder dem äventyras i viss utsträckning, när försöksledaren trodde att han / hon hade lyckats lära ett djur en visuell eller ställning diskriminering, hade råttan eller musen faktiskt främst varit använder luktsinne för att lösa problemet. Detta symboliseras av kontroverser över huruvida råttor med skador i hippocampus kan utföra rumsliga uppgifter referensminnet, diskuteras i detalj under 2002 ^4. I huvudsak, David Olton och kollegor, förutom i början av arbetet med den radiella labyrinten, verkar inte alltid systematiskt roteras sina labyrinter. Detta ledde till hippocampus skadade djur lösa uppgiften, förmodligen genom lukt ledtrådar som gjorde each arm särskiljningsförmåga. Vid Oxford, var ett (naturligt) blinda mus gång observerades på en sex-arm radiell labyrint. Det lämnade sin start arm och vände rätt. Sen korsade centrum och valde motsatt arm. Efteråt föll i en stereotyp strategi att alltid stänga rätt, men när det åter stött på basen av den första armen den hade skrivit, det tog en momentan nosa på det (~ 0,2 sek) och sedan förkastade den och flyttas till nästa arm. Om luktsinnet uppgifter om ett enda besök kunde komma ihåg, är det klart att testa under upprepade försök på en statisk labyrint med samma arm alltid agnade skulle leda till starka lukt associationer med belöningen, och lärande skulle lätt uppstå även om skadan hindrade varje rent spatial inlärning.

Problem som dessa var den stimulans för Morris att utveckla sitt vatten labyrint ^7, vattnet skulle inte ge konstant lokaliserade luktsinnet ledtrådar.

Den plaskdamm är i huvudsak en hybrid mellan de traditionellationella vatten labyrint designad av Morris ⁷ och torra Barnes ¹ labyrint. I Morris water maze, djuret simmar på djupt vatten, fly från vilket det grunda vattnet täcker en något nedsänkt plattform belägen mot labyrinten centrum. I Barnes labyrint, är djuret placeras på en (torr) cirkulär plattform med utgångshål runt periferin, av vilka endast en ger flykt till en låda som är placerad under.

Användningen av paddling som en flykt motivator uppstod problem rapporterats när oproportionerligt antal av vissa stammar av transgena möss inte simma ordentligt i Morris labyrinten. De dök endera eller passivt flöt ^11. Eftersom detta kan vara ett stressrelaterad respons, visade det motiverat att reducera vattnet till paddling djup kan räcka att övervinna detta problem, vilket faktiskt det gjorde. Det bestämdes också att medge flykt till en torrt rör ligger i sidan av anordningen, snarare än till grunt vatten omfattar en plattform. Dettaskulle vara en mer "naturlig" flyktrespons, och öka den rumsliga delen av testet, eftersom en del av den initiala lärandet i Morris labyrinten är processuella, djuren måste först övervinna sitt medfödda tendens att simma längs väggarna i labyrinten innan spatial inlärning kan börja.

Den Barnes labyrinten också kan drabbas av djur som inte är tillräckligt motiverade att undkomma cirkulärplattform ^10,11.

Protocol

Ett. The Oxford plaskdammar

Den plaskdamm har skett enligt tre på varandra följande mönster, Mk 1-3. Alla anställa grunt (2 cm) vatten i en vit (för att förbättra sin motvilja) bas, som är omgiven av genomskinliga väggar av plexiglas eller klar akrylplast. Dessa har true / false exits som anges i dem. De falska utgångar är tilltäppt av svartmålade träplugg, medan den sanna utgången är öppen och gick till ett svart plaströr som kan avlägsnas med musen inuti. Musen är därefter snabbt och atraumatiskt återvände till sitt hem bur medan inuti röret. Efter den första publiceringen av plaskdamm, rapporterades det att återvända till buren var också en effektiv drivkraft för att lära sig Lashley III labyrint ^2.

