Água (Palmatória) Variantes de água rasa testes de labirinto em ratos

Summary

Ratos

Abstract

Quando Richard Morris concebeu seu labirinto de água de ⁷ em 1981, a maior parte do trabalho comportamental foi feito em ratos. No entanto, a maior compreensão da genética do rato levou à rato tornando cada vez mais importante. Mas os pesquisadores descobriram que algumas linhagens de camundongos mutantes eram propensos a problemas como passivamente flutuante ou mergulho quando eles foram testados no labirinto de água Morris ^11. Este foi surpreendente considerando seu habitat natural; ratos nadar naturalmente (classicamente, o "rato de esgoto"), enquanto que camundongos evoluíram nas áreas secas da Ásia central.

Para superar estes problemas, foi examinado se as águas rasas seria um estímulo suficiente para proporcionar uma evacuação motivação para ratinhos. Isto também evitar os problemas de secagem das pequenas criaturas com uma toalha e, em seguida, colocá-los em uma câmara de recuperação para evitar a hipotermia aquecida, o que é um problema muito mais grave do que com os ratos, a grande proporção de área de superfície para volume de um rato torna que particular vulneráveis ​​à perda de calor rápida.

Outra consideração é se a estratégia de fuga mais natural pode ser utilizado para facilitar a aprendizagem. Uma vez que os animais que caem na água e nadar para longe da segurança da praia são susceptíveis de transmitir seus genes, os animais evoluíram uma tendência natural para nadar para a borda de um corpo de água. O labirinto de água de Morris, no entanto, requer a nadar até uma plataforma escondida na direcção do centro do labirinto - exactamente oposto ao comportamento evoluiu. Por conseguinte, o labirinto tanque deve incorporar fuga para a borda do aparelho. Esse recurso, juntamente com o uso de água relativamente não-aversivo rasa, incorpora o aspecto de "refinamento" dos "3 Rs" de Russell e Burch ^8.

Vários tipos de cartão labirinto foram provados; característica comum é que a água estava sempre raso (2 cm de profundidade) e a fuga era através de um tubo de perfuração da parede transparente do aparelho. Outros tubos ("falsa saídas ") também foram colocados em torno das paredes, mas estes foram bloqueadas. partir do interior do labirinto todos os falsos saídas e o único verdadeiro saída parecia igual. Actualmente dodecagonal um labirinto (12 lados) está em uso em Oxford, com 12 verdadeiro / falso sai definir nos cantos. Em um recente desenvolvimento de um remar Y-maze transparente foi testado com sucesso.

Introduction

Os Morris e Barnes Mazes

Desde os primórdios da psicologia experimental, estudos de aprendizagem animal confiaram pesadamente em labirintos, geralmente construído de madeira opaca ou metal. Inevitavelmente, devido às habilidades olfativas extraordinários de roedores, muitos estudos utilizando-los foram comprometidos de alguma forma, quando o experimentador se que ele / ela tinha conseguido ensinar um animal a discriminação visual ou posição, o rato ou o rato tinha de fato sido principalmente usando olfacto para resolver o problema. Este é sintetizado pela controvérsia sobre se os ratos com lesões no hipocampo podem executar tarefas de memória de referência espacial, discutidos em detalhes em 2002 ^4. Essencialmente, David Olton e colegas, para além do início do trabalho com o labirinto radial, não parecem ter sempre rodado sistematicamente os labirintos. Isto levou ao hipocampo animais lesionados resolver a tarefa, presumivelmente através de pistas de odor e que fezach braço distintivo. Em Oxford, a (naturalmente) rato cego já foi observado em um labirinto radial de seis braço. Ele deixou seu braço de início e virou à direita. Em seguida, ele atravessou o centro e escolheu o braço oposto. Posteriormente, caiu em uma estratégia estereotipada de sempre virar à direita, mas quando se re-encontrou a base do primeiro braço que tinha entrado, demorou um momentâneo cheirar ele (~ 0,2 seg), então rejeitou e mudou-se para o próximo braço. Se a informação olfativa numa única visita pode ser lembrado, é claro que durante o teste de tentativas repetidas sobre um labirinto estático com o mesmo braço sempre iscado conduziria a uma associação forte com a recompensa olfactivos, e aprendizagem seria facilmente ocorrer mesmo se a lesão impedido qualquer puramente aprendizagem espacial.

Problemas como esses foram o estímulo para Morris a desenvolver o seu labirinto de água ^7, a água não iria fornecer pistas olfativas localizadas constantes.

O tanque é essencialmente um híbrido entre a tradiçãolabirinto aquático internacional desenhado por Morris ⁷ e seco Barnes ^um labirinto. No labirinto de água de Morris, os banhos dos animais em águas profundas, a fuga a partir do qual a água é rasa cobrindo uma plataforma submersa localizada ligeiramente no sentido do centro do labirinto. No labirinto Barnes, o animal é colocado sobre uma plataforma circular (seco) com orifícios de saída em torno da periferia, dos quais apenas um de escape oferece a uma caixa colocada por baixo.

O uso de remar como uma fuga motivador surgiu de problemas relatados ao número desproporcional de algumas linhagens de camundongos transgênicos não conseguiu nadar corretamente no labirinto de Morris. Eles nem mergulhou ou passivamente flutuava ^11. Uma vez que esta pode representar uma resposta ao estresse relacionado, foi fundamentado que a redução da água a uma profundidade rasa pode ser suficiente para superar este problema, o que de fato aconteceu. Decidiu-se também para permitir o escape de um tubo seco fixado no lado do aparelho, em vez de à água superficial que cobre uma plataforma. EsteSeria uma resposta de fuga mais "natural", e aumentar a componente espacial do teste, uma vez que uma grande parte do aprendizado inicial no labirinto Morris é processual, os animais devem primeiro superar sua tendência inata para nadar ao longo das paredes do labirinto antes aprendizagem espacial pode começar.

O labirinto Barnes também podem sofrer de animais não estão sendo suficientemente motivados para escapar da plataforma circular ^10,11.

Protocol

1. As piscinas infantis Oxford

A piscina infantil tem sido feita de acordo com três projetos sucessivos, Mc 1-3. Todos empregar (2 cm) de água superficial contida em uma base branca (para aumentar a sua aversão), que é rodeado por paredes de Perspex transparente feito de plástico ou de acrílico transparente. Estes têm de verdadeiro / falso sai definidos neles. Os falsos saídas são ocluídas por negros cavilhas de madeira pintados, ao passo que a verdadeira saída está aberta e juntou-se a um tubo de plástico preto, que podem ser removidos com o rato no interior. O mouse é, então, de forma rápida e atraumaticamente retornou à sua gaiola, enquanto no interior do tubo. Depois da primeira publicação do tanque, foi relatado que o retorno para a gaiola casa também era um motivador eficaz para a aprendizagem do labirinto Lashley III ^2.

A temperatura da água de 20-25 ° C, é utilizado. 20-21 ° C é ideal, tem sido observado que alguns ratos parecem menos motivados a temperaturas mais elevadas.

conteúdo "> A primeira labirinto ⁵ era circular. No entanto, por vezes, ratinhos (particularmente aqueles com lesões no hipocampo) parece não notar o tubo de saída aberta. Um desenho octogonal, com os tubos de saída colocados nos cantos, de modo a atrair o atenção dos ratinhos, melhorou grandemente este problema. No entanto, a taxa de erro no desempenho possibilidade seria 4/trial, em oposição a 6/trial com o desenho circular 12 de tubo. Portanto, um pool de dodecagonal é agora utilizada com 11 e um falso verdadeira saída definido nos ângulos feitos pelos cruzamentos das paredes.

1.1. Evolução e características das piscinas infantis

Mc 1, uma piscina circular 85 centímetros de diâmetro, com 12 verdadeiro / falso saídas (Figura 1).

Mc 2, uma piscina octogonal 86 centímetros de diâmetro, com oito verdadeiro / falso saídas definidas nos cantos.

Mc 3, um (12 lados) piscina dodecagonal 120 centímetros de diâmetro, com 12 true / false exit definido no milhores (Figura 4).