En vatten temperatur på 20-25 ° C används. 20-21 ° C är perfekt, det har noterats att vissa möss verkar mindre motiverade vid högre temperaturer.

innehåll "> Den första labyrint ⁵ var rund. Men ibland möss (särskilt de med skador på hippocampus) verkar inte märka det öppna utloppsröret. en åttakantig konstruktion, med utgång rören placerade i hörnen så att attrahera uppmärksamhet av mössen, kraftigt förbättras detta problem. Däremot skulle felfrekvensen på chans prestanda vara 4/trial, i motsats till 6/trial med den 12-röret rund design. därför ett dodecagonal pool används nu med 11 falskt och 1 sann exit som fastställts i de vinklar som gjorts av korsningar av väggarna.

1.1. Evolution och egenskaper plaskdammar

Mk 1: en rund pool 85 cm i diameter med 12 true / false utgångar (figur 1).

Mk 2: en åttakantig pool 86 cm i diameter med 8 true / false exits som i hörnen.

Mk 3: a dodecagonal (12 sided) pool 120 cm i diameter med 12 true / false exit fastställs i majsers (Figur 4).

I alla ovanstående (och paddling Y-labyrinten, se nedan) att avsluta rören var 40 mm diameter. Däremot var det ibland känns att mössen var ovilliga att skriva dessa, och kontroll prestanda i Y-labyrinten skulle ibland dopp efter de hade svarar väl. Därför, och med tanke på hur lätt de kom in i grävande apparaten (se JOVE publikation "Bedöma gräva, bygga bo byggande och hamstring i möss"), också att exit hål i Barnes labyrinten är 50 mm i diameter, ansågs det om 40 mm var för liten. Ett test utfördes i hemmet buren av sex C57BL / 6 möss. (De verkar mer redo att gå in 40 mm rör i buren som förmodligen stressen är lägre här än i en apparat, så gör testet i buren skulle minimera skillnaderna i posten om de mindre rören var något aversive, vilket gör testa mer konservativ). Två 40 mm rör och två 50 mm provrör placerades på golvet i enalternerande mönster. Som förutspått, det fanns fler poster i 50 mm rör (28 inlägg) än 40 mm (9 inlägg). Därför pilottester planeras på en ny Y-labyrint med 50 tuber mm utgången, om detta lyckas de gamla 40 mm rör på dodecagonal pool och paddling Y-labyrinten kommer att ersättas med nya 50 mm och kära.

Som plaskdamm, paddling Y-labyrinten och spatial nyhet Y-labyrinten är alla spatiala test, att förlita sig på rummet ledtrådar som musen ser genom de transparenta väggarna i apparaten, bör rummet vara väl inredda med distinkta signaler (t.ex. hyllor, skåp, svart plast formar på väggarna).

2. Köra plaskdamm

1. Placera en mus i mitten av poolen inför ett av fyra lägen på omkretsen (9, 12 eller 03:00 om flykten röret är klockan 6). Placering är semi-random, maximalt tre försök i rad kan vara i samma riktning. Detta kan vara svårt att uppnå i praktiken, för somlärande fortsätter mössen tenderar att orientera sig mot rätt exit när de sänks ned i poolen i svansen. Om de gör detta starkt inget försök bör göras för att tvinga in dem i den planerade positionen, eftersom de helt enkelt demonstrerar lärande.
2. Släpp dem när de är precis ovanför vattnet, som då de hoppar in och omedelbart veta att de inte längre hålls. Långsamt släpper dem resulterar i dem som kämpar för att befria sig själva och detta kan försämra inledande orientering. Detta gäller även för paddling Y-labyrinten.
3. Maximal rättegång längd är 60 sek. Om musen inte fly då, manuellt styra det till utgången med hjälp av ett par tydliga Perspex paddlar, varje mätning ca 30 x 20 cm. De åtgärder som vidtas är det dags att hitta utgången (definition: alla huvudet i röret) och fel. Fel definierades som kom inom en huvudets längd från ett rör (inklusive verkliga exit). Passerar nära den verkliga exit, utan inträde, uppträder i allmänhet infrequently efter de första försöken. Även ett fall kan göras att detta är ett problem, är en alternativ syn att möss nedsatt i spatial kognition göra detta eftersom de inte vet att det finns en utgång runt där. Kontroller vet, och därför att undersöka närmare. Ett tak på 11 fel / rättegång läggs på antalet fel i analysen, för att förhindra för mycket skeva av uppgifterna. Detta skulle motverka ett underskott som finns i rumsligt nedsatt möss, dvs det är en konservativ åtgärd. Möss som inte nå utgången inom 60 sek tilldelas en poäng på 11 fel för denna rättegång. Så 60 sek tider har alltid 11 fel.

Tre. Den Paddling Y-maze

För att förenkla plaskdamm förfarandet och apparaten beslöt man att experimentera med en Y-labyrint, drivs enligt samma principer som de plaskdammar. Apparaten består av tre armar av genomsynligt polystyren eller Perspex, vardera 30x 8 x 20 cm. Detta är monterat på en vit bas (Figur 7). White var vald för att maximera motvilja av golvet färg och så uppmuntra flykt från grunda (2 cm djup). Som i vattnet labyrint, det finns bara en sann utgång, med de andra två armar slutar i falska utgångar som ser likadana ut från insidan labyrinten (Figur 8).

Köra paddling Y-maze

Placera en mus i slutet av en av de slutna armarna, som är vänd bort från centrum. Sekvensen av vapen som valts som startposition definieras av en semi-slumpmässig sekvens; högst tre på varandra följande försök med samma position, och lika många av de vänstra eller högra armen. Varje försök varar 60 sek. Om musen inte att avsluta (hela huvudet i utloppsröret) inom denna tid uppmuntra den att gå in i armen med hjälp av en bit genomskinlig Perspex. Utgången armens bas är blockerad av Perspex och musen fick finner utgången genom sig själv, dettabör uppmuntra bättre lärande än att driva det rätt in i röret. Men detta kan behöva tillgripas om musen är ovilliga att gå in i röret efter 15 sek. Vidta åtgärder av den totala tiden för att avsluta och antal fel (hela kroppen utom svansen in en blind arm).

Scoring paddlingen Y-maze

Det finns två definitioner av en korrekt rättegång: dels en där musen finner avfarten i <60 sek och gör inga anmälningar till blinda armar, med fel som gjorde om blinda armar upp och / eller om avfarten inte hittas inom 60 sek. Denna analys confounds misslyckanden att börja röra sig med fel i arm poster. Vidare kan en rättegång analys som betonar kognitiv förmåga utföras genom undantag, för varje mus, alla prövningar där musen inte lämna startarmen inom 60 sek, (dvs radera alla 0 +60 poäng) och sedan beräkna% korrekt av återstående försök.

4. Två typer av Y-labyrintKombinerad

Ett. Apparat

När man bygger en paddling Y-labyrint, är det lämpligt att införliva två dörrarna så att det kan drivas som en (torr) spatial nyhet minne experiment ⁶ (Figur 13). En transparent giljotindörr täcker utgångshålet i ändväggen på avfarten arm, medan en ogenomskinlig giljotindörr kan infogas för att täta av en arm från de andra två under provtagning fasen av testet. Det är viktigt att löparna för dessa dörrar är inte inom räckhåll för möss, eftersom de annars kan avleda deras uppmärksamhet eftersom de verkar potentiella utrymningsvägar. Helst bör sträcka 7 cm ner från toppen av labyrinten väggen.

2. Set-up

Placera en tunn (0,5 cm) lager av träflis strö på golvet av Y-labyrinten. Detta omfördelas mellan de två testfaser för enskilda möss, och mellan möss. För bästa praxis, för att göra luktsinnet miljön more likartad för de första kontra efterföljande möss, placera en eller två icke-experimentella möss i labyrinten för ett par minuter innan försöket inleds.

Tre. Procedur

Med exit armen blockerat av det ogenomskinliga dörren och dess utgångshål blockeras av transparent dörr, placera musen i början armen (en av de två icke-exit armar av labyrinten) och låt den utforska för 5 min. Ta sedan bort det, höja ogenomskinlig dörren för att tillåta åtkomst till alla tre armar, byt ut den i början armen och observera det i 2 min. Notera antalet poster och tid i varje arm. Kontroll möss bör komma ihåg att de två första armarna, och spendera mer tid i tidigare otillgängliga armen.