Em todos os itens acima (ea remar Y-maze, veja abaixo) os tubos de saída foram 40 mm de diâmetro. No entanto, foi detectada ocasionalmente, que os ratinhos foram relutantes em introduzir estes, e o desempenho do controlo no labirinto Y-se, por vezes, depois de mergulhar que tinham reagido bem. Assim, e considerando quão prontamente eles entraram no aparelho buraqueira (ver publicação JOVE "Avaliando construção de galerias, construção do ninho e acumulação em ratos"), ainda que os orifícios de saída no labirinto Barnes são 50 mm de diâmetro, foi considerado se 40 milímetros era muito pequeno. Um teste foi realizado na gaiola de seis ratinhos C57BL / 6. (Parecem mais pronto para entrar em 40 tubos de milímetro a gaiola de origem presumivelmente como o stress é menor do que em uma parte do aparelho, de modo a fazer o teste da gaiola de origem iria minimizar as diferenças de entrada se os tubos foram ligeiramente menores aversivo, tornando o testar mais conservador). Dois tubos de 40 milímetros e dois tubos de 50 mm foram colocados no chão em umpadrão alternado. Como previsto, houve mais entradas para tubos de 50 mm (28 entradas) de 40 mm (nove entradas). Portanto, testes piloto são planejadas em um novo Y-labirinto com tubos de saída de 50 milímetros, se esta for bem sucedida dos antigos tubos de 40 milímetros na piscina dodecagonal e remar Y-maze serão substituídos por novos 50 milímetros queridos.

Como a piscina infantil, remando Y-maze e novidade Y-maze espacial são todos os testes espaciais, contando com a sala de pistas que o mouse enxerga através das paredes transparentes do aparelho, o quarto deve ser bem decorado com sinais distintos (por exemplo, prateleiras, Os armários, as formas de plástico preto nas paredes).

2. Executando a Piscina Infantil

1. Coloque um rato no centro da piscina de frente para um dos quatro posições no perímetro (9, 12 ou 3:00 se o tubo de escape é de 6 horas). A colocação é semi-aleatórios, um máximo de três tentativas consecutivas pode ser na mesma direcção. Isto pode ser difícil de alcançar na prática, porque, comoaprendizado prossegue os ratos tendem a orientar-se para a saída correta, como eles são rebaixados para a piscina pela cauda. Se fizerem isso, também deve ser feita nenhuma tentativa de forçá-los na posição planejada, uma vez que são simplesmente demonstrando aprendizado.
2. Liberá-los quando eles estão um pouco acima da água, como então eles caem e instantaneamente saber que eles não estão mais sendo realizada. Lentamente, liberando-os resultados neles lutando para libertar-se e isso pode prejudicar a orientação inicial. Isto também se aplica a remar Y-maze.
3. Comprimento máximo de julgamento é de 60 segundos. Se o mouse não consegue escapar até então, guiá-lo manualmente para a saída usando um par de remos perspex claro, cada uma medindo cerca de 30 x 20 cm. As medidas tomadas são o tempo para encontrar a saída (definição: toda a cabeça dentro do tubo) e erros. Erros foram definidos como vem dentro do comprimento de uma cabeça de um tubo (incluindo o real saída). Passando por perto a verdadeira saída, sem entrada, geralmente ocorre infrequently após os primeiros ensaios. Apesar de um caso pode ser feito que este é um problema, uma visão alternativa é que os ratos com deficiência na cognição espacial fazer isso, porque eles não sabem que há uma saída por aí. Controles sei, e, portanto, investigar mais detalhadamente. Um limite máximo de 11 ensaios / erros é imposto sobre o número de erros na análise, para impedir que muita inclinação dos dados. Isso mitigar contra um déficit, sendo encontrado em camundongos espacialmente com deficiência, ou seja, é uma medida conservadora. Ratos que não conseguem alcançar a saída dentro de 60 segundos são atribuídos uma pontuação de 11 erros para que julgamento. Então, 60 seg vezes sempre tem 11 erros.