Representative Results

Hippocampus skador försämrar kraftigt lärande i plaskdamm ^5. Använda en paddling Y-labyrint, har en åldersberoende underskott visats i 10 och 14, men inte 3 månader gammal Tg2576 möss (en modell av amyloid överuttryck). Åldrad (21 månader) styrningmöss utförs också dåligt ^3. En rumslig nyhet minne experiment körs i torra Y-labyrinten visade försämringar i möss med knockout av glutamat receptor-A (GluR-A) AMPA receptorsubenheter ^9.

Figur 1. En mus i den cirkulära Mk 1 plaskdamm.

Figur 2. Musen hittar utloppsröret i plaskdamm.

Figur 3 "src =" / files/ftp_upload/2608/2608fig3.jpg "/>
Figur 3. Musen tränger ut i utloppsröret. Röret införs därefter loss från labyrinten och musen återvände till sin hembur.

Figur 4. En mus i dodecagonal plaskdamm.

Figur 5. En mus på väg att begå ett fel som det närmar sig en falsk exit.

Figur 6. Ett fel begås som musens nos kommer inom ett huvud avstånd av en falsk exit. Den verkliga exit är till sin rätt, med bifogad utloppsröret.

Figur 7. En paddling Y-labyrinten.

Figur 8. Detalj av exit armänden av Y-labyrinten. Ett grunt U-formade tråget gränsar utgångshålet i ändväggen. Detta stöder utloppsröret, som visas under stödet i bilden ovan. Avledningsröret kan avlägsnas från bäraren för att ta musen tillbaka till sin hembur. Alla armar är försedda med denna set-up, men bara en arm gavel har ett cirkulärt hål snitt i den för att tillåta utrymning.

Figur 9. En mus i en återvändsgränd av paddling Y-labyrinten.

Figur 10. Musen finner utloppsröret.

Figur 11. En mus, har rymt från paddling Y-labyrinten, väntar på att återlämnas till sitt hem bur.

Figur 12. Möss kan i allmänhet åberopas för att stanna i röret medan de transporteras tillbaka till sin närbelägna bostad bur.

Figur 13. Kombinera en paddling Y-labyrint med en rumslig nyhet Y-maze-konfiguration. En opak giljotindörr är infogat i en bild vid den proximala änden av en arm, och en transparent giljotindörrtätningarna utanför utgångshålet.

Discussion

Sammanfattningsvis framgår paddla en allmänt effektiv drivkraft för möss, och undviker stress i samband med djupa vatten simmar. Till skillnad från den väglängd och fly åtgärder tid i Morris water maze, förblev felprocenten i plaskdamm för hippocampus skadade möss konstant under hela träningsperioden ^5, så detta är ett renodlat mått på rumsliga minnet, i motsats till flykten tid eller sökväg längd, vilket både minskar som mössen bekantar sig med de icke-rumsliga delar av sitt uppdrag. Felen Åtgärden ger också en större omfattning skillnaden mellan osäkra (t.ex. hippocampus skadade) möss och kontroller.

I den ursprungliga publiceringen, var sond tester för att kontrollera om mössen verkligen använder ledljud ^5. I Probe 1, var labyrinten vridas 120 ° men den geografiska placeringen av flykt röret var samma som i utbildning. Prestanda i stort sett oförändrad. I Probe 2, liknar den vanliga utrotning testet i Morris labyrinten var utloppsröret blockerad. Tiden i utbildning kvadranten av labyrinten, där utloppsröret fanns tidigare, var 50% för kontroll möss, 25% för möss med hippocampus skador. I en tredje sond test i vilken position utloppsröret ändrades, tillbringade kontrollerna igen mer tid i den ursprungliga utbildningen kvadranten. Dessa sond tester bekräftade att mössen inte använde intramaze ledtrådar men var vägledas av ledljud i laboratoriet utanför labyrinten. Denna brist på inflytande på intramaze ledtrådar sätter plaskdamm en fördel över Barnes labyrinten.

Även om vi inte har försökt råttor i paddling labyrinter, kan detta vara möjligt, även om det kan vara en fördel att göra vattnet kallare än 20-25 ° C används normalt i Morris labyrinten. Men eftersom deras kroppar inte skulle sänkas ned i vattnet bör detta inte ha negativa välfärdseffekter.