3. O Y-maze Palmatória

Para simplificar o procedimento piscina infantil e do aparelho foi decidido a experimentar com a Y-maze, operado de acordo com os mesmos princípios que as piscinas infantis. O aparelho é constituído por três braços de poliestireno ou de perspex transparente, a cada 30x 8 x 20 cm. Esta é montada sobre uma base branca (Figura 7). O branco foi escolhido para maximizar a aversão a cor de chão e assim encorajar a fuga do raso (2 cm de profundidade). Como no labirinto da água, existe apenas uma verdadeira saída, com os outros dois braços, que encerra em falsas saídas têm a mesma aparência que a partir do interior do labirinto (Figura 8).

Executando a remar Y-maze

Coloque um rato, no final de um dos braços fechados, de costas para o centro. A sequência de braços escolhido como a posição de partida é definida por uma sequência de semi-aleatórios, não mais do que três tentativas consecutivas com a mesma posição, e um número igual de os braços esquerdo e direito. Cada prova tem a duração de 60 segundos. Se o rato não consegue sair (cabeça inteira no tubo de saída) dentro deste tempo incentivar a entrar no braço com o auxílio de uma peça de perspex transparente. A base do braço de saída está bloqueada pelo perspex e permitiu o rato para a saída encontra por si só, istodeve incentivar a aprendizagem melhor do que empurrá-lo para a direita no tubo. Mas isso pode ser necessário recorrer a se o rato é relutante para entrar no tubo depois de 15 seg. Tomar medidas do tempo total para sair eo número de erros (corpo inteiro sem cauda entra em um braço blind).

Marcando a remar Y-maze

Existem duas definições de um ensaio correcto: em primeiro lugar, uma em que o rato encontra a saída em <60 seg e não faz entradas nos braços cegos, com erros ser marcado, se os braços cegos são inseridos e / ou se a saída não se encontra dentro de 60 seg. Esta análise confunde falhas para começar a mover-se com erros de entradas nos braços. Em segundo lugar, uma análise experimental que enfatiza a capacidade cognitiva pode ser realizada através da exclusão, para cada rato, todos os ensaios em que o rato não deixou o braço de início dentro de 60 segundos (ou seja, excluir todos os 0 60 pontos), em seguida, calcular a% de acerto da restantes ensaios.

4. Dois tipos de Y-mazeCombinado

1. Aparelho

Ao construir um tanque Y-maze, é útil para incorporar duas portas para permitir que ele seja executado como um (a seco) espacial novidade experimento memória ⁶ (Figura 13). Uma porta de guilhotina transparente cobre o orifício de saída na parede de extremidade do braço de saída, enquanto uma porta de guilhotina opaco pode ser inserido para vedar de um braço do outro dois durante a fase de recolha de amostras do ensaio. É importante que os corredores para essas portas não estão ao alcance dos ratos, caso contrário, eles podem desviar sua atenção, porque eles parecem possíveis rotas de fuga. Idealmente devem estender 7 centímetros para baixo a partir do topo da parede do labirinto.

2. Set-up

Coloque um (0.5 cm) de camada fina de madeira de material de cama de chip no chão do Y-maze. Este é redistribuído entre as duas fases de teste para os ratos individuais, e entre ratos. Para as melhores práticas, para tornar o ambiente olfativo more semelhante para os primeiros contra subseqüente ratos, colocar um ou dois ratos não-experimentais no labirinto por alguns minutos antes do experimento começa.

3. Procedimento

Com o braço de saída bloqueada pela porta opaca e seu orifício de saída bloqueado pela porta transparente, colocar o rato no braço de início (um dos dois braços não-saída do labirinto) e permitir que ele explore durante 5 min. Em seguida, removê-lo, levantar a porta opaco para permitir o acesso a todos os três braços, substituí-lo no braço do início e observá-lo durante 2 min. Observe que o número de entradas e o tempo despendido em cada braço. Camundongos de controle deve se lembrar que os primeiros dois braços, e passar mais tempo no braço anteriormente inacessíveis.

Representative Results

As lesões do hipocampo prejudicar grandemente a aprendizagem no tanque ^5. Usando um Y-maze remo, um défice dependente da idade foi demonstrada em 10 e 14, mas não a 3 meses de idade (ratinhos Tg2576 um modelo de amilóide a sobre-expressão). Idade (21 meses) ratos controle também se apresentou mal ^3. Um experimento de memória novidade espacial correr no seco Y-maze revelou deficiências em camundongos com knockout do glutamato (GluR-A) subunidades dos receptores AMPA-A ^9.

Figura 1. Um rato no Mc 1 tanque circular.

Figura 2. O rato encontra o tubo de saída do tanque.

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Figura 3. Rato O escape para o tubo de saída. O tubo é então separado do labirinto e o rato devolvido à sua gaiola de origem.

Figura 4. Um rato na piscina infantil dodecagonal.

Figura 5. Um rato prestes a cometer um erro, uma vez que se aproxima de uma falsa saída.

Figura 6. Um erro é cometido, como o nariz do rato vem a uma distância de um chefe de uma falsa saída. A verdadeira saída está à sua direita, com o tubo de saída conectado.

Figura 7. Uma remar Y-maze.

Figura 8. Pormenor da extremidade do braço de saída do Y-maze. Uma calha em forma de U pouco profunda adjacente ao orifício de saída na parede de extremidade. Isto suporta o tubo de saída, mostrada abaixo do apoio na imagem acima. O tubo de saída pode ser removida do apoio para levar o rato volta à sua gaiola de origem. Todos os braços estão equipadas com uma parede de extremidade esta configuração, mas apenas o braço tem um orifício circular em corte para permitir o escape.

Figura 9. Um rato em um beco sem saída do tanque Y-maze.

Figura 10. O rato encontra o tubo de saída.

Figura 11. Um rato, depois de ter escapado do remar Y-maze, espera para ser devolvido à sua gaiola.

Figura 12. Mice geralmente pode ser invocado para ficar no tubo, enquanto eles são levados de volta para sua gaiola casa nas proximidades.

Figura 13. Combinando um Y-maze remar com uma configuração Y-maze novidade espacial. Uma porta de guilhotina opaco é inserida uma lâmina na extremidade proximal de um dos braços, e uma guilhotina transparenteselos de porta fora do orifício de saída.

Discussion

Em conclusão, parece remar um motivador geralmente eficaz para ratos, e evita o estresse associado com a natação em águas profundas. Remover o comprimento do percurso e medidas de tempo de fuga no labirinto de água de Morris, a taxa de erro no tanque para ratos lesionados hipocampo permaneceu constante durante todo o período de treino de ^5, de modo que este representa uma medida da memória espacial pura, ao contrário de se escapar do tempo ou caminho comprimento, que ambos diminuem à medida que os ratos se familiarizar com os elementos não-espaciais da tarefa. A medida erros também proporciona uma maior magnitude de diferença entre camundongos deficientes e controles (por exemplo, hipocampo lesionado).

Na publicação original, foram realizados testes de sonda para verificar se os ratos foram realmente usando pistas espaciais ^5. Na sonda 1, o labirinto foi feito rodar 120 °, mas a localização geográfica do tubo de escape permaneceu a mesma que na formação. Desempenho manteve-se praticamente inalterada. Na sonda 2, semelhante ao ensaio de extinção padrão no labirinto de Morris, o tubo de saída foi bloqueada. O tempo despendido no quadrante de treino no labirinto, onde o tubo de saída foi localizada anteriormente, foi de 50% para ratos de controlo, 25% para os ratos com lesões do hipocampo. Num terceiro ensaio de sonda em que a posição do tubo de saída foi mudado, os controles de novo passado mais tempo no quadrante de treino inicial. Estes testes com sondas confirmou que os ratos não foram utilizando pistas intramaze mas foram guiados pelas pistas espaciais no laboratório externa para o labirinto. Essa falta de influência de pistas intramaze coloca o tanque em vantagem sobre o labirinto de Barnes.

Apesar de não ter tentado ratos em labirintos remar, isso pode ser possível, embora possa ser uma vantagem para fazer a água mais fria do que a 20-25 ° C, normalmente usado no labirinto Morris. No entanto, uma vez que os seus corpos não ser imerso na água, tal não deve ter efeitos adversos de bem-estar